包含色氨酸残基或多肽。在所述至少一种标记物 包含吲哚部分的其它实施方式中，所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
[0029] 在所述电泳凝胶的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含生物素部分。
[0030] 在所述电泳凝胶的一些实施方式中，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1、2、 3、 4、5、6、7、8、12、14、16、18、21 或 24 个。
[0031] 本文还提供一种试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包含上述组合物。在这 些实施方式的一些中，所述试剂盒还包含电泳凝胶，其中所述组合物是所述电泳凝胶的组 成部分。
[0032] 在一些实施方式中，所述试剂盒包含如上所述的电泳凝胶。
[0033] 在一些实施方式中，所述试剂盒包含环糊精和试剂，所述环糊精共价连接至至少 一种标记物，所述试剂能与所述至少一种标记物发生化学相互作用，由此使所述标记物可 检测。在一个此类实施方式中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精或 γ -环糊精。在另一个此类实施方式中，所述至少一种标记物共价连接至一个或多个吡喃葡 萄糖单位的一个或多个6位处。
[0034] 在所述试剂盒的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含吲哚部分。在这些实 施方式的一些中，所述至少一种标记物包含色氨酸残基或多肽。
[0035] 在所述至少一种标记物包含吲哚部分的其它实施方式中，所述至少一种标记物不 包含色氨酸残基。
[0036] 在一些实施方式中，所述试剂盒中的所述试剂是卤素取代的有机化合物。在一个 此类实施方式中，所述卤素取代的有机化合物是氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯或3-溴-1-丙 醇。
[0037] 在所述试剂盒的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含生物素部分。在一些 实施方式中，所述试剂包含如下蛋白质中的一种：亲和素、链霉亲和素和中性亲和素。
[0038] 在所述试剂盒的一些实施方式中，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1、2、3、 4、 5、6、7、8、12、14、16、18、21 或 24 个。
[0039] 当所述试剂盒包含环糊精和试剂时，在一些实施方式中，所述试剂盒还包含电泳 凝胶，其中所述环糊精是所述电泳凝胶的组成部分。在其它实施方式中，所述试剂盒还包含 电泳凝胶，其中所述试剂是所述电泳凝胶的组成部分。在一个此类实施方式中，所述环糊精 也是所述电泳凝胶的组成部分。
[0040] 当所述试剂盒包含环糊精和试剂时，在一些实施方式中，所述试剂盒还包含水性 缓冲液，其中所述环糊精是所述水性缓冲液的组成部分。在一个此类实施方式中，所述水性 缓冲液是利姆里（Laemmli)缓冲液。
[0041] 还提供一种组合物，其包含共价连接至至少一个取代的吲哚部分的环糊精。在所 述组合物的一个实施方式中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精或 γ-环糊精。在另一个实施方式中，所述至少一个取代的吲哚部分共价连接至一个或多个吡 喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。而在另一个实施方式中，所述取代的吲哚部分与未取 代的吲哚部分的分子量相差28、44或58Da。而在另一个实施方式中，所述取代的吲哚部分 包含甲酰基、羧酸、羟基乙酮，或丙醇基团。在其它实施方式中，所述取代的吲哚部分是未取 代的吲哚部分与卤素取代的有机化合物的紫外光诱导的反应的产物。在一个此类其它实施 方式中，所述卤素取代的有机化合物是氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯或3-溴-1-丙醇。而在 所述组合物的另一个实施方式中，每个环糊精的取代的吲哚部分的平均数量是至少1、2、3、 4、5、6、7、8、12、14、16、18、21 或 24 个。
[0042] 本文还提供电泳凝胶，其中所述凝胶包含共价连接至至少一个取代的吲哚部分的 环糊精的组合物，如该组合物的任何实施方式所述。本文还提供一种试剂盒，其包含该组合 物。所述试剂盒的一些实施方式还包含电泳凝胶，其中所述组合物是所述电泳凝胶的组成 部分。此外，提供一种试剂盒，其包含上述电泳凝胶，其中所述凝胶包含共价连接至至少一 个取代的吲哚部分的环糊精的组合物。
[0043] 还提供检测蛋白质的另一种方法。所述方法包括：使蛋白质与共价连接至至少 一个取代的吲哚部分的环糊精的组合物接触；使所述蛋白质暴露至紫外光；和检测荧光发 射，由此检测所述蛋白质。
[0044] 在一些实施方式中，所述方法还涉及对所述蛋白质进行凝胶电泳，和在电泳凝胶 中检测所述蛋白质。在一些实施方式中，在凝胶电泳之前，使所述蛋白质与所述组合物接 触。在一个此类实施方式中，所述组合物悬浮在缓冲液中，并且所述接触步骤包括使所述蛋 白质与所述缓冲液接触。在其它实施方式中，在凝胶电泳之后，使所述蛋白质与所述组合物 接触。在一个此类实施方式中，所述组合物悬浮在缓冲液中，并且使电泳凝胶与所述缓冲液 接触，由此允许所述组合物扩散进入所述电泳凝胶，并使所述蛋白质与所述组合物接触。在 其它实施方式中，所述组合物是所述电泳凝胶的组成部分，并且在对所述蛋白质进行凝胶 电泳时使所述蛋白质与所述组合物接触。
[0045] 在涉及对所述蛋白质进行凝胶电泳的所述方法的一些实施方式中，所述方法还包 括如下步骤：将所述蛋白质转移出所述电泳凝胶并转移至印迹膜上，和检测所述印迹膜上 的蛋白质。在一个此类实施方式中，所述方法还包括从所述蛋白质移除所述组合物。在所 述方法的其它此类实施方式中，所述蛋白质包含亲和标签或抗体结合表位，并且检测涉及 使所述印迹膜与所述亲和标签或抗体结合表位的结合伴侣接触。在这些实施方式的一些 中，所述亲和标签或抗体结合表位包含色氨酸残基。在一个实施方式中，所述亲和标签是 Strep-标签。
[0046] 附图简要说明
[0047] 图1显示本发明的一些实施方式中出现的现象：带有色氨酸标记的环糊精 与卤素取代的有机化合物（例如三氯乙醇）的紫外光诱导的反应，反应之后带有色氨 酸标记的环糊精的紫外激发和荧光发射，蛋白质的色氨酸残基在环糊精的腔中的掩蔽 (sequestration)，和该掩蔽的色氨酸残基受保护以免于紫外光诱导的反应。
[0048] 图2显示在包含0. 5% v/v三氯乙醇（TCE)和不同浓度的甲基-β-环糊精（MB⑶； 0、2. 5和25mM)的溶液中孵育凝胶之后，SDS-PAGE凝胶中蛋白质的荧光发射。
[0049] 图3显示图2的SDS-PAGE凝胶的泳道中的约200, OOODa条带的定量。
[0050] 图4显示在凝胶于包含MB⑶和不同浓度的TCE (0. 5、0. 47和0. 25% v/v)的溶液 中孵育之后，该SDS-PAGE凝胶中蛋白质的荧光发射。
[0051] 发明详述
[0052] 直
[0053] 发明人吃惊地确定，蛋白质可采用带标记的环糊精来检测。所述检测可不利用待 检测的蛋白质的氨基酸侧链的共价修饰，而是使其结合环糊精来进行。本文中所用的术语 "带标记的环糊精"包含共价连接至标记物的环糊精分子。所述标记物可包含一个或多个吲 噪部分，其与标准免染（stain-free)技术中的色氨酸残基类似，能够在暴露至紫外光之下 时与卤素取代的有机化合物反应。因此，在使蛋白质与带标记的环糊精接触之后，该环糊精 修饰的蛋白质可利用荧光检测（图1)。相较于标准免染技术，利用带吲哚标记的环糊精可 提供更灵敏的蛋白质检测，因为除色氨酸残基以外，环糊精能够结合至苯丙氨酸和酪氨酸 残基，并且各环糊精分子能携带多个吲哚部分。更广泛地，如下所述，环糊精能共价连接至 能与试剂相互作用以形成可检测的产物的任何标记物。所述产物可在所述蛋白质与所述带 标记的环糊精接触之前或之后形成。本文提供方法、组合物、试剂盒和电泳凝胶，用于利用 带标记的环糊精来检测蛋白质。
[0054]
[0055] 在一些实施方式中，所述方法涉及使蛋白质与共价连接至至少一种标记物的环糊 精接触。任何环糊精可用于这些方法，包括但不限于α-环糊精、环糊精、甲基环 糊精和γ-环糊精。环糊精的其它类型和衍生物是本领域已知的（参见例如Τ. Serno等， Advanced Drug Delivery Reviews 63,1086-1106, 2011)。除了所述标记物以外，也优选向 所述环糊精引入化学修饰，以提高所述方法的性能。所述修饰能易化标记物的连接或检测， 或者引起环糊精与例如感兴趣蛋白质的更牢固的结合。在一些实施方式中，选择能够通过 如下方式结合至所述蛋白质的环糊精，该环糊精能将芳族氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸或酪 氨酸）的侧链容纳在其中央腔内，并在检测过程中保持与所述蛋白质相联。
[0056] 应认识到，除环糊精外，本发明方法可经调整以用于其他环状有机主体分子，只要 这些分子能够非共价地结合蛋白质的选定氨基酸残基，并且连接至可检测的标记物即可。 主体分子的作用通常是连接待检测的蛋白质和用于检测的标记物，和允许进行特异性检 测，且无需蛋白质的共价修饰。所述方法的各种实施方式所需的调整将取决于对主体分子 的选择，用于将标记物连接至主体分子的化学作用，用于检测的条件，感兴趣的靶标蛋白质 的属性，以及其它考量因素。
[0057] 任何标记物均可被用于本文所述的方法，前提是所述标记物能够与试剂发生化学 相互作用以形成可检测的产物，如下所述。在一些实施方式中，所述标记物包含吲哚部分， 其一旦暴露至紫外光下就能与卤素取代的有机化合物反应，以形成发荧光的产物。所述吲 哚部分可以是连接至环糊精的色氨酸残基的部分，作为单一氨基酸或作为多肽中多种氨基 酸残基之一。或者，所述吲哚部分能够在没有构建色氨酸残基所需的额外原子的情况下连 接至环糊精，或可以是不包含色氨酸残基的化学结构的部分。即，包含吲哚部分的标记物不 必包含色氨酸残基。出于使合成简易或其它原因，可选择将吲哚连接至环糊精的化学结构。 较长的接头结构（例如，在环糊精和吲哚之间插入1、2、3、4个或更多甘氨酸残基）会阻碍 吲哚插入环糊精的中央腔。
[0058] 可按需实现一个或多个标记物与环糊精的共价连接。例如，可采用 Djedaftii-Pi]ar(i所述的 DCC化学法（参见例如Djeda'ini-Pilard等，Tetrahedron Lett. 34， 2457-2460,1993,和DjedaiM-Pikrd等，J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2,723-730,1995)，将 基于氨基酸的标记物（包含一种或多种氨基酸，例如寡肽形式）连接至单-氨基酸-取代 的β-或γ-环糊精。本文中，所述连接的位置是一个吡喃葡萄糖单位的6位。在未修饰 的环糊精中，反应性伯羟基基团在该位置处接合至吡喃葡萄糖环。可选择性活化伯羟基以 引入氨基基团供于进一步反应，或可与标记物直接反应。
[0059] 还可采用碳水化合物化学的策略来控制每个环糊精连接的标记物的数量。除了 6 位的伯羟基以外，各吡喃葡萄糖单位在2位和3位处包含两个仲羟基