化、肾硬化、硬皮病）、糖尿病、伤口愈合、结缔组织疾病（例如在心脏、 血管、骨、关节、眼中，如马凡或洛伊斯-迪茨综合征）、牛皮癣、眼疾病（例如青光眼、后囊膜 混浊（PCO)(也称为继发性白内障））、CNS疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）、冠状动脉粥 样硬化（冠状动脉介入或冠状动脉旁路移植（CABG)手术）或脱发。肿瘤是例如选自：实体 瘤、血源性肿瘤、白血病、转移瘤、血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、化脓性肉芽肿、星形 细胞瘤如间变型星形细胞瘤、听神经瘤、胚细胞瘤、尤因瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、成神经管 细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成血管细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、成神经管细胞瘤、白血 病、黑素瘤如原发性和/或转移性黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤、非 霍奇金淋巴瘤、松果体瘤、成视网膜细胞瘤、肉瘤、精原细胞瘤、沙眼、维尔姆斯瘤、胆管癌、 膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、支气管癌、肾癌、宫颈癌、脉络膜癌、绒毛膜癌、囊腺癌、胚胎性癌、 上皮癌、食道癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胆囊癌、胃癌、头癌、肝癌、肺癌、髓 样癌、颈癌、非小细胞支气管/肺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、前列腺癌、小 肠癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌（RCC，例如透明细胞RCC、乳头状RCC、难染性RCC)、大嗜 酸粒细胞肾癌、移行细胞肾癌、成视网膜细胞瘤、皮肤癌、小细胞支气管/肺癌、鳞状细胞 癌、皮脂腺癌、睾丸癌和子宫癌。本发明的寡核苷酸或药物组合物不仅用于预防和/或治疗 肿瘤的方法中，还同样适用于转移癌。
[0075] 本发明的反义寡核苷酸的特征为其显示出乎意料的低毒性（参见例如表5)并因 此被不同的生物体良好耐受。这些寡核苷酸显示生物体内合理的分布，其中在肾、肝、皮肤 和脾中测得最高浓度。
[0076] 本发明提供了多种寡核苷酸，由于寡核苷酸序列的特异性选择和核苷酸的修饰， 其高度有效地分别减少和抑制TGF-β (特别是TGF-β 1、TGF-β 2和/或TGF-β 3)表达。 下文表1显示多种优选的本发明所述修饰的寡核苷酸（修饰的核苷以粗体显示）。各寡核 苷酸定义为ASPH和一个数字，其由特定的核苷序列和修饰定义：
[0077]
[0087] 表1显示选定的本发明的寡核苷酸的核酸序列以及核苷酸的修饰，其中，LNA 4+4 表示寡核苷酸5'和3'端的4x LNA是经修饰的，LNA 4+3表示寡核苷酸5'端的4x LNA 和3'端的3x LNA是经修饰的，LNA 3+4表示寡核苷酸5'端的3x LNA和3'端的4x LNA 是经修饰的，LNA 3+3表示寡核苷酸5'和3'端的3x LNA是经修饰的，LNA 3+2表示寡 核苷酸5'端的3x LNA和3'端的2x LNA是经修饰的，LNA 2+3表示寡核苷酸5'端的2x LNA和3'端的3x LNA是经修饰的，LNA 2+2表示寡核苷酸5'和3'端的2x LNA是经修饰 的。或者，一些寡核苷酸包含ENA 4+4 (即寡核苷酸5'和3'端的4x ENA是经修饰的）或 ENA 3+3 (即寡核苷酸5'和3'端的3x ENA是经修饰的）。其他寡核苷酸包含2' 0-甲基 4+4(其中，该寡核苷酸包含寡核苷酸5'和3'端的4x 2' 0-甲基修饰的核苷酸）或包含2' 氟4+4 (其中，该寡核苷酸包含寡核苷酸5'和3'端的4x 2'氟修饰的核苷酸）。包含LNA 3+TEG的寡核苷酸在该寡核苷酸的5'端包含3x LNA且在3'端包含一个三甘醇（TEG)。 一些寡核苷酸包含LNA，其不是排列为一行而是由未锁定的核苷隔开，其具有例如以下序 列：3LNA+9N+1LNA+1N+2LNA、1LNA+1N+2LNA+8N+1LNA+1N+1LNA、2LNA+8N+2LNA+1N+1LNA、 2LNA + 9N+1LNA+1N+1LNA、2LNA + 8N+1LNA + 2N+1LNA、3LNA + 8N+ILNA+IN+ILNA、 3LNA+8N+1LNA+1N+1LNA、2LNA+9N+1LNA+1N+1LNA 或 2LNA+8N+2LNA+1N+1LNA，其中 "N" 是不 含锁定修饰的核苷。"ASPH"和一个数字指表1描述的不同寡核苷酸及其不同修饰。这些修 饰的寡核苷酸在例如下文实施例中所示实验中测试。本发明的反义寡核苷酸可以不同方式 描述，例如 ASPH47、ASPH0047、ASPH_47 或 ASPH_0047 指同一寡核苷酸。
[0088] 出于清楚和简洁的目的，各特征在本发明中被描述为相同或单独的实施方式的一 部分，然而，应理解本发明的范围可包括具有所有或一些所述特征的组合的实施方式。
[0089] 以下实施例将用于进一步说明本发明，然而同时，并不对本发明构成任何限制。相 反地，应清楚地立即，本发明的范围涉及多种其他实施方式、其修改形式和等价形式，其在 本领域技术人员阅读本发明后能够对其做出启示而不背离本发明的精神。 实施例
[0090] 在以下实施例中，对表1中列举的寡核苷酸的效果进行了测试，其分别基于 TGF- β 1 和 / 或 TGF- β 2 表达的降低和抑制。SEQ ID Nd 144 (T-LNA: CGGCATGTCTATTTTGTA， 其中 5' 和 3' 端的 3x 核苷酸是 LNA)和 SEQ ID NO. 145(scr-LNA:CGTTTAGGCTATGTACTT，其 中5'和3'端的3x核苷酸是LNA)被用作对照寡核苷酸，其中SEQ ID NO. 145 (阴性对照） 是SEQ ID NO. 144 (阳性对照）的错义形式。在转染剂（如脂质转染试剂（Lipofectamine)) 存在的情况下或不存在任何转染剂的情况下（其定义为自主转染或无协助转染或自主递 送）对细胞进行转染。在自主递送的情况中，寡核苷酸进入细胞仅依赖于寡核苷酸与细胞 的相互作用（没有化合物/试剂支持该进入）。因此，自主转染或自主递送被认为反映了体 内环境中较好的条件。
[0091] 实施例1
[0092] 在转染剂存在的情况下，分别使用IOnM的ASPH01、ASPH02、ASPH03、ASPH04、 ASPH05、ASPH06、ASPH07、ASPH08、ASPH09、ASPHlO、ASPHlI、ASPHl2、ASPHl3、ASPH14、ASPHl5、 ASPH16、ASPHl7、ASPH18、ASPH19、ASPH20、ASPH21、ASPH22、ASPH24、ASPH25、ASPH26、ASPH27、 ASPH29、ASPH30、ASPH31、ASPH32、ASPH33、ASPH34、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH38、ASPH39、 ASPH40、ASPH41、ASPH42、ASPH43、ASPH44、ASPH45、ASPH46、ASPH47、ASPH48、ASPH49、ASPH50、 ASPH51、ASPH52、ASPH53 和 ASPH54 (参见图 3a) ;ASPH36、ASPH60、ASPH61、ASPH62、ASPH63、 ASPH64、ASPH65、ASPH66、ASPH67、ASPH68、ASPH69、ASPH70、ASPH71、ASPH72、ASPH73、ASPH74、 ASPH75、ASPH76、ASPH77、ASPH78、ASPH79、ASPH80、ASPH81、ASPH82、ASPH83、ASPH84、ASPH85、 ASPH86、ASPH87、ASPH88、ASPH89、ASPH90、ASPH91、ASPH92、ASPH93、ASPH94、ASPH95、ASPH96、 ASPH97、ASPH98、ASPH99、ASPH100、ASPH101、ASPH102、ASPH103、ASPH104、ASPH105、ASPH106、 ASPH107、ASPH108、ASPH109、ASPH110、ASPH111、ASPH112、ASPH113、ASPH114、ASPH115、 ASPHl 16、ASPHl 17、ASPHl 18 和 ASPHl 19 (参见图 3b)，或 ASPH36、ASPH71、ASPH73、ASPHl20、 ASPH121、ASPH122、ASPH123、ASPH124、ASPH125、ASPH126、ASPH127、ASPH128、ASPH129、 ASPH130、ASPH131、ASPH132、ASPH133、ASPH134、ASPH135、ASPH136、ASPH137、ASPH138、 ASPH139、ASPH140、ASPH141、ASPH142、ASPH143、ASPH145、ASPH146、ASPH147、ASPH148、 ASPH149、ASPH150、ASPH151、ASPH152、ASPH153、ASPH154、ASPH155、ASPH157、ASPH158、 ASPH160、ASPH161、ASPH162、ASPH163、ASPH164、ASPH165、ASPH166、ASPH167、ASPH168、 ASPH169、ASPH170、ASPH171、ASPH172、ASPH173、ASPH174、ASPH175、ASPH176、ASPH177、 ASPH178、ASPH179、ASPH180、ASPH181、ASPH182 和 ASPH183(参见图 3c)以及对照 SEQ ID NO. 144和145转染人A172胶质瘤细胞。在转染后24小时测定TGF- β 1和TGF- β 2 mRNA 的表达。图3a)至3c)显示了 TGF- β 1和TGF- β 2 mRNA表达的显著减低。双重TGF- β 1和 TGF-β 2 反应性寡核苷酸 ASPH01、ASPH02、ASPH03、ASPH04、ASPH05、ASPH06、ASPH07、ASPH08 和ASPH09显示TGF- β 1和TGF- β 2 mRNA表达的显著减低，而选择性TGF- β 2寡核苷酸显 著抑制TGF-β 2 mRNA的表达。
[0093] 实施例2
[0094] 在转染剂存在的情况下，分别使用IOnM的ASPH01、ASPH02、ASPH03、ASPH04、 ASPH05、ASPH06、ASPH07、ASPH08、ASPHl2、ASPH14、ASPHl7、ASPH18、ASPH20、ASPH21、ASPH22、 ASPH24、ASPH25、ASPH26、ASPH27、ASPH29、ASPH30、ASPH31、ASPH32、ASPH33、ASPH35、ASPH36、 ASPH37、ASPH38、ASPH39、ASPH40、ASPH41、ASPH42、ASPH43、ASPH44、ASPH45、ASPH46、ASPH47、 ASPH48、ASPH49、ASPH50、ASPH51 和 ASPH52 (参见图 4a) ;ASPH36、ASPH60、ASPH61、ASPH62、 ASPH63、ASPH64、ASPH65、ASPH66、ASPH67、ASPH68、ASPH69、ASPH70、ASPH71、ASPH72、ASPH73、 ASPH74、ASPH75、ASPH76、ASPH77、ASPH78、ASPH79、ASPH80、ASPH81、ASPH82、ASPH83、ASPH84、 ASPH85、ASPH86、ASPH87、ASPH88、ASPH89、ASPH90、ASPH91、ASPH92、ASPH93、ASPH94、ASPH96、 ASPH97、ASPH98、ASPH99、ASPH100、ASPH101、ASPH102、ASPH103、ASPH104、ASPH105、ASPH106、 ASPH107、ASPH108、ASPH109、ASPH110、ASPH111、ASPH112、ASPH113、ASPH114、ASPH115、 ASPHl 16、ASPHl 17、ASPHl 18 和 ASPHl 19 (参见图 4b)，或 ASPH36、ASPH71、ASPH73、ASPHl20、 ASPH121、ASPH122、ASPH127、ASPH128、ASPH129、ASPH130、ASPH131、ASPH132、ASPH133、 ASPH135、ASPH136、ASPH137、ASPH139、ASPH141、ASPH142、ASPH143、ASPH145、ASPH146、 ASPH147、ASPH149、ASPH150、ASPH151、ASPH152、ASPH153、ASPH154、ASPH155、ASPH157、 ASPH160、ASPH161、ASPH162、ASPH163、ASPH164、ASPH165、ASPH166、ASPH167、ASPH168、 ASPH169、ASPH170、ASPH171、ASPH172、ASPH173、ASPH174、ASPH175、ASPH176、ASPH177、 ASPH178、ASPH179、ASPH180、ASPH181、ASPH182 和 ASPH183(参见图 4c)以及对照 SEQ ID NO. 144和145转染人Panc-I胰腺癌细胞。在转染后24小时测定TGF- β 1和TGF- β 2 mRNA 的表达。图4a)至4c)显示了 TGF-β 1和TGF-β 2 mRNA表达的显著减低。双重TGF-β 1 和 TGF-β 2 反应性寡核苷酸 ASPH01、ASPH02、ASPH03、ASPH04、ASPH05、ASPH06、ASPH07 和 ASPH08再次显示TGF- β 1和TGF- β 2 mRNA表达的显著减低，而选择性TGF- β 2寡核苷酸显 著抑制TGF-β 2 mRNA的表达。
[0095] 实施例3
[0096] 在进一步的实验中，在人A172神经胶质瘤细胞中测试ASPH01、ASPH03、ASPH05、 ASPHl7、ASPH18、ASPH22、ASPH26、ASPH27、ASPH33、ASPH36、ASPH37、ASPH41、ASPH42、ASPH45、 ASPH46、ASPH47、ASPH48、ASPH49、ASPH64、ASPH65、ASPH66、ASPH69、ASPH71、ASPH80、ASPH82、 ASPH88、ASPH89、ASPH90、ASPH98、ASPH99、ASPH102、ASPH105、ASPHl 15、ASPH121、ASPH140、 ASPH153、ASPH165、ASPH171、ASPH178、ASPH181、ASPH184、ASPH185、ASPH186、ASPH187、 ASPH188、ASPH189和对照SEQIDNαl44和SEQIDNαl45各自的抑制作用。在转染剂 存在的情况下，分别以20nM、4nM、0. 8nM、0. 16nM、和0. 04nM的剂量使用这些修饰的寡核苷 酸转染A172细胞。在转染后24小时测量剩余的TGF- β 2 mRNA。将TGF- β 2值标准化至 GAPDH并计算导致TGF- β 2 mRNA减少50 %的寡核苷酸浓度（=IC5。值）。所有IC 5。值都 参考ASPH_036(ASPH36)的IC5。值（该值是0. 33nM)且结果显示为ASPH_036的IC5。值的倍 数差异。表2 :
[0099] 所有修饰的寡核苷酸都显示低纳摩尔至皮摩尔范围的IC5。，其显著低于阳性对照 寡核苷酸SEQ ID NO. 144的IC5Q;未计算阴性对照SEQ ID NO. 145的IC 5。。
[0100] 实施例4
[0101] 在不存在转染剂的情况下（自主转染或自主递送），分别使用3. 3 μ M的ASPHl7、 ASPH18、ASPH22、ASPH25、ASPH33、ASPH35、ASPH36、ASPH41、ASPH42、ASPH45、ASPH46、ASPH47、 ASPH48、ASPH49、ASPH65、ASPH66、ASPH67、ASPH69、ASPH71、ASPH79、ASPH80、ASPH82、ASPH88、 ASPH89、ASPH90、ASPH91、ASPH98、ASPH99、ASPH102、ASPH105、ASPH111、ASPHl 15、ASPHl 19、 ASPH121、ASPH139、ASPH140、ASPH146、ASPH151、ASPH153、ASPH165、ASPH171、ASPH172、 ASPH176、ASPH178、ASPH180 和 ASPH183 或对照 SEQ ID Nd 144 和 145 处理人 Panc-I 胰腺 癌细胞。在处理开始后72小时分别测量修饰的寡核苷酸对TGF- β 1和TGF- β 2 mRNA表达 的抑制作用。在自主递送实验条件下，这些寡核苷酸进入细胞并强烈抑制TGF- β 2mRNA的 表达。实验结果如图5所示。
[0102] 实施例5
[0103] 在进一步的实验中，在不存在转染剂的情况下（自主转染或自主递送），分别使 用 10 μΜ 的修饰的寡核苷酸 ASPH01、ASPH03、ASPH05、ASPH09、ASPH17、ASPH18、ASPH22、 ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH41、ASPH45、ASPH46、ASPH47和ASPH48或对照SEQIDN0·144 和145转染人Panc-I胰腺癌细胞。随后向细胞中添加寡核苷酸持续2天，之后改变介质，并 在含寡核苷酸的介质中再孵育2天。随后测量TGF-β I mRNA (图6a)和TGF-β 2 mRNA (图 6b)的表达并标准化至HPRTl (次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)通过ELISA分析细胞上清液 中的TGF-β 1(图7a)和TGF-f3 2(图7b)蛋白质。在自主递送实验条件下，双重TGF-β 1 和TGF-β 2反应性寡核苷酸ASPH01、ASPH03、ASPH05和泛特异性ASPH09显著抑制TGF-β 1 和TGF-β 2 mRNA和蛋白质的表达。所有其他的寡核苷酸都在mRNA和蛋白质水平上显著抑 制TGF-β 2的表达。
[0104] 实施例6
[0105] 在另一个实验中，测试了本发明的修饰的寡核苷酸的抑制作用的剂量依赖性。在 不使用转染试剂的情况下，分别使用15μ Μ、1〇μ Μ、7. 5μ Μ、5μ Μ、2. 5μ Μ、1. 25μ M 或0. 625 μ M的ASPH05或ASPH36或对照SEQ ID NO. 144和145处理人Panc-I胰腺癌细 胞。向细胞中加入寡核苷酸持续2天。之后改变介质并将细胞在含有寡核苷酸的介质中再 孵育2天，之后（总处理时间：4天）测量TGF- β 1 (图8a)和TGF- β 2 (图8b)mRNA的表达。