大豆转基因事件mon87705及其检测方法

专利名称：大豆转基因事件mon87705及其检测方法
技术领域：
本发明涉及转基因大豆事件M0N87705及其植物部分和种子。该事件显示出包含改变的脂肪酸水平的油组成。本发明还涉及检测生物样品中大豆事件的存在的方法，并且提供能够进行该检测的核苷酸序列。
背景技术：
大豆是一种重要的作物，并且是世界许多地区的主要食物来源。生物技术方法已经应用于大豆以改进农艺学性状和产品质量。一种这样的质量性状是包含改变的脂肪酸水平的大豆油。能够检测特定植物的转基因/基因组DNA的存在以确定有性杂交的后代是否含有感兴趣的转基因/基因组DNA将是有利的。另外，当遵守要求上市前审批及对源自重组作物植物的食品进行标注的规定时，检测特定植物的方法是有用的。大豆油已经通过多种育种方法改良，以产生对于特定市场的利益。但是，对于诸如色拉油、烹饪用油和煎炸用油消费者等主要大豆油使用者和诸如生物柴油(biodiesel) 和生物润滑油(biolube)市场等工业市场广泛有益的大豆油无法获得。现有的大豆油或者太过昂贵，或者缺乏重要的食品质量性质，如氧化稳定性、良好的煎炸食物味道或饱和脂肪含量，或重要的生物柴油性质，如适当的一氧化氮排放或耐寒性或低温流动性。大豆油一般含有大约20%的油酸。油酸具有一个双键，但是在高温下仍然相对稳定，具有高油酸含量的油适于烹饪和其它需要加热的过程。最近，推荐增加食用高油酸含量的油，因为油酸似乎能降低血液中的低密度脂蛋白(“LDLs”)的水平，而不影响高密度脂蛋白(“HDLs”)的水平。但是，油酸水平的一些限制是希望的，因为当油酸在高温下降解时，它产生味道不好的化合物，并且减少了亚油酸氧化产生的好味道。Neff等人，JA0CS，77 1303-1313(2000) ；Warner 等人，J. Agric. Food Chem. 49 :899-905 Q001)。因此优选使用油酸水平为65-85% (重量)或更低的油，以限制食品应用(例如煎炸用油和煎炸的食物)中的异味。其它优选的油为了改善氧化稳定性而具有高于(重量)的油酸水平。对于许多油应用来说，低于8% (重量)或甚至低于大约2-3% (重量)的饱和脂肪酸水平是理想的。大豆油一般含有大约16-20%的饱和脂肪酸13-16%的棕榈酸和 3-4% 的硬脂酸(总体参见 Gunstone 等人，The Lipid Handbook, Chapman & Hall， London(1994))0饱和脂肪酸具有高熔点，这在许多应用中是不希望的。当用作原料或燃料时，饱和脂肪酸导致在低温下变浑浊(clouding)，并且赋予燃料较差的低温流动性能，例如倾点和低温过滤器堵塞点。含有低水平饱和脂肪酸的油产品受到消费者和食品工业的偏爱，因为它们被认为是更健康的和/或可以按照FDA的规定标上“不含饱和脂肪”。另外，低饱和度的油减少或者消除了对诸如色拉油等食品用油进行防冻准备的需求。在生物柴油和润滑油应用中，具有低水平饱和脂肪酸的油赋予改进的低温流动性能，并且在低温下不会浑浊。产生具有中油酸和低饱和物含量的种子的大豆系是理想的。此处公开的方法使得能够产生油酸水平在55-80%的中等油酸范围且饱和脂肪酸水平低于8%的大豆种子。已知外来基因在植物中的表达受其染色体位置的影响，可能是由于染色质结构 (如异染色质)或靠近整合位点的转录调控元件(如增强子)的接近性(Weising等人， 1988, Ann. Rev. Genet 22:421-477)。基于这个原因，通常需要筛选大量的事件以判断以引入的目标基因的最佳表达为特征的事件。例如，在植物和其它生物中已观察到引入基因的表达水平在事件之间差异很大。在表达的空间或时间模式上也有差异，例如，转基因在不同植物组织中的相对表达的差异，这可能不符合从引入的基因构建体中存在的转录调控元件预期的模式。基于这个原因，通常产生数百至数千个不同的事件，并对这些事件进行筛选， 以选择具有所需转基因表达水平和用于商业目的的模式的单一事件。具有理想的转基因表达水平或模式的事件可以用于通过使用传统育种方法的有性远交将转基因渗入其它遗传背景中。这种杂交的后代保持原转化体的转基因表达特征。这一策略用来确保适当地适应当地特定生长条件的许多品种中的可靠的基因表达。可以通过任何公知的核酸检测方法如聚合酶链反应(PCR)或使用核酸探针的DNA 杂交来检测转基因的存在。这些检测方法一般集中于经常使用的遗传元件，如启动子、终止子、标记基因等。因此，这些方法可能无法用于区分不同的事件，特别是使用相同的DNA构建体产生的那些，除非邻近插入的DNA的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是已知的。例如， Taverniers 等人(J. Agric. Food Chem. ,53 :3041-3052,2005)讨论了事件特异性的 PCR 分析方法，其中证明了用于转基因玉米株系Btll、Btl76和GA21及用于油菜(canola)事件 GT73的事件特异性追踪系统。在这项研究中，事件特异性的引物和探针基于各事件的基因组/转基因连接区(junction)的序列进行设计。转基因植物事件特异性的DNA检测方法也已在美国专利 6，893，826、6，825，400,6, 740，488,6, 733，974,6, 689，880,6, 900，014 和 6，818，807 中描述。本发明涉及具有包含改变的脂肪酸水平的油组成的转基因大豆(Glycine max)植物M0N87705，并且涉及大豆植物M0N87705的DNA构建体和大豆M0N87705及其后代中转基因/基因组插入区域的检测。发明概述本发明包括被命名为M0N87705的转基因大豆植物及其与大豆事件M0N87705不可区分的后代(这些后代也含有至少一个对应于插入的转基因DNA的等位基因)，其种子以保藏号PTA-9241保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。本发明的另一方面是大豆事件M0N87705的后代植物或种子或该植物和种子的可再生部分。本发明也包括大豆事件 M0N87705的植物部分，该植物部分包括但不限于花粉、胚珠、花、芽、根、茎、叶、荚、种子和分生组织。M0N87705的基因组中含有的新型遗传组合物和来自M0N87705的产物，如油、粗粉、细粉、食品、蛋白质补充剂和残留在已收获对应于M0N87705的大豆植物的田间的生物质，是本发明的方面。本发明提供一种大豆植物，其能够产生具有包含大约55-80% (重量)的油酸和少于8% (重量)的饱和脂肪酸的油组成的种子，其中所述油组成的遗传决定因素可从ATCC 保藏号为PTA-9241的大豆获得。根据本发明的一个方面，提供了用于检测是否存在来自被命名为M0N87705的新型大豆植物的转基因/基因组插入区域的组合物和方法。提供了包含M0N87705的至少一个连接序列的DNA序列，该连接序列选自SEQ ID NO 1 ([A]对应于SEQ ID N0:6[F]的第 ；3449 至；3468 位，图 2)、SEQ ID NO :2 ([B]对应于 SEQ ID NO :6[F]的第 10700 至 10719 位， 图2)和SEQ ID NO :18(对应于SEQ ID NO :6[F]的第9266至9371位，图2)及其互补序列；其中该连接序列是跨越插入基因组中的异源DNA与大豆细胞基因组DNA之连接点的核苷酸序列，并且在含有大豆DNA的生物样品中检测到该序列可以判断在所述样品中存在大豆事件M0N87705 DNA(图2)。这些连接序列可能含有SEQ ID NO :1、2、18列出的序列及其互补序列中的至少一个。包含这些DNA分子的大豆植物、该植物的大豆种子和该植物的后代是本发明的方面。来自大豆事件M0N87705的包含新型转基因/基因组插入区域的DNA序列SEQ ID NO :3[C]、SEQ ID NO :4[D]和 SEQ ID NO :5[E]或 SEQ ID NO :1[A]和 SEQ ID NO :2[B](参见图幻是本发明的方面。包含这些分子的大豆植物、种子和后代也是本发明的方面。根据本发明的另一方面，提供了用于DNA检测方法的两种DNA分子，其中，第一 DNA 分子包含SEQ ID NO :5的DNA分子的转基因区域任意部分的至少11个或更多、至少12个或更多、或至少13个或更多连续多核苷酸，以及SEQ ID NO :3的5’侧翼大豆基因组DNA区域的任意部分的类似长度的DNA分子，其中，这些DNA分子一起使用时用作产生扩增子的DNA 扩增方法中的DNA引物。当扩增子包含SEQ ID NO :1时，在DNA扩增方法中使用这些DNA 引物产生的扩增子可判断大豆事件M0N87705。使用与SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :5的任何部分同源或互补的DNA引物产生的任何扩增子及任何包含SEQ ID NO :1的扩增子是本发明的方面。根据本发明的另一个方面，提供用于DNA检测方法的两种DNA分子，其中，第一 DNA 分子包含SEQ ID NO :5的DNA分子的转基因区域任意部分的至少11个或更多连续多核苷酸，以及SEQ ID NO :4的3，侧翼大豆基因组DNA区域的任意部分的类似长度的DNA分子， 其中，这些DNA分子用作DNA扩增方法中的DNA引物。当扩增子包含SEQ ID N0:2时，在 DNA扩增方法中使用这些DNA引物产生的扩增子可判断大豆事件M0N87705。使用与SEQ ID NO :4和SEQ ID NO 5的任何部分同源或互补的DNA引物产生的任何扩增子及任何包含SEQ ID NO 2的扩增子是本发明的方面。根据本发明的另一个方面，提供用于DNA检测方法的两种DNA分子，其中，第一 DNA 分子包含SEQ ID NO :5的DNA分子的转基因区域任意部分的至少11个或更多连续多核苷酸或其互补序列，其中一条引物来源于位于SEQ ID N0:18的5’侧的序列，另一条引物来源于位于SEQ ID NO 18的3，侧的序列，其中，这些DNA分子用作DNA扩增方法中的DNA弓丨物。当扩增子包含SEQ ID NO: 18时，在DNA扩增方法中使用这些DNA引物产生的扩增子可判断大豆事件M0N87705。使用与SEQ ID NO :5的任何部分同源或互补的DNA引物产生的任何扩增子及任何包含SEQ ID NO :18的扩增子是本发明的方面。根据本发明的另一方面，提供了检测样品中对应于大豆事件M0N87705的DNA的存在的方法。这些方法包括(a)使包含DNA的样品与引物组接触，该引物组在对来自大豆事件M0N87705的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时产生可判断大豆事件M0N87705的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；和(c)检测所述扩增子，其中所述扩增子包含一个或多个SEQ ID NO :1、2和18列出的序列。本发明的另一方面是M0N87705的大豆植物或种子、或包含该植物或种子的事件的产物，其中，基因组DNA包含基本上由SEQ ID NO :3的大约1至3458位的核苷酸序列、 SEQ ID NO 5的大约1至7251位的核苷酸序列和SEQ ID NO 4的大约1至2515位的核苷酸序列(其叠连群显示为SEQ ID NO 6)及其互补序列组成的DNA分子。本发明的另一方面是M0N87705的大豆植物或种子、或来源于该植物或种子的产物，其中，基因组DNA包含基本上由SEQ ID NO 6的大约1至132M位的核苷酸序列及其互补序列组成的DNA分子。也提供了 M0N87705的大豆植物或种子、或来源于该植物或种子的产物，其中基因组DNA当从该大豆植物或种子或产物分离时，包含并入了 SEQ ID NO :1、2或18及其互补序列的DNA分子。在本发明的一个方面，DNA分子含有大豆事件M0N87705。另一方面，大豆植物中存在两个拷贝的含有大豆事件M0N87705的DNA分子。另一方面，大豆植物中存在一个拷贝的含有大豆事件M0N87705的DNA分子。本发明的另一方面是M0N87705的大豆植物或种子、或含有该植物或种子的事件的产物，其中，基因组DNA当从该大豆植物或种子或产物分离时，在DNA扩增方法中产生扩增子，其中所述扩增子包含至少一个选自SEQ ID NO :1、2和18的序列。另一方面，大豆植物的种子可以置于容器中。如本文使用的容器是能够容纳这样的种子的任何物体。容器优选地含有超过大约500、1，000,5, 000或25，000个种子，其中至少约10%、25%、50%、75%或100%的种子来源于本发明的植物。本发明也提供容纳超过大约10，000、更优选大约20，000、甚至更优选大约40，000个种子的容器，其中超过大约10 %、更优选大约25 %、更优选50 %、甚至更优选大约75 %或90 %的种子是来源于本发明的植物的种子。本发明还提供了容纳超过大约10kg、更优选大约2^g、甚至更优选大约 50kg的种子的容器，其中超过大约10%、更优选大约25%、更优选大约50%、甚至更优选大约75%或90%的种子是来源于本发明的植物的种子。本发明的另一方面提供了一种检测生物样品中是否存在大豆转基因事件 M0N87705的方法，包括a)从所述样品中提取DNA ；和b)测定是否存在具有对应于SEQ ID NO :1、2或18所示序列的序列的多核苷酸，由此可以确定所述样品中存在或不存在大豆事件 M0N87705。根据本发明的另一方面，提供了检测样品中是否存在对应于M0N87705事件的DNA 的方法，包括(a)使样品接触探针，该探针在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2和其互补序列的序列杂交，且在严格杂交条件下不与不含SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2的大豆植物DNA杂交；(b)使所述样品和探针经受严格杂交条件；和(c)检测所述探针与所述样品的结合，其中，结合能够判断所述样品中所述DNA的存在。本发明的另一方面是用于检测生物样品中大豆事件M0N87705的存在、包含长度为大约11个至大约20个连续核苷酸的探针，其中所述连续核苷酸选自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2和其互补序列。该探针可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸或核苷酸类似物。该探针可以用至少一种荧光团标记。本发明的另一方面是一种测定大豆事件M0N87705的后代的接合性的方法，该方法包括(a)使包含大豆DNA的样品接触引物组SQ21928(SEQ ID NO :11)、SQ20901 (SEQ ID NO :12)和探针6FAM -标记的PB10164(SEQ ID NO :13)，所述引物组在对来自大豆事件M0N87705的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时产生第一扩增子，从引物SQ21^8和 SQ20901及6FAM -标记的引物/探针PB10164的组合释放可判断大豆事件M0N87705的荧光信号；(b)进行核酸扩增反应，从而产生第一扩增子；(c)检测所述第一扩增子；和(d)使包含大豆DNA的样品接触引物组SQ21928(SEQ ID NO :11)和SQ21905(SEQ ID NO :15)和 VIC -标记的PB10335(SEQ ID NO 14)，当所述引物组在对来自大豆植物的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时产生第二扩增子，释放荧光信号，该荧光信号可判断与确认为大豆事件M0N87705的转基因插入的大豆基因组区域同源的野生型大豆基因组DNA ； (e)进行核酸扩增反应，从而产生第二扩增子；(f)检测所述第二扩增子；和(g)比较样品中的第一和第二扩增子，其中，两种扩增子的存在表明该样品对于转基因插入是杂合的。本发明的另一方面是一种测定大豆事件M0N87705的后代的接合性的方法，该方法包括(a)使包含大豆DNA的样品接触引物组SQ21928(SEQ ID NO :11)、SQ20901 (SEQ ID NO 12)和SQ21905(SEQ ID NO :15)，当该引物组在对来自大豆事件M0N87705的基因组 DNA的核酸扩增反应中使用时，由引物SQ21^8和SQ20901的组合产生可以判断大豆事件 M0N87705的第一扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生第一扩增子；(c)检测所述第一扩增子；(d)使包含大豆DNA的样品接触引物组SQ21^8和SQ21905，当该引物组在对来自大豆植物的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，由引物SQ21^8和SQ21905的组合产生第二扩增子，该扩增子可以判断与确认为大豆事件M0N87705的转基因插入的大豆基因组区域同源的野生型大豆基因组DNA ； (e)进行核酸扩增反应，从而产生第二扩增子；(f)检测所述第二扩增子；和(g)比较样品中的第一和第二扩增子，其中，两种扩增子的存在表明该样品对于转基因插入是杂合的。本发明还提供一种具有选自SEQ ID NO :1、2和18的DNA分子的组合物，其中，所述组合物是选自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化(texturized) 大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白和植脂奶油(whipped topping)的商品。本发明的另一方面是一种检测生物样品中是否存在可判断存在大豆事件 M0N87705的核苷酸序列的方法，包括检测核苷酸序列的存在，其中所述序列选自SEQ ID N0:l、2和18，其中所述生物样品选自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白和植脂奶油。提供了用于检测大豆样品中的大豆事件M0N87705的试剂盒，该试剂盒包含基于检测一种或多种SEQ ID N0:l、2和18所示的序列而设计的核苷酸组分。提供了用于检测大豆事件M0N87705的试剂盒，它使用由SEQ ID NO :3、4或5设计的引物。当使用所述试剂盒产生的扩增子包含一种或多种SEQ ID NO :1、2和18所列出的核苷酸序列时，该扩增子可判断 M0N87705。本发明的另一方面是一种产生包含改变的脂肪酸水平的大豆植物的方法，包括将包含大豆事件M0N87705的植物与缺乏大豆事件M0N87705的大豆植物杂交，以获得包含所述大豆事件M0N87705和改变的脂肪酸水平的植物，其中包含所述事件的种子的代表性样品以ATCC保藏号PTA-9241保藏。还提供了一种产生包含大豆事件M0N87705的大豆品种的方法，包括回交大豆事件M0N87769以产生所述品种，其中包含所述事件的种子的代表性样品以ATCC保藏号 PTA-9241 保藏。本发明的另一方面是一种大豆植物，其能够产生具有包含大约55-80%的油酸和少于8%的饱和脂肪酸的油组成的种子，其中所述油组成的遗传决定因素可从ATCC保藏号为PTA-9M1的大豆获得。还提供了一种由所述大豆植物的种子获得的油组合物和由所述油衍生的商品，选自烹饪用油、色拉油、起酥油、卵磷脂、无毒塑料、印刷油墨、润滑剂、蜡、液压流体、变压器流体、溶剂、化妆品、护发产品和生物柴油。本发明的油可以与其它油混合。在一个方面，基于体积或重量百分比，由本发明的植物产生的油或通过本发明的方法产生的油占任何产物的油成分的超过0.5%、1 %、5%、 10 %、25 %、50 %、75 %或90 %。在另一方面，油制品可以是混合的，并且可以占混合物的超过10%、25(%、35(%、50(%或75(% (体积)。由本发明的植物产生的油可以与一种或多种有机溶剂或石油馏出物混合。本发明的另一方面是大豆细胞的基因组，其包含所具有的序列选自SEQ ID NO :1、 2和18列出的序列的多核苷酸。本发明的另一方面是M0N87705的大豆植物或种子、或种子后代、或来源于该植物或种子的产物。用于种植或用于制造商品的出售种子是本发明的一方面。这些商品包括但不限于完整的或经过加工的大豆种子、动物饲料、植物油、粗粉、细粉、无毒塑料、印刷油墨、润滑剂、蜡、液压流体、变压器流体、溶剂、化妆品、护发产品、豆浆、大豆果仁酱、纳豆、豆豉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白、植脂奶油、 烹饪用油、色拉油、起酥油、卵磷脂、可食用全大豆(生的、烤的或作为青豆(edaman^))、豆奶、大豆酸奶、大豆干酪、豆腐、腐竹(yuba)和生物柴油。通过下面的详细描述，本发明的上述和其它方面将变得更加明显。


图1.用于产生大豆植物M0N87705的双元转化载体pM0N95^9的图谱。图2.在大豆事件M0N87705的基因组中转基因插入片段的组织[A]对应于形成 SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5之间的连接区的SEQ ID NO 1的相对位置；[B]对应于形成 SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5之间的连接区的SEQ ID NO 2的相对位置；[C]对应于SEQ ID NO 3的相对位置，SEQ ID NO 3是位于整合到事件M0N87705的基因组中的表达盒的任意分配的/指定的5'末端侧翼的大豆基因组序列；[D]对应于SEQ ID NO 4的相对位置， SEQ ID NO :4是位于整合到事件M0N87705的基因组中的表达盒的任意分配的/指定的3 ‘ 末端侧翼的大豆基因组序列；[E]代表包含SEQ ID NO :5的各种元件，并且是插入到事件 M0N87705的基因组中的表达盒的序列；[F]代表包含如图中从左至右示出的SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :4的连续序列，其中，如上所示，并入了 SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2,因为这些序列存在于事件M0N87705的基因组中。序列简要说明
SEQ ID NO 代表大豆基因组DNA与整合的T-DNA之间的5，左边界连接区的20 个核苷酸的序列。该序列对应于SEQ ID NO :6的3413至3432位。此外，SEQ ID N0:1(图 2的[A])是对应于SEQ ID N0:3([C]，见图2)的3432至3422位的核苷酸序列，和对应于 SEQ ID NO :5([E]，见图2)的1至10位的整合T-DNA的整合5，左边界。SEQ ID NO :2_代表整合的T-DNA与大豆基因组DNA之间的3，左边界连接区的 20个核苷酸的序列。该序列对应于SEQ ID NO 6的10664至10683位。此外，SEQ ID NO 2 ([B]，见图2)是对应于SEQ ID N0:5([E]，见图2)的7242至7251位的核苷酸序列，和对应于SEQ ID NO :4([D]，见图2)的1至10位的3，侧翼序列。SEQ ID NO :3_位于M0N87705的插入DNA侧翼、直到T-DNA插入的5，序列。SEQ ID NO :4_位于M0N87705的插入DNA侧翼、直到T-DNA插入的3，序列。SEQ ID NO :5_插入的T-DNA的序列，包括整合后的残余边界序列。SEQ ID NO :6_代表位于M0N87705的插入DNA侧翼的5，序列(SEQ ID N0:3)、整合的表达盒的序列(SEQ ID NO 5)和位于M0N87705的插入DNA侧翼的3，序列(SEQ ID NO 4)的叠连群的13188bp核苷酸序列。SEQ ID NO :7-代表通过pM0N95^9 T-DNA的共整合装配在M0N87705中的 aroA-CP4表达盒和FAD2-1A/FATB抑制盒的6583bp核苷酸序列。SEQ ID NO :8-用于鉴定M0N87705事件的引物SQ20129。引物SQ20U9对应于位于插入的T-DNA的3，侧的区域，该区域靠近对应于SEQ ID NO 6的10645至10663位的3， 左边界。使用引物SQ20U9和SQ20130的组合产生的PCR扩增子对于事件M0N87705的存在是阳性的。SEQ ID NO :9_用于鉴定M0N87705的引物SQ20130。引物SQ20130互补于位于 T-DNA插入边界的3，侧的区域，该区域对应于SEQ ID NO 6的10688至10707位。使用引物SQ20U9和SQ20130的组合产生的PCR扩增子对于事件M0N87705的存在是阳性的。SEQ ID NO 10-用于鉴定M0N87705事件的探针PB10043。该探针是6FAM -标记的合成寡核苷酸，其序列对应于SEQ ID NO 6的10666至10686位。在扩增反应中使用引物SQ20U9和SQ20130结合使用6FAM -标记的探针PB10043释放出荧光信号可判断事件 M0N87705。SEQ ID NO 11-用于鉴定M0N87705事件的引物SQ21928。引物SQ21^8互补于位于T-DNA插入边界的3，侧的区域，该区域对应于SEQ ID NO 6的10675至10699位。使用引物SQ20901和SQ21^8的组合产生的PCR扩增子对于事件M0N87705的存在是阳性的。 引物SQ21928也用于确定M0N87705事件的接合性。在接合性分析中使用6FAM -标记的探针PB10335和引物SQ21^8和SQ21905检测到PCR扩增子和释放出荧光信号对于野生型的存在是阳性的。该序列的18个碱基对对应于SEQ ID NO 6的第1053至1070位，其余7 个碱基对对应于SEQ ID NO 17所示的野生型序列的40碱基对区域中的7个碱基对，它在 M0N87705事件的产生过程中丢失。SEQ ID NO 12-用于鉴定M0N87705事件的引物SQ20901。引物SQ20901对应于位于插入的T-DNA的3，侧的区域，该区域靠近对应于SEQ ID NO 6的106 至10647位的3， 左边界。由引物SQ21^8和SQ20901的组合产生的PCR扩增子对于事件M0N87705的存在是阳性的。
SEQ ID NO 13-用于鉴定M0N87705事件的探针PB10164。该探针是6FAM -标记的合成寡核苷酸，其序列对应于SEQ ID NO 6的10651至10670位。在扩增反应中使用引物SQ21^8和SQ20901结合使用6FAM -标记的探针PB10164释放出荧光信号可判断事件 M0N87705。SEQ ID NO 14-用于确定M0N87705事件的接合性的探针PB10335。该探针是 VIC -标记的合成寡核苷酸，其序列对应于野生型基因组DNA的区域。在事件M0N87705的接合性分析中，使用引物SQ21^8和SQ21905产生的PCR扩增子导致使用探针PB10335释放荧光信号，该荧光信号对于野生型等位基因的存在是阳性的。该序列对应于如SEQ ID NO 17所列出的40碱基对野生型序列的12-31位，该区域在M0N87705事件的产生过程中丢失。SEQ ID NO :15_用于确定M0N87705事件的接合性的引物SQ21905。在接合性分析中使用6FAM -标记的探针PB10335和引物SQ21^8和SQ21905检测到PCR扩增子对于野生型的存在是阳性的。该序列的16个碱基对对应于SEQ ID NO 6的1037-1052位，该引物延伸10个碱基对进入SEQ ID NO 16列出的野生型序列的40碱基对区域，该区域在 M0N87705事件的产生过程中丢失。SEQ ID NO :16_在串联重复序列(SEQ ID NO 17)和5’基因组序列的连接处丢失的40个碱基对的序列。该序列在野生型中发现，并且位于SEQ ID NO 6的碱基对1052和 1053之间，在M0N87705事件的产生过程中不丢失。由于产生M0N87705事件时基因组序列的复制，序列末端12个碱基也位于SEQ ID NO 6的10670至10681处，但是其余28个碱基对在M0N87705中完全缺失，因此可以用来在接合性分析中鉴定野生型。SEQ ID NO :17_该2370bp序列是野生型基因组序列中在产生M0N87705事件时明显复制的部分。该复制区域对应于SEQ ID NO :6的1053至3422位，并且与SEQ ID NO: 6的10682至13051位几乎相同。与3’末端和大豆基因组序列相比，该区域的基于复制 Genomewalker 的克隆在位于插入片段5’末端的重复序列中具有两个错配。5’重复序列中两个改变的碱基以及在复制(SEQ ID NO :16)5’末端发现的缺失使我们另外得出对应于 1053至3422位的串联序列是新产生的序列，而对应于10682至13051位的序列是原野生型序列。SEQ ID NO :18-该106bp序列跨越在两个pM0N95^9 T-DNA共整合产生事件 M0N87705时产生的右边界与右边界的连接区。它开始和终止于抑制目标FATB的20个碱基，来自于反向重复的每个臂，并且含有在M0N87705事件中发现的序列整合中产生的残余边界序列和插入序列。该序列对应于SEQ ID NO :6的9230至9335位。尽管该序列位于抑制盒内，由于两个T-DNA体内装配的随机性质，该序列组合是M0N87705事件独特的。SEQ ID NO :19_在第二(巢式)PCR中使用的引物M894，与用于扩增 Genomewalker -衍生的5，侧面延伸的AP2组合使用。该序列对应于SEQ ID NO :6的3722 至3748位。SEQ ID NO :20_在第一 PCR中使用的引物M895，与用于扩增Genomewalker -衍生的5，侧面延伸的APl组合使用。该序列对应于SEQ ID NO 6的3798至3827位。发明详述提供下面的定义和方法以更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，可以根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术语。分子生物学中的常用术语的定义也可以在以下文献中找到=Rieger等人，Glossary of Genetics Classical and Molecular,第 5 版，Springer-Verlag :New York, 1991 ；禾口 Lewin, Genes V, Oxford University Press :New York,1994。如本文所用的术语“大豆”是指大豆(Glycine max)，且包括可用大豆培育的所有植物品种，包括野生大豆种以及那些属于允许种之间选育的野生大豆(Glycine soja)的植物。术语“草甘膦”是指N-膦酰基甲基甘氨酸及其盐。N-膦酰基甲基甘氨酸是公知的对于大范围植物物种具有活性的除草剂。“去饱和酶”是指能够去饱和或催化一种或多种脂肪酸的连续碳之间的双键形成， 以产生单不饱和或多不饱和脂肪酸或其前体的多肽。特别有意义的是能够催化油酸转化为亚油酸或亚油酸转化为α -亚油酸的多肽，包括在12或15位去饱和的酶。选择具有去饱和酶活性的特定多肽的考虑因素包括但不限于该多肽的最适ΡΗ、该多肽是否是限速酶或其成分、使用的去饱和酶是否是合成所需PUFA所必需的、和/或该多肽是否需要辅因子。表达的多肽优选地具有与其在宿主细胞中的位置的生化环境相容的特征。例如，该多肽可能必须竞争底物。内源去饱和酶也可以是基因抑制的目标。“硫酯酶”是指能够水解分子的硫酯键的多肽(在水的存在下，酯键分裂为酸和醇)，特别是在硫醇基处。特别有意义的是能够催化酰基-酰基-载体蛋白(酰基-ACP)、 特别是硬脂酰-和棕榈酰-ACP底物所含的硫酯键水解的多肽。这种水解产生游离脂肪酸和ACP，从而终止了位于植物质体中的脂肪酸生物合成，并且使脂肪酸准备好向细胞质输出。选择具有硫酯酶活性的特定多肽的考虑因素包括但不限于多肽的最适ΡΗ、该多肽是否是限速酶或其成分，以及使用的硫酯酶是否是提高饱和脂肪酸产量所必需的。表达的多肽优选地具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的特征。例如，该多肽可能必须竞争底物。内源硫酯酶也可以是基因抑制的目标。“商品”指任何由源自大豆或大豆油的材料组成的且向消费者出售的产品。加工的大豆是世界上蛋白质饲料和植物油的最大来源。大豆植物Μ0Ν87705可用于生产通常是由大豆获得的商品。Μ0Ν87705大豆可以加工成粗粉、细粉或油，以及用作用于陆生动物和水生动物的动物饲料中的蛋白质或油来源。来自Μ0Ν87705的大豆和大豆油可以用于生产许多不同的产品，不限于无毒塑料、印刷油墨、润滑剂、蜡、液压流体、变压器流体、溶剂、化妆品和护发产品。Μ0Ν87705的大豆和油适用于由全大豆制造的多种大豆食物，如豆奶、大豆果仁酱、纳豆和豆豉；和由加工的大豆和大豆油制造的各种大豆食物，包括大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白、植脂奶油、烹饪用油、色拉油、起酥油和卵磷脂。全大豆也是可食用的，且通常销售给消费者的是生的、烤的或是青豆。通常是由浸泡和磨碎全大豆生产的豆奶可以不经其它加工而食用，可以喷雾干燥， 或加工成大豆酸奶、大豆干酪、豆腐或腐竹。Μ0Ν87705的油可以用来制造生物柴油。在传统的柴油发动机中使用生物柴油与使用石油柴油燃料相比导致如硫酸盐、一氧化碳和颗粒物等污染物的大幅减少，且在校车中的使用可极大地减少与有毒的柴油机废气的接触。生物柴油通常通过以下步骤获得提取、过滤和精炼大豆油以除去游离的脂肪和磷脂，然后用甲醇对油进行酯交换以形成脂肪酸的甲酯(参见，例如，美国专利5，891，20 。产生的大豆甲酯通常被称为“生物柴油”。源自M0N87705的油也可以不形成甲酯而用作柴油机燃料，例如，通过混合缩醛和油(参见， 例如，美国专利6，013，114)。可以通过本发明的方法鉴定用于制造所述油的M0N87705的种子。预计从M0N87705事件种子或其中一部分是或全部是M0N87705的种子混合物纯化的油相对没有可用于测试的DNA。然而，从中提取油的种子可以用本发明的方法表征以鉴定 M0N87705事件在用于制造所述油的种子群中的存在。此外，用于制造所述油的工艺产生的植物废物可以用于本发明的方法中以鉴定M0N87705事件在进行加工以制造所述油的种子混合物中的存在。同样，在制造商品之后剩下的或在收获大豆种子后遗留的植物残渣可以用本发明的方法表征以鉴定用于制造所述商品的原料中的M0N87705事件。本发明还包括混合的或非混合的M0N87705的大豆油。这样的油可以与其它油混合。在一个优选实施方案中，基于体积或重量百分比，由本发明的植物产生的油或通过本发明的方法产生的油占任何产物的油成分的超过0. 5 %、1 %、5 %、10 %、25 %、50 %、75 % 或90%。在另一实施方案中，油制品可以是混合的，并且可以占混合物的超过101251 35%、50%或75% (体积)。由本发明的植物产生的油可以与一种或多种有机溶剂或石油馏出物混合。转基因“事件”是如下产生的用异源DNA(即，包括目标转基因的核酸构建体)转化植物细胞，再生由向植物基因组中插入转基因而产生的植物群体，和选择以插入特定基因组位置为特征的特定植物。术语“事件”指包含异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体和另一品种之间的有性远交产生的后代，其中所述后代包含异源DNA。甚至在与轮回亲本(recurrent parent)反复回交后，来自原始转化的插入DNA 和侧翼DNA可以存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件”也指来自包含插入DNA 和紧邻该插入DNA的侧翼基因组序列的原始转化体的DNA，预期其由于包含插入DNA的亲本系(例如，原始转化体和由自交产生的后代)和不包含插入DNA的亲本系的有性杂交而转移到接受了包含目标转基因的插入DNA的后代中。本发明涉及事件M0N87705 DNA、植物细胞、组织、种子和源自M0N87705的加工产品。也能够理解，两种不同的转基因植物、或转基因植物和野生型植物，也可以配种以产生含有两种独立分离的增加的外源基因的后代。该后代对于该基因而言可以是纯合的或杂合的。适当后代的自交可以产生对于两种增加的外源基因而言为纯合的植物。也考虑与亲本植物回交以及与非转基因植物远交，以及无性繁殖。常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可以在许多参考文献之一中找到，例如Fehr，in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed.，American Society of Agronomy, Madison WI(1987)。如本文中提及“分离的DNA分子”时，意思是DNA分子是单独或与其它成分组合存在的、但不存在于其自然环境中。例如，在大豆基因组DNA中天然存在的编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等，只要它们存在于大豆基因组内，就不被认为与大豆基因组分离。但是，只要其结构和组分不在大豆基因组内，那么这些组分和这些组分的子部分中的每一个在本发明的范围内就是“分离的”。对于本发明，任何转基因核苷酸序列，即插入大豆植物事件M0N87705的细胞基因组中的DNA的核苷酸序列，被认为是分离的核苷酸序列，不论它是存在于用于转化引起M0N87705事件的大豆细胞的质粒中，存在于事件M0N87705的基因组中，还是以可检测的量存在于源自事件M0N87705的组织、后代、生物样品或商品中。因此，如果DNA分子可以从来自植物或种子或植物器官的细胞或组织或勻浆中提取，或者可以作为扩增子从来自植物或种子或植物器官的细胞或组织或勻浆 (上述任一种都是源自事件M0N87705产生的材料)提取的DNA或RNA产生，那么核苷酸序列或任何由其获得的片段将被认为是分离的或可分离的。对于这个问题，SEQ ID NO 1,2 和18所示的连接序列和源自也包含这些连接序列的事件M0N87705的核苷酸序列被认为是分离的或可分离的，不论这些序列是存在于事件M0N87705的细胞的基因组中，还是以可检测的量存在于源自事件M0N87705的组织、后代、生物样品或商品中。本发明的DNA分子也可以是重组DNA分子。如本文所用的术语重组意思是任何物质(例如DNA、肽等)，它是，或者间接产生自核酸分子的人工操作。“探针”是其上附有常规可检测的标记或报告分子(如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶)的分离的核酸。这种探针与靶核酸的链互补，在本发明的情况中与大豆事件 M0N87705的基因组DNA的链互补，不论其来自于大豆植物还是来自包含来自该事件的DNA 的样品。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特异性地结合靶DNA 序列的聚酰胺和其它探针材料，并且这种结合可用于检测靶DNA序列的存在。“引物”是分离的核酸，其通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火以形成引物和靶 DNA链的杂合体，然后通过聚合酶(例如，DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸。本发明的引物对指它们用于靶核酸序列的扩增的应用，例如，通过聚合酶链反应(PCR)或其它常规核酸扩增方法。探针和引物的长度一般为11个或更多个核苷酸，优选为15个或更多个核苷酸，更优选为18个或更多个核苷酸，更优选为20个或更多个核苷酸，更优选为M个或更多个核苷酸，最优选为30个或更多个核苷酸。这样的探针和引物在高严格杂交条件下特异性地与靶序列杂交。优选地，本发明的探针和引物具有与靶序列的完全序列相似性，虽然可以通过传统方法设计不同于靶序列而保留与靶序列杂交的能力的探针。制备和使用探针和引物的方法在以下文献中描述，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二 版，第 1-3 卷，Sambrook 等人编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989 (下面简称为〃 Sambrook等人，1989 〃 )； Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人编著，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York，1992 (定期更新)(以下简称 “Ausubel 等人，1992”)；及 Innis 等人，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press San Diego, 1990。PCR引物对可以源自已知的序列，例如，通过使用用于该目的的计算机程序，如 Primer (Version 0. 5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)。本文公开的基于侧翼DNA和插入序列的引物和探针可以用于通过常规方法(例如，通过再克隆和测序这样的序列)确认(及如果必要，校正)公开的序列。本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法可以用于鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段在某些情况下能够特异性地与其它核酸分子杂交。如本文所用，如果两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，那么这两个分子被认为能够特异性地彼此杂交。如果两个核酸分子表现出完全的互补性，则一核酸分子被认为与另一核酸分子“互补”。如本文所用，当一个分子的每个核苷酸都与另一分子的核苷酸互补时，该分子被认为显示出“完全的互补性”。如果两个分子以足够的稳定性互相杂交从而允许它们在至少常规的“低严格”条件下保持彼此退火，那么这两个分子被认为是“最低限度互补的”。类似地，如果分子以足够的稳定性互相杂交从而允许它们在常规的“高严格”条件下保持彼此退火，那么分子是“互补的”。Sambrook 等人，1989 禾口 Haymes 等人，In :Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press,Washington,DC(1985)描述了常规的严格性条件。因而偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离没有完全消除该分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子用作引物或探针， 只需要在序列中充分互补以在所采用的特定的溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。如本文所用，基本上同源的序列是在高严格条件下与所比较的核酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列。促进DNA杂交的合适的严格条件，例如，大约45°C下6. Ox 氯化钠/柠檬酸钠(350，接着501下2.(^ SSC洗涤，是本领域的技术人员已知的，或可以在 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. , (1989), 6. 3. 1-6. 3. 6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50°C下大约2. Ox SSC的低严格条件到50°C下大约0. SSC的高严格条件中选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温 (大约22°C)的低严格条件增加到大约65°C的高严格条件。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度中的一个可以保持恒定，而另一个变量发生变化。在一个实施方案中，本发明的核酸在中等严格条件(例如，大约2. Ox SSC和大约65°C )下特异性地与SEQ ID NO 1和 SEQ ID NO :2所示的核酸分子或其互补序列或其中任一个的片段中的一个或多个杂交。在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸在高严格条件下特异性地与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核酸分子或互补序列或其中任一个的片段中的一个或多个杂交。在本发明的一方面，本发明的标记核酸分子具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段。在本发明的另一方面，本发明的标记核酸分子与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段共有80^^81%、 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97 %、98 %、99 %和100 %的序列同一性。在本发明的进一步的方面中，本发明的标记核酸分子与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段共有 95%、96%、97%、98%、99%和 100%的序列同一性。SEQ ID N0:liPSEQ ID N0:2 可以在植物育种方法中用作标记，以鉴定类似于〃 DNA markers protocols,applications,and overviews :(1997) 173-185, Cregan 等人编著，Wiley-Liss NY(本文通过引用引入)中对于简单序列重复DNA标记分析所描述的方法的遗传杂交的后代。可以通过本领域的技术人员已知的多种方法检测探针与靶DNA分子的杂交，这些方法可以包括但不限于，荧光标签、 放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。关于使用特定扩增引物对进行靶核酸序列的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件” 是使得引物对仅与具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物与之结合的靶核酸酸序列杂交的条件，并优选地在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物，扩增子。术语“对于(靶序列)特异性的”表示探针或引物在严格杂交条件下只与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”指作为核酸模板的部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定有性杂交产生的大豆植物是否含有来自本发明大豆植物的转基因事件基因组DNA，从大豆植物组织样品中提取的DNA可以使用一个引物对(该引物对包含源自与插入的异源DNA的插入位点邻近的植物基因组的侧翼序列的引物，和源自插入的异源DNA的第二引物)执行核酸扩增方法，以产生可判断该事件DNA的存在的扩增子。该扩增子具有特定长度，且具有也可判断该事件的序列。扩增子的长度范围可为引物对加上1 个核苷酸碱基对的组合长度，优选加上大约50个核苷酸碱基对，更优选加上大约250个核苷酸碱基对，甚至更优选加上大约450个核苷酸碱基对。可选择地，引物对可以源自位于插入的DNA两侧的侧翼序列，从而产生包含完整的插入核苷酸序列的扩增子。源自植物基因组序列的引物对的成员可能位于距离插入的DNA分子一定距离的位置，该距离范围可以是从1个核苷酸碱基对直到高达大约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用明确排除可能在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。可以通过本领域已知的各种核酸扩增方法中的任何一种，包括聚合酶连锁反应 (PCR)，实现核酸扩增。多种扩增方法是本领域已知的且在文献中有描述，特别是美国专利 4，683，195 禾口 4，683，202 及 PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Innis等人(编)，Academic Press, San Diego，1990。已经开发了 PCR扩增方法以扩增高达22kb的基因组DNA和高达42kb的噬菌体DNA (Cheng等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :5695-5699,1994)。这些方法以及DNA扩增领域内已知的其它方法可以用于实施本发明。可以通过使用源自本发明提供的序列的引物扩增来自所述事件的这种序列，接着对 PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序，来验证(如果必要，校正)来自种子样品已经作为ATCC PTA-9241保藏的大豆事件M0N87705的异源DNA插入序列或侧翼序列。可以通过多种技术检测由这些方法产生的扩增子。一种这样的方法是遗传位分析 (Genetic Bit Analysis) (Nikiforov等人，Nucleic Acid Res. 22 :4167-4175,1994)，其中设计了与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列重叠的DNA寡核苷酸。将该寡核苷酸固定在微孔板的孔中。继目标区域的PCR(使用插入序列中的一个引物和相邻的侧翼基因组序列中的一个引物)之后，可以将单链PCR产物与固定的寡核苷酸杂交，并用作使用 DNA聚合酶和对于预期的下一碱基特异性的标记ddNTP的单碱基延伸反应的模板。读数可以是荧光或基于ELISA的。信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而存在插入/侧翼序列。另一种方法是Winge(Innov. Pharma. Tech. 00 :18-24,2000)所描述的焦磷酸测序技术(Pyrosequencing technique)。在该方法中，寡核苷酸设计为与相邻的基因组 DNA和插入DNA的连接区重叠。将寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物(插入序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶 (sulfurylase)、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)、腺苷5，磷酰硫酸(adenosine 5' phosphosulfate)和萤光素的存在下孵育。单个地加入dNTP，掺入产生进行测量的光信号。光信号表明由于成功的扩增、杂交或多碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。如Chen等人(Genome Res. 9 :492-498,1999)所述的荧光偏振是一种可用于检测本发明的扩增子的方法。使用此方法，设计与基因组侧翼DNA和插入DNA的连接区重叠的寡核苷酸。将该寡核苷酸与目标区域的单链PCR产物(插入DNA中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下孵育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。可以使用荧光计作为偏振的变化而测定掺入。偏振的改变表明
16由于成功的扩增、杂交或单碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。TaqMan (PE Applied Biosystems,Foster City，CA)被描述为一种检测和定量 DNA序列的存在的方法，且根据制造商提供的说明书可以完全理解。简单地说，设计与基因组DNA和插入DNA的连接区重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针和PCR引物(插入DNA 序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环。FRET探针的杂交导致荧光部分从FRET探针上的猝灭部分切割和释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交而存在侧翼/转基因插入序列。如Tyangi 等人(Nature Biotech. 14 :303-308,1996)所述，分子信标被描述用于序列检测。简单地说，设计与侧翼基因组和插入DNA的连接区重叠的FRET寡核苷酸探针。 FRET探针的独特结构导致它含有保持荧光部分和猝灭部分紧密接近的二级结构。FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环。继成功进行PCR扩增之后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构丧失及荧光和猝灭部分的空间分离，这导致荧光信号的产生。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交而存在侧翼/转基因插入序列。描述的其它方法，如微流体技术(美国专利公开2006068398、美国专利 6, 544, 734)提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。光染料用于检测和定量特定的DNA 分子(W0/05017181)。包含用于检测DNA分子的电子传感器的纳米管装置(W0/060M023) 或结合特定的DNA分子然后可以被检测的纳米珠。可以使用本文公开的组合物和DNA检测领域公知的方法开发DNA检测试剂盒。该试剂盒可用于鉴定样品中的大豆事件M0N87705 DNA,且可以应用于培育含有适当的事件 DNA的大豆植物的方法。试剂盒可以包含与SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :5同源或互补的 DNA引物或探针，或与DNA的转基因遗传元件中包含的DNA同源或互补的DNA引物或探针。 这些DNA序列可以在DNA扩增反应中使用或在DNA杂交方法中用作探针。M0N87705大豆基因组中包含的基因组DNA和转基因遗传元件的序列在图2中显示；T-DNA中包含的转基因遗传元件如下进行组织第一 T-DNA开始于章鱼碱左边界序列，然后是包含来自玄参花叶病毒(FMV)的35S增强子和来自拟南芥Tsfl基因的启动子、内含子和前导序列的第一人工基因，该人工基因位于与优化aroA-CP4融合的SikG转运肽的上游，该融合的转运肽位于来自豌豆(Pisum sativum)的I bcS2 (E9)基因的3' UTR的上游，之后是包含来自β-伴大豆球蛋白基因的大豆7Sa ’亚基的启动子和前导序列的第二盒，其位于包含与大豆FAD2和 FATB基因同源的序列的反向重复的有义半部分的上游，该半部分位于胭脂碱右边界序列的上游。第二 T-DNA开始于胭脂碱右边界序列，其位于包含与大豆FAD2和FATB基因同源的序列的反向重复的反义半部分的上游，该半部分位于Gossypium bartadense (海岛棉)H6 基因的3’ UTR的上游，该3’ UTR位于章鱼碱左边界序列的上游。来源于这些序列的引物分子可以用作引物组的部分，该引物组还包括源自位于SEQ ID NO :3和SEQ ID N0:4所示的事件M0N87705转基因插入序列的侧翼的基因组的DNA引物分子。本发明包括一种大豆植物，其包含含有多核苷酸的DNA分子，该多核苷酸具有是选自SEQ ID NO :1、2和18的序列或互补于该序列的序列。在另一方面，本发明包括大豆植物部分，其中该植物部分包含多核苷酸，该多核苷酸具有是选自SEQ ID N0:l、2和18的序列或互补于该序列的序列。在另一方面，本发明包括大豆植物的后代，其中该后代包含多核苷酸，该多核苷酸具有是选自SEQ ID NO :1、2和18的序列或互补于该序列的序列。本发明还包括一种大豆植物，其能够产生具有包含大约55-80%的油酸和低于 8%的饱和脂肪酸的油组成的种子，其中所述油组成的遗传决定因素可以从ATCC保藏号为 PTA-9241的大豆获得。在另一方面，本发明包括产生包含改变的脂肪酸水平的大豆植物的方法，包括将包含大豆事件M0N87705的植物与缺乏大豆事件M0N87705的大豆植物杂交， 以获得包含所述大豆事件M0N87705和改变的脂肪酸水平的植物，其中包含所述事件的种子的代表性样品以ATCC保藏号PTA-9241保藏。在进一步的方面，本发明还包括产生包含大豆事件M0N87705的大豆品种的方法，包括回交大豆事件M0N87769以产生所述品种，其中包含所述事件的种子的代表性样品以ATCC保藏号PTA-9241保藏。本发明还包括从种子获得的油组合物，该种子包含含有多核苷酸的DNA分子，该多核苷酸具有是选自SEQ ID NO :1、2和18的序列或互补于该序列的序列。在另一方面，本发明包括由油组合物衍生的商品，选自烹饪用油、色拉油、起酥油、卵磷脂、无毒塑料、印刷油墨、润滑剂、蜡、液压流体、变压器流体、溶剂、化妆品、护发产品和生物柴油。本发明还包括一种含有多核苷酸的DNA分子，该多核苷酸具有是选自SEQ ID NO 1、2和18列出的序列或互补于该序列的序列。在另一方面，本发明包括分离的DNA分子， 该DNA分子包含选自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的至少大约11个至大约20个连续核苷酸。本发明还包括含有多核苷酸的大豆细胞的基因组，该多核苷酸具有选自SEQ ID NO 1、2和18列出的序列的序列。在另一方面，本发明包括检测生物样品中大豆事件M0N87705DNA的存在的方法， 包括使样品接触探针，该探针在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2及其互补序列的序列杂交，并且在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 及其互补序列的序列的大豆植物基因组DNA杂交；使样品和探针经受严格杂交条件；以及检测探针与样品的结合，其中结合可判断该样品中存在所述DNA。在另一方面，本发明包括检测生物样品中是否存在判断存在大豆事件M0N87705 的核苷酸序列的方法，包括检测核苷酸序列的存在，其中所述序列选自SEQ ID N0:l、2和 18，其中所述生物样品选自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白和植脂奶油。本发明也包括用于检测大豆样品中是否存在大豆转基因事件M0N87705的试剂盒，其包含基于检测一种或多种SEQ ID N0:l、2和18所示的序列而设计的核苷酸组分。在另一方面，本发明也包括具有选自SEQ ID NO :1、2和18的DNA分子的组合物，其中所述组合物是选自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、 水解大豆蛋白和植脂奶油的商品。本文包括下面的实施例来证明本发明的某些优选实施方案的实施例。本领域的技术人员应该理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现在实施本发明中运用良好的技术，因此可以被认为是构成实施本发明的优选方式的实施例。然而，本领域的技术人员根据本公开内容应该理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，而且仍然获得相同或类似的结果。实施例实施例1 用pM0N95^9转化大豆A3525及事件选择通过用源自pM0N95^9 (图1)的DNA片段对大豆细胞进行土壤杆菌介导的转化生成转基因大豆植物M0N87705。双元植物转化载体pM0N95^9包含两个植物转化T-DNA。每个T-DNA在T-DNA的末端侧翼为右边界(RB)和左边界(LB)序列。M0N87705的转化后筛选鉴定了两个T-DNA的右边界至右边界的共整合，产生了两个盒插入，一个设计为表达来自根癌土壤杆菌的提供草甘膦抗性的aroA-CP4基因，另一个用反向重复设计以引发基于 RNAi的对内源FAD2和FATB基因(SEQ ID NO 7)的抑制。反向重复结构在pM0N95^9中没有发现，而是两个T-DNA的RB至RB共整合形成的。这种整合构型产生了既含有表达盒又含有抑制盒的单转基因基因座，其侧翼为残余左边界序列(图幻。在RB:RB整合位点产生的独特序列在SEQ ID NO 18下列出。T-DNA如下进行组织第一 T-DNA开始于章鱼碱LB序列，然后是包含来自玄参花叶病毒(FMV)的35S增强子和来自拟南芥Tsfl基因的启动子、内含子和前导序列的第一人工基因，该人工基因位于与优化aroA-CP4融合的SikG转运肽的上游，该融合的转运肽位于来自豌豆(Pisum sativum)的I bcS2 (E9)基因的3 ‘ UTR的上游，之后是包含来自β-伴大豆球蛋白基因的大豆7Sa ’亚基的启动子和前导序列的第二盒，其位于包含与大豆FAD2 和FATB基因同源的序列的反向重复的有义半部分的上游，该半部分位于胭脂碱RB序列的上游。第二 T-DNA开始于胭脂碱RB序列，其位于包含与大豆FAD2和FATB基因同源的序列的反向重复的反义半部分的上游，该半部分位于Gossypium bartadense (海岛棉)H6基因的3’ UTR的上游，该3’ UTR位于章鱼碱LB序列的上游。通过根癌土壤杆菌介导的转化获得用pM0N95^9转化的外植体。由转化的组织再生植物。产生大约955个RO转化事件，并通过hvaderK(Third Wave Technologies, Inc., Madison, WI)检测两个T-DNA的存在。另外，为鉴定RB:RB构型而设计的PCR用于选择正确装配的候选事件。使证明有T-DNA正确共整合的RO事件自花授粉以产生Rl种子。通过 FAME-GC分析确定Rl种子的脂肪酸组成。基于这些分析，48个事件被转入到R2代。到R3 代，多拷贝事件的分离和表型表征将候选事件池缩小到11个事件。进行设计用来证实拷贝数、盒完整性、不希望的载体序列的基因座和缺失的详细 Southern分析。在后面的几代中，也确定了田间表现特性以及位于其余事件的插入位点侧翼的序列。基于其总脂肪酸组成谱(表1)、农艺学表现和分子特征选择被命名为事件 M0N87705的一个后代系。表1脂肪酸组成谱(总脂肪酸的重量％ )
大豆系16:018:018:118:218:3野生型12.24.219.054.98.0MQN877052.53.472.812.37.4
实施例2 使用反向PCR分离侧翼序列使用 Ochman 等人，1990 (PCR Protocols :A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.)所述的反向 PCR 及通过 TAIL (Thermal Asymmetric InterLaced) PCR确定M0N87705中T-DNA插入的侧翼序列。从野生型A3525和来自温室条件下生长的组织的转基因系分离植物基因组DNA。冷冻的叶组织用研钵和研杵与液氮研磨或机械研磨。将22mL体积的提取缓冲液加至约Ig磨碎的叶组织中，并在65°C下温育1小时。CTAB 提取缓冲液由 1.4M NaCl,2% CTAB、20mM EDTA 禾口 IOOmM Tris-HCl pH 8.0 组成。 在使用前，向提取缓冲液中添加0.02% β-巯基乙醇和0. 5mg RNase Α。用12mL苯酚/氯仿/异戊醇05 24 1)溶液提取样品，然后在4°C下以4000x G离心10分钟。将上清液转移到新的试管中，用15mL异丙醇沉淀DNA。以4000x G离心10分钟后，沉淀物用5mL 70%乙醇洗涤。最后以4000x G离心5分钟；将沉淀物风干，然后重悬浮于300μ L水中。DNA等分试样进行TAIL PCR，分离与插入位点相邻的序列的区域并测序。另外， 用基于T-DNA的限制分析选择的限制性内切酶消化DNA等分试样。经过限制性片段的自身连接后，使用由T-DNA序列设计的引物进行PCR，该引物会扩增由T-DNA的5’和3’端延伸的序列。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒Oiiagen， Valencia, CA)纯化。直接使用标准测序方案对随后的产物测序。使用Genomewalker 试剂盒(Clontech, Mountain View, CA)进行初始侧翼序列远离T-DNA的5，末端的延伸。在巢式PCR中，采用标准方案条件，使用如SEQ ID N0:19和 SEQ ID No :20所示的引物以及提供的APl和AP2引物。反应一式两份进行，将产物进行克隆，并使用标准测序方案直接测序。将序列与重复实验、现有基因组序列和3’侧翼序列进行比较，以确定PCR引起的错误导致的实际多态性。显然在产生M0N87705事件时发生了染色体复制。该复制区域(SEQ ID N0:17)对应于SEQ ID NO :6的1053至3422位，并且与 SEQ ID NO :6的10682至13051位几乎相同。我们已经确定在位于插入片段5，末端的重复与插入片段的3’末端的重复之间存在两个多态性，插入片段的3’末端与原基因组序列匹配。采用这些方法，鉴定的插入的5’侧翼序列表示为SEQ ID NO :3 (参见图2)，3’侧翼序列表示为SEQ ID N0:4(参见图2)。来自完全整合进入A3525基因组DNA中的pM0N95^9 的插入盒(SEQ ID NO 7)的部分表示为SEQ ID NO :5(参见图2)。将分离的序列与T-DNA序列进行比较，以鉴定侧翼序列和共分离的T-DNA片段。通过使用基于推导的侧翼序列数据和已知的T-DNA序列设计的引物进行PCR以确认表达盒的存在。使用由M0N87705中的侧翼序列设计的引物，分离对应于T-DNA整合到转化系中的同一区域的A3525野生型序列。相对于多个核苷酸和蛋白质数据库分析M0N87705中的侧翼序列和A3525野生型序列。该信息用于检查转基因与植物基因组的关系，并观察插入位点的完整性。利用侧翼序列和野生型序列设计用于如实施例3所述的用来鉴定事件和确定接合性的TaqMan端点分析的引物。实施例3 事件特异性的端点TaqMan和接合性分析用来鉴定样品中的事件M0N87705的方法是事件特异性的端点TaqMan PCR分析，其条件的例子在表2和表3中列出。可用于该端点分析的第一组DNA引物是引物 SQ20129(SEQ ID NO :8)、SQ20130 (SEQ ID NO :9)和 6FAM 标记的引物 PB10043 (SEQ ID NO:
2010)。可用于该端点分析的第二组DNA引物是引物SQ21928 (SEQ ID NO: 11)、SQ20901 (SEQ ID NO 12)和 6FAM 标记的引物 PB10164(SEQ ID NO :13)。6FAM 是连接至Ij DNA 引物上的 Applied Biosystems (Foster City, CA)的荧光染料产品。对于 TaqMan MGB (小沟结合)探针，Taq DNA聚合酶的5’核酸外切酶活性在荧光团和猝灭剂之间从5’-末端切割探针。当与靶DNA链杂交时，猝灭剂和荧光团充分分离从而产生荧光信号。当如前所述与PB10043(SEQ ID NO :10) —起使用时，SQ20129 (SEQ ID NO :8)和 SQ20130(SEQ ID NO :9)产生可判断事件M0N87705 DNA的DNA扩增子。当如前所述与 PB10164(SEQ ID NO :13)—起使用时，SQ21^8 (SEQ ID NO :11)和 SQ20901 (SEQ ID NO :12) 产生也可判断事件M0N87705 DNA的DNA扩增子。用于这些分析的对照应包括来自已知包含事件M0N87705 DNA的大豆的阳性对照、来自非转基因大豆的阴性对照和不包含模板DNA 的阴性对照。可以对SEQ ID NO :18设计类似的分析。优化这些分析以用于 Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700、 Stratagene Robocycler> MJ Engine、Perkin-Elmer 9700 或 Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪。本领域技术人员已知产生鉴定事件M0N87705 DNA的扩增子的其它方法和仪器。^ffi I^TiIif ^t Stratagene Robocycler>MJ Engine^Perkin-Elmer 9700、 Eppendorf Mastercycler Gradient 热循环仪、Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 或 MJ Research DNA Engine PTC-225 热循环仪中进行 DNA 扩增。当在 Eppendorf Mastercycler Gradient或MJ Engine中运行PCR时，热循环仪应该以计算模式运行。当在 Perkin-Elmer 9700中运行PCR时，热循环仪以设定为最大值的变温速度运行。表2.大豆M0N87705事件特异性的端点TaqMan PCR分析
权利要求
1.一种大豆植物，其包含含有多核苷酸的DNA分子，该多核苷酸具有是选自SEQ ID NO :1、2和18的序列或互补于该序列的序列。
2.如权利要求1所述的大豆植物的植物部分，其中所述植物部分包含多核苷酸，该多核苷酸具有是选自SEQ ID NO :1、2和18的序列或互补于该序列的序列。
3.如权利要求1所述的大豆植物的后代，其中所述后代包含多核苷酸，该多核苷酸具有是选自SEQ ID NO :1、2和18的序列或互补于该序列的序列。
4.一种大豆植物，其能够产生具有包含大约55-80%的油酸和少于8%的饱和脂肪酸的油组成的种子，其中所述油组成的遗传决定因素可从ATCC保藏号为PTA-9241的大豆获得。
5.一种产生包含改变的脂肪酸水平的大豆植物的方法，包括将包含大豆事件 M0N87705的植物与缺乏大豆事件M0N87705的大豆植物杂交，以获得包含所述大豆事件 M0N87705和改变的脂肪酸水平的植物，其中包含所述事件的种子的代表性样品以ATCC保藏号PTA-9241保藏。
6.一种产生包含大豆事件M0N87705的大豆品种的方法，包括回交大豆事件M0N87769 以产生所述品种，其中包含所述事件的种子的代表性样品以ATCC保藏号PTA-9241保藏。
7.从权利要求1所述的大豆植物的种子获得的油组合物。
8.由权利要求7所述的油衍生的商品，选自烹饪用油、色拉油、起酥油、卵磷脂、无毒塑料、印刷油墨、润滑剂、蜡、液压流体、变压器流体、溶剂、化妆品、护发产品和生物柴油。
9.一种包含多核苷酸的DNA分子，该多核苷酸具有是选自SEQ ID N0:l、2和18列出的序列或互补于该序列的序列。
10.一种分离的DNA分子，该DNA分子包含选自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的至少大约11个至大约20个连续核苷酸。
11.包含多核苷酸的大豆细胞的基因组，所述多核苷酸具有选自SEQID N0:l、2和18 列出的序列的序列。
12.—种检测生物样品中大豆事件M0N87705DNA的存在的方法，包括i.使样品接触探针，该探针在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2及其互补序列的序列杂交，并且在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO: 2及其互补序列的序列的大豆植物基因组DNA杂交； .使所述样品和所述探针经受严格杂交条件；和iii.检测所述探针与所述样品的结合；其中结合则判断所述样品中存在所述DNA。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述DNA引物对包含含有SEQID NO :3和SEQ ID NO 5的至少11个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述DNA引物对包含含有SEQID NO :5和SEQ ID NO 4的至少11个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述DNA引物对包含含有SEQID NO 5的至少11 个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列，其中一条引物来源于位于SEQ ID N0:18的5’ 侧的序列，另一条引物来源于位于SEQ ID NO 18的3，侧的序列。
16.一种检测生物样品中是否存在判断存在大豆事件M0N87705的核苷酸序列的方法，包括检测核苷酸序列的存在，其中所述序列选自SEQ ID NO :1、2和18，其中所述生物样品选自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白和植脂奶油。
17.一种用于检测大豆样品中是否存在大豆转基因事件M0N87705的试剂盒，其包含基于检测一种或多种SEQ ID NO :1、2和18所示的序列而设计的核苷酸组分。
18.用于检测生物样品中大豆事件M0N87705的存在的如权利要求17所述的试剂盒，其中所述试剂盒采用包括以下步骤的方法i.使样品接触DNA引物对； .进行核酸扩增反应，由此产生扩增子；和iii.检测所述扩增子，其中所述扩增子包含一种或多种SEQ ID N0:l、2和18所列出的序列。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其中所述DNA引物对包含来源于SEQID NO :3和SEQ ID NO 5的核苷酸序列。
20.如权利要求18所述的试剂盒，其中所述DNA引物对包含来源于SEQID NO :5和SEQ ID NO 4的核苷酸序列。
21.如权利要求18所述的试剂盒，其中所述DNA引物对包含SEQID NO :5的核苷酸序列，其中一条引物来源于位于SEQ ID NO: 18的5’侧的序列，另一条引物来源于位于SEQ ID NO 18的3，侧的序列。
22.具有选自SEQID NO :1、2和18的DNA分子的组合物，其中所述组合物是选自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白和植脂奶油的商品。
全文摘要
本发明提供了转基因大豆事件MON87705以及包含可判断该大豆事件的DNA的细胞、种子和植物。本发明还提供了包含可判断样品中所述大豆事件的核苷酸序列的组合物，用于检测样品中所述大豆事件核苷酸序列的存在的方法，用于检测可判断样品中所述大豆事件的存在的核苷酸序列的探针和引物，培育这种大豆事件的种子成为大豆植物的方法，和产生包含可判断该大豆事件的DNA的大豆植物的育种方法。
文档编号A01H5/00GK102164476SQ200980138582
公开日2011年8月24日 申请日期2009年9月28日 优先权日2008年9月29日
发明者E·J·古西, N·瓦格纳, P·D·罗伯斯, W·C·伯恩斯 申请人:孟山都技术公司