3460A;
[0235]所述引物G11778A的sense为：
[0236]5'-TCAATCAGCCACATAGC-3'，
[0237]所述引物G11778A的antisense为：
[0238] 5'-GAGTTCTCCCAGTAGGTTA-3' ，
[0239]所述T14484C的sense为：
[0240] 5'-CAGGGGTTGAGGTCTTG-3' ，
[0241]所述T14484C的antisense为：
[0242] 5,-CGCCCATAATCATACAAA-3,；
[0243]所述G3460A的sense为：
[0244] 5'-CTAATGCTTACCGAACGA-3' ，
[0245]所述G3460A的antisense为：
[0246] 5'-TGATGGCTAGGGTGACTT-3' ；
[0247] 所述引物PCR扩增出目的片段模板；
[024引所述目的片段的获取包括：W上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-2化g/μ1，作为检 测阴性对照用；
[0249] 2) 25μ1反应体系检测：
[0巧0] PremixTaqPC民Masl:erMIX 12.5μ1 DMA模板 l-lOng/μΙ PrimerU 终浓度为400 ηΜ PrimerL 终浓度为400 nM 灭菌蒸傭水 Upto25μ1
[ο巧1] 混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检 测；
[0252]结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
[0巧3] 所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中94°C预变性3min，94°C变性30sec， 51°C退火30sec，72°C延伸30sec，共循环35次。。
[ο巧4] 实施例4
[Ο巧5] 样本处理：取外周血2ml于邸ΤΑ抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0巧6] DNA提取，取220μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0巧7] 1)力日220 μ 1 Buffer BL震荡混合，于70°C解育10分钟；
[0巧引2)加220μ1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0巧9] 3) 12000巧m离屯、1分钟；
[0260] 4)取上清转入收集柱中，12000巧m离屯、2分钟；
[0261] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分钟；
[026引 6) 12000巧m离屯、2分钟；
[026引7)加入 700μ1 wash Buffer,12000巧m离屯、2 分钟；
[0264] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1wash Buffer,12000巧m离屯、2分 钟；
[026引9)弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[0266] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 溫放置l-2min，12000巧m离屯、2分钟，滤液即为模板DNA;
[0267]PCR扩增
[026引 PCR反应体系：
[0269] 10XPCRBuffer2μ1；
[0270] HotStarTaq DNAPolymerase按kit标准调整；
[027。dNTPmix2";
[0272]上游引物PrimerU 1 μ1;
[0273]下游引物Primer L1 μ1 ;
[0274]DNA模板Xμ1 ;
[0275] 灭菌蒸馈水20μ1 ---上述总体积；
[0276]PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0277] PCR产物纯化
[027引每管内加入100μ1PCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000巧m离屯、2min;
[0279]弃收集管内液体，加入700 μ1 washing buffer, 12000巧m离屯、2min;
[0280]弃收集管内液体，加入400 μ1 washing buffer, 12000巧m离屯、2min;
[02引]弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[028引柱内加入30 μ 1 70°C预热洗脱液，12000巧m离屯、3min;
[0283] 测序反应
[0284]反应体系：0. 8μ1Bi曲ye+1.5ylBi曲yeSeqBuffer+3yl引物+1μ1PCR纯 化产物+3. 5μ1 (1地2〇;
[028引测序PCR热循环条件：
[0286] 1)变性的条件，96°C lOsec;
[0287] 14)退火的条件，（首先96°C lOsec，其次50°C 5sec，然后60°C 4min) X 25个循环；
[028引 15)延伸的条件，60°C 4min;
[0289] 16)4°C保溫；
[0290] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的溫度后开始计算；
[0291] 测序产物纯化
[029引10μ1反应体系，96孔板，NaAc法；
[029引1)每管加入1μ1 3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室溫放置15min;
[0294] 2) 10°C，4000巧m离屯、30min，马上倒置，1200巧m离屯、Imin;
[029引 3)每管加入100μl70%酒精，离屯、15min;5°C，3600巧m离屯、30min，马上倒置， 1200巧m离屯、Imin;
[0296] 4)室溫挥发净酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DM;
[0297] 5) 95°C变性 5min，4°C保溫 4min，加样上机；
[029引9)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[029引 PCR检测，包括：
[0300] 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔.
[0301] 在LE邸R氏基因突变位点两端设计Ξ对特异性引物；
[0302]所述引物是G11778A、T14484C和G3460A;
[0303]所述引物G11778A的sense为：
[0304] 5'-TCAATCAGCCACATAGC-3' ，
[0305]所述引物G11778A的antisense为：
[0306] 5'-GAGTTCTCCCAGTAGGTTA-3' ，
[0307]所述T14484C的sense为：
[0308] 5'-CAGGGGTTGAGGTCTTG-3' ，
[0309]所述T14484C的antisense为：
[0310] 5'-CGCCCATAATCATACAAA-3'；
[0311]所述G3460A的sense为：
[0312] 5'-CTAATGCTTACCGAACGA-3' ，
[0313]所述G3460A的antisense为：
[0314] 5' -TGATGGCTAGGGTGACTT-3'；
[031引所述引物PCR扩增出目的片段模板；
[0引引所述目的片段的获取包括：W上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-2化g/μ1，作为检 测阴性对照用；
[0317] 。25 μ 1反应体系检测：
[031引 Premix.TaqPC民Mas记γΜΙΧ 12.5μ1 DNA模板 l-IOng/μΙ PrimerU 终浓度为400 πΜ PrimerL 终浓度为400 nM 灭菌蒸馈水 邮化25μ1
[0319] 混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检 测；
[0320] 结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
[0321] 所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中94°C预变性3min，94°C变性30sec， 51°C退火30sec，72°C延伸30sec，共循环35次。。
[032引优选地，PCR缓冲液中各物质的浓度分别为10-40mM Tris cl，50-200mM氯化钟化化），0-5.01111二硫苏糖醇值1'1')，0-1.01111乙二胺四乙酸二钢巧（邸了4)，0-2.0%(￥/￥) 乙基苯基聚乙二醇（Nonidet)P-40,0-2. 0% (V/V)吐溫20灯ween20)，30-70% (v/v)甘 油（glycerol),稳定剂（st油ilizer) :pH7. 0-10. 0(20°C)。优选浓度为20mM Tris cl、 lOOmM KCUlmM DTT、0.1 mM邸TA、0. 5% (V/V)Nonidet P-40、0. 5% (V/V)Tween20、50% glycerol (v/v)，稳定剂，终抑值为9. 0。DM模板为用常规方法从患者抗凝全血中提取获 得的DNA。
[0323] 优选地，引物是单股寡脱氧核糖核巧酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用 途，但在一般在15~25个核巧酸之间，较短的引物分子通常需要较低的溫度，从而与模板 形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂 交并引发DNA合成。
[0324] 优选地，引物设计遵循原则：第一，引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异 性。第二，产物不能形成二级结构。第Ξ，引物长度一般在15~30碱基之间。第四，G+C 含量在40%~60%之间。第五，碱基要随机分布。第六，引物自身不能有连续4个碱基的 互补。第屯，引物之间不能有连续4个碱基的互补。第八，引物5'端可W修饰。第九，弓I 物3'端不可修饰。第十，引物3'端要避开密码子的第3位。引物合成采用的方法为亚憐 酷胺Ξ醋法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3'端向5'端合成的，相邻的核巧酸通过3' - 5'憐酸二醋键连接。
[032引优选地，试剂盒包括：1)序列如沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6所示的引物；2)PCR反应体系；3)分隔并集中包装运些 试剂的瓶或管W及包装盒。
[0326] 优选地，所述引物的浓度为10ymol/L。
[0327] 优选地，所述试剂盒由PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液，模板DNA，PrimerU， Primer以灭菌蒸馈水组成，各组份反应时终浓度为：
[032引 PremixTaqPC民MasterMLX 12.5μ1 DNA模板 1-lOng/μΙ PrimerU 终浓度为400 nM PrimerL 终浓度为400 πΜ 灭菌蒸馈水 Up?ο25μ!
[0329] 优选地，所述Premix Taq PCR MasterMIX缓冲液包括Tris. cl,氯化钟，硫酸锭，氯 化儀，-20°C下抑值在8. 0-9. 0之间。
[0330] 应用实施例1
[033。 取抗凝全血30例，样品由首都医科大学宣武医院提供，提取DM作为模板。使用 仪器：ABIVeritiDxPCR仪器分析，用