e_' 2000 脂质体（6、9、12 或 15 μ 1)加入到 150 μ I Opli-MEM b营养液中，混合均匀；
[0139] 3)取14 μ g待转染的质粒（DNA含量应达到0. 5~5 μ g/ μ 1)加入到 700 μ I Opli-MEM "营养液中，混合均匀；
[0140] 4)将稀释好的质粒分别与步骤2中稀释好的LipoibclamiW 2000脂质体各150 μ 1 等量混合；
[0141] 5)室温作用5分钟；
[0142] 6)取250 μ 1混合液加入到准备好的细胞6孔板中，应保证每孔DNA最终含量达到 2500ng，每孔脂质体的用量在5~12. 5 μ 1。
[0143] 7) 37 °C培养箱中培养1~3天后，对转染细胞进行检测。
[0144] 转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代， 仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
[0145] (3)重组病毒的蚀斑纯化
[0146] 将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附 1小时后，弃去吸附液，铺上1 %的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微 镜下观察荧光，挑选同时表达了绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于ImlDMEM 营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病毒 (Pseudorabies virus，PRV)双荧光标记缺失株（rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/ RFP+)，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC No.11493。
[0147] (4)重组伪狂犬病病毒 rPRV/gE /gl /US9 // Λ UL49. 5TK /GFP+/RFP+株的鉴定
[0148] 采用gE、gI、US9、UL49. 5、GFP、TK和RFP特异性引物（序列3/序列4、序列1/序 列2、序列15/序列16、序列7/序列8、序列13/序列14、序列5/序列6、序列32/序列33) 进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gl、US9、TK基因片段，扩增出GFP、RFP基因片段。 经测序证实，重组病毒缺失了 gE、gI、US9、TK基因，UL49.5基因缺失了37~40氨基酸对应 碱基和CT基因，并成功插入了 GFP、RFP标记基因（见附图3)。
[0149] 实施例2
[0150] --重组伪狂犬病病毒rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株生物学特 性测定
[0151] 1.病毒含量测定对重组病毒 rPRV/gE/gI/US9/AUL49.5/TK/GFP+/RFP+株病 毒进行病毒含量测定。结果发现重组病毒含量可达l(^°TCID5(]/ml。
[0152] 2.遗传稳定性试验重组伪狂犬病病毒rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/ RFP+株病毒在ΡΚ15细胞上传代10代，绿色和红色荧光蛋白均能稳定表达，通过PCR鉴定 每个代次的病毒液，可检测到插入的GFP基因和RFP基因及插入点两侧的病毒基因序列，表 明所获得的重组病毒rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株病毒能稳定遗传。在 传代过程中发现，该重组毒株在PK15细胞上出现病变的时间要比重组毒株rPRV/gE /gl / US9 /TK /GFP+/RFP+早 10 ~24 个小时。
[0153] 3.对小鼠安全性试验将伪狂犬病病毒rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/ RFP+株及亲本株SX株分别以10 6^TCID5。病毒量接种Balb/c小鼠，每组6只，观察14天，结 果rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株病毒接种的小鼠在14天均表现正常，而 接种SX株PRV的小鼠全部死亡，取两组小鼠脑组织，病料处理后接种PK15细胞，rPRV/gE / gl /US9 /TK /GFP+/RFP+株病毒组小鼠的脑组织中均能检测到红色荧光和绿色荧光。由此说 明，重组病毒rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株毒力较亲本株明显下降，且高 剂量攻击小鼠，对小鼠是安全的。
[0154] 表 2 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+对小鼠安全性试验结果
[0156] 附件 1
[0157] Lipofectamine?2000转染试剂盒说明书
[0158] 操作步骤：
[0159] (以6孔板一个孔的用量为例，其他细胞板各试剂用量配比及对应步骤见附表）
[0160] 1.细胞培养至长成70-90 %细胞单层；
[0161] 2.取适宜体积的 Lip〇rcctaniine_'l:: 2000 脂质体（6、9、12 或 15 μ 1)加入至Ij 150 μ I OpU-MEM _(营养液中，混合均匀；
[0162] 3.取14 μ g待转染的质粒（DNA含量应达到0. 5~5 μ g/ μ 1)加入到 700 μ I 养液中，混合均匀；
[0163] 4.将稀释好的质粒分别与步骤2中稀释好的Liporcctamins/. 2000脂质体各 150 μ 1等量混合；
[0164] 5.室温作用 5min;
[0165] 6.取250 μ 1混合液加入到准备好的细胞6孔板中，应保证每孔DNA最终含量达到 2500ng，每孔脂质体的用量在5~12. 5 μ 1。
[0166] 7. 37 °C培养箱中培养1~3天后，对转染细胞进行检测。
[0167] 附表不同细胞板各试剂用量配比及对应步骤
【主权项】
1. 一种伪狂犬病病毒株，其特征在于所述该病毒株为伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV)rPRV/gE/gl/US9 /ΛUL49. 5/TK/GFP+/RFP+株已于 2015 年 11 月 11 日送交北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo. 11493。2. 一种伪狂犬病病毒株，其特征在于该伪狂犬病病毒株同时缺失了gE基因、gl基因、 US9基因、TK基因和部分UL49. 5基因五种伪狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通过同源 重组分别插入绿色荧光蛋白（GFP)基因和红色荧光蛋白（RFP)基因作为标记物。3. 如权利要求1所述伪狂犬病病毒株，其特征在于缺失的UL49. 5部分基因包括其所表 达的gN蛋白的胞外域37~40氨基酸所对应的12个核苷酸序列及胞质尾区（CT)全部51 个核苷酸序列。4. 如权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的构建方法，其特征在于该毒株构建的步骤 为： (1) 亲本毒株：用自主分离和鉴定并命名为伪狂犬病病毒（PRV)SX株作为亲本毒株； (2) 转移载体的构建：以PMD-18T克隆载体为骨架载体，构建四种转移载体：第一种转 移载体为PMD-US6-GFP-US2，插入伪狂犬病病毒gl、gE和US9两端的US6和US2部分基因序 列作为同源臂，左右同源臂间插入GFP基因；第二种转移载体为pMD-UL50-UL49. 5-Λ37~ 40-CT-RFP-UL49,插入UL49. 5基因CT序列两端部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插 入RFP基因；第三种转移载体为pMD-UL50-UL49. 5-Λ37~40-CT-UL49,插入UL49. 5基因 CT基因两端部分基因序列作为同源臂，将第二种转移载体引入的RFP基因敲除；第四种转 移载体为PMD-UL24-RFP-UL22,插入伪狂犬病病毒ΤΚ基因两端的UL24和UL22部分基因序 列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因； (3) 双荧光标记缺失病毒的构建：首先将（2)中的pMD-US6-GFP-US2转移载体与亲本 株PRVSX株共转染ΡΚ15细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失病毒株（rPRV/ gE/gl/US9 /GFP+株）；第二步将上一步缺失株与pMD-UL49. 5-Λ37-40-CT-RFP转移载体 共感染ΡΚ15细胞，筛选出缺失株（rPRV/gE/gl/US9 /ΛUL49. 5/GFP+/RFP+株）后，再通过 同源重组将RFP标记基因敲除；第三步将筛选的rPRV/gE/gl/US9 /ΛUL49. 5缺失株再 与PMD-UL24-RFP-UL22转移载体共转染ΡΚ15细胞，通过克隆筛选获得双荧光标记缺失病毒 rPRV/gE/gl/US9 /ΛUL49. 5/TK/GFP+/RFP+株。5. 权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的应用，其特征在于rPRV/gE/gl/ US9 /ΛUL49. 5/TK/GFP+/RFP+株作为候选毒株，敲除其中GFP和RFP后作为疫苗生产毒株 用于制备伪狂犬病活疫苗。6. 权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的应用，其特征在于rPRV/gE/gl/ US9 /ΛUL49. 5/TK/GFP+/RFP+株作为活载体病毒插入一种和/或多种动物病原抗原基因， 以获得表达外源基因的重组病毒，制备基因工程活载体疫苗，达到同时防制多种疾病的目 的。
【专利摘要】本发明涉及一种伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建。该病毒株是以自行分离的一株伪狂犬病病毒(SX株)为母本，通过分子生物学手段，缺失伪狂犬病病毒的gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的5基因缺失病毒株(rPRV/gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-/GFP+/RFP+)。本发明建立了一套伪狂犬活病毒载体系统；双荧光蛋白标记便于今后基因工程操作的筛选和鉴定；可同时插入多种外源基因，较一般活载体系统更加高效。该双荧光标记缺失病毒作为活载体的成功构建，为研制重组伪狂犬病基因工程疫苗奠定了基础。CGMCC No.1149320151111
【IPC分类】C12N7/01, A61P31/22, C12N15/869, C12N15/38, A61K39/245
【公开号】CN105385666
【申请号】CN201510837152
【发明人】李俊平, 杨承槐, 陈晓春, 李慧姣, 孙莹, 张广川, 李启红, 曹明慧, 李岭
【申请人】中国兽医药品监察所
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月26日