2b，产物经酶切初步鉴定后，送往上海生物工程有限公司进行测序，筛选测序正 确的转化子，阳性克隆子记为petduet-CTB及pet22b-EGFP-CTA2-TAT。
[0053] 实施例2
[0054] EGFP-CTA2-TAT可溶性蛋白表达与纯化
[0055] 质粒pet22b-EGFP-CTA2-TAT导入宿主菌±即大肠杆菌BL21(DE3)中，并实现表达； 已经转化入质粒pet22b-EGFP-CTA2-TAT的按1:100比例扩大培养于2L富含100ug/mL氨苄青 霉素的LB培养基中，于37度，200rpm的摇床中培养至OD值为2后，加入终浓度为Im M的IPTG， 诱导培养至8小时。培养物分装于300ml的离心管中，于10000rpm，4度下离心30min,弃去培 养基，收集细菌并用200ml含2%triton x-100的I3BS洗3次，收集细菌。每100mL原始的培养 物中加入41111含2%杜丨如111-100的1^3，并加入终浓度为200耶/1111的溶菌酶(购自上海生 工），于-20度中反复冻融3次。之后转移至离心机中，于10000rpm，4度，离心1小时，收集上 清。上清过0.45um滤膜(津腾)并载入Ni-NTA柱中，按照GE Ni-NTA纯化步骤，最后用咪唑梯 度洗脱，于SDS PAGE分析每一管收集的样品中EGFP-CTA2-TAT的纯度，并用抗GFP的抗体进 行WESTERN BLOT分析，检测是否获得目标蛋白EGFP-CTA2-TAT。
[0056] 实施例3
[0057] 霍乱毒素 B亚单位包涵体蛋白纯化及复性
[0058] 质粒petduet-CTB导入宿主菌BL21(DE3)中，并实现表达，质粒petduet-CTB转化入 大肠杆菌BL21(DE3)后，反复冻融之前的步骤与EGFP-CTA2-TAT蛋白获得的步骤一致。反复 冻融三次后，转入离心机中，于4度，1000 Orpm下离心30min，收集沉淀。沉淀用buffer I (pH = 8.0,IOOmM NaCl，2%triton x-100，20mM tris-HCl，5mM EDTA)洗涤三次，依次用2M、4M、 6M、8M尿素的buffer I继续洗涤，收集上清。并用SDS PAGE检测上清中的CTB单体是否纯净。 筛选纯度高的CTB上清用于复性。含有尿素的CTB上清用含系列梯度的buff erll (buff erl， lmmol/L GSH,Ameresco,0. lmmol/L GSSH,Ameresco,8M-0M尿素 ，PH = 7·4)透析复性。每8小 时换液一次，由8M尿素的buffer II开始，不断稀释尿素浓度，直至除去尿素。PAGE检测CTB5 的形成，检测结果见图3~图4。
[0059] 实施例4
[0060] 体外组装AB5结构嵌合蛋白
[0061] 纯化的蛋白CTB5与蛋白质EGFP-CTA2-TAT转移至IOkda的超滤管中（Mi 11 ipore)， 离心浓缩至体积为5ml，同时除去大部分的盐离子。BCA法对蛋白CTB5与蛋白EGFP-CTA2-TAT 进行定量。按CTB5: EGFP-CTA2-TAT质量比为5:1的比例投入到反应管中，加入柠檬酸调节PH 至荧光刚好消失，此时PH约为3.0，20min后，加入EDTA2Na调节PH至8.0-8.5之间，于室温静 置1小时以上，直至于蓝光灯中可再次观察到荧光，参照图6,发光的即为CTB5/EGFP-CTA2- TAT^AGE检测是否形成了六聚体蛋白，参照图5。
[0062] 实施例5
[0063] HPLC检测蛋白是否形成
[0064] 色谱柱型号为TSK GS2000W，将EGFP-CTA2-TAT，CTB5、及组装后的AB5复合物依次 打谱，HPLC购自日本岛津公司，型号为LC-20A.。分析过程中参数设置如下：温度为30°C，流 速为0.5ml/min，进样量为20μ1，流动相并于210nm处检测目标蛋白。实验结果见图7 ~图9，由通过纯化的EGFP-CTA2-TAT的HPLC图谱、纯化的CTB5的HPLC图谱、组装后的混合物 AB5的HPLC图谱可以知CTB5/EGFP-CTA2-TAT已经形成。
[0065] 实施例6
[0066] GMl-elisa检测AB5蛋白结合GMl能力
[0067] 购自sigma的神经结苷脂GMl用灭菌过的PBS稀释至10ug/ml.用移液器吸取IOOul 包被于96孔板中，于4度过夜。之后，拍干96孔板中的GMl溶液，并加入IOOul的封闭液(PBS， 0.2%吐温，10%牛血清蛋白组分五)于37度封闭2小时后，拍干96孔板中的封闭液，每孔中 加入系列梯度浓度的〇^5^8546??-〇^2141\1^3，于37度摇床中低速孵育1小时，弃干96 孔板中的蛋白溶液，并分别用抗CTB的一抗，抗CTB-抗，抗GFP-抗，抗GFP-抗(一抗按1: 500稀释)于37度作用一小时，拍干一抗残留溶液，并用PBST (PBS+0.05 %吐温)洗涤三次，每 次20min，拍干后，继续分别加入相应羊抗鼠，羊抗鼠，兔抗鼠的二抗(按1:5000稀释），37度 孵育一小时后，继续用PBST洗涤三次，拍干净残留的溶液后，用TMB(Bc)Ster，中国）一管式显 色液显色，显色步聚依照该产品说明书，并于450nm处测OD值。每个浓度样品平行5孔测试。 [0068] 实验结果见图10,如图例所示对应为本实验纯化的CTB5、购买自sigma的CTB5标准 品，纯化的EGFP-CTA2-TAT、AB5复合物、PBS对GMl的结合能力，随着浓度升高，与GMl的结合 能力越强，并且，在低剂量下，AB5复合物较CTB5的结合能力更强。
[0069] 实施例7
[0070] 基于前列腺癌PC3细胞的穿膜效果测试
[0071 ]前列腺癌细胞种板于购自康宁的96孔板中，按5000个/ml浓度种板，每孔2ml。奴小 时后，弃去旧的1640培养基，加入新鲜的无血清的1640培养基Iml，并分别加入纯化的EGFP-CTA2-TAT融合蛋白（16ug/ml)，AB5蛋白（48ug/ml)和EGFP蛋白（16ug/mL)，37度二氧化碳培 养箱中培养1小时。弃去培养基，并用PBS小心洗涤细胞三次，转移到荧光显微镜（Olympus 1X71，日本)中观察细胞内荧光分布情况，并拍照记录。
[0072] 结果见图11，A列为自然光下观察的PC3细胞的结果，B列为荧光激发下观察PC3细 胞的结果。由图可知，EGFP-CTA2-TAT最强，而EGFP无效，CTB5/EGFP-CTA2-TAT有效，进一步 验证了 CTB5/EGFP-CTA2-TAT 的形成。
[0073] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范 围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技 术方案所作的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围之内。
【主权项】
1. 基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白，其特征在于，为CTB5/EGFP-CTA2-TAT，为CTB5以 及EGFP-CTA2-TAT嵌合组装而成。2. 根据权利要求1所述的基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白，其特征在于，CTB5的氨基 酸序列为SEQ ID N0:1所示。3. 根据权利要求1所述的基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白，其特征在于，EGFP-CTA2-TAT的氨基酸序列为SEQIDN0:2所示。4. 权利要求1~3所述的基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特征 在于，其步骤如下： 51、 基因克隆与表达 采用BamHI/Hindlll双酶切的方法，将编码CTB的基因克隆到双基因表达载体petduet-1的多克隆位点1的位置，构建的载体命名为petduet-CTB; 将编码有EGFP-CTA-TAT的基因克隆到表达载体pet22b( + )中，并去除其信号肽，克隆时 选用的酶切位点为Ndel和Xhol，构建的载体命名为pet22b-EGFP-CTA2-TAT丄 52、 EGFP-CTA2-TAT可溶性蛋白表达与纯化 质粒pet22b-EGFP-CTA2-TAT导入宿主菌，即大肠杆菌BL21 (DE3)中，并实现表达； pet22b-EGFP-CTA2-TAT在大肠杆菌BL21(DE3)系统中以可溶性形式表达，最终经由Ni-NTA 纯化得到电泳级纯的产品。 53、 霍乱毒素 B亚单位包涵体蛋白纯化及复性 质粒petduet-CTB导入宿主菌BL21 (DE3)中，并实现表达，表达产物为包涵体，包涵体通 过洗涤，去除表面杂质后，重新溶于梯度浓度的尿素中，通过电泳筛选纯的CTB单体，CTB单 体经梯度透析复性形成稳定的CTB5; 54、 体外组装AB5结构嵌合蛋白 纯化的CTB5与EGFP-CTA2-TAT通过超滤除去大部分的盐离子后，按CTB5: EGFP-CTA2-TAT的质量比为5:1至8:1的比例投入反应容器中，通过加入柠檬酸使混合物的pH值为2.3-3.0之间20s后迅速加入EDTA二钠调节PH至8.5.室温静置至少1小时，直至荧光逐渐恢复，即 可。5. 根据权利要求4所述的基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，设计引物如下：CGCGGATCCAACACCTCAAAATATTACTGATTT和CAGCCAACTCAGCTTCCTT，用 于从pet28a-CTB中扩增目标基因序列CTB即编码CTB的基因。6. 根据权利要求4所述的基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，设计引物如下：CGGAATTCCATATGG TGAGCAAGG和CCGCTCGAGCTGTGGTGGAC，用于从合 成的基因序列中扩增具有酶切位点Ndel/Xhol的基因序列EGFP-CTA2-TAT，即编码有EGFP-CTA-TAT的基因。7. 根据权利要求5所述的基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，保留载体petduet-CTB上原有的组氨酸标签。8. 根据权利要求6所述的基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，保留载体pet22b-EGFP-CTA2-TAT上原有的组氨酸标签。9. 根据权利要求8所述的基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，EGFP-CTA2-TAT的基因序列之间用连接肽作了相应的修饰。10.基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白用于肿瘤的治疗。
【专利摘要】基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，为嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT，其体外构建的方法，构建的载体petduet-CTB和pet22b-EGFP-CTA2-TAT；然后导入宿主菌，纯化或复性，然后再体外组装AB5结构嵌合蛋白，本方法得到的蛋白纯净度高，并且更稳定，重复性强，并且细菌表达无负担，可快速获得蛋白原料，与GM1结合的高度活性，有更高效的穿膜能力。
【IPC分类】A61P35/00, C07K19/00, A61K47/48, A61K38/16, C12N15/70
【公开号】CN105504065
【申请号】CN201511029373
【发明人】郑希, 林卫萍, 王华倩, 杜志云, 张焜
【申请人】广东工业大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月30日