水稻胚乳特异表达基因的启动子及表达模式鉴定的制作方法

专利名称：水稻胚乳特异表达基因的启动子及表达模式鉴定的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及到水稻中同一胚乳特异性表达基因 的不同长度启动子区域的分离克隆及表达模式鉴定。
背景技术：
通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好 的应用前景。自1983年获得第一株转基因烟草以来(Zambryski et al.，1983)，在近30年 的时间里，植物基因工程的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为现代生物学和育种学中 一项重要的方法和技术。但是在其广泛运用的过程中也逐渐暴露了一些问题。其中之一就 是现阶段研究中经常用组成型启动子来驱动外源基因表达，由于组成型启动子会使驱动的 目的基因在植物各组织中恒定而持续的表达，从而过度消耗细胞内的物质和能量，并且不 能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达，所以有时会带来一些负面效应。如外源基 因在整株植物中表达，产生的大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原 有的代谢平衡，不利于产量和品质的提高；有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了 植物的正常生长,甚至导致死亡(Karlowsikiand Hirsch, 2003 ；Ehsani et al. ,2003) 如 利用组成型启动子表达病毒衣壳蛋白，就可能会引起病毒农壳转移，从而导致植物病毒新 株系的产生(Robinson，1996)，因此也引起了一些安全性方面的思考。另外，重复使用同一 种组成型启动子驱动两个或两个以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或共抑制现象 (Kumpatlaet al.，1998)，所以给多基因转化也带来了不少麻烦。因此，启动子在植物基因 工程中的研究地位也越来越突出。研究者们通过寻找更为有效的组织、器官特异性表达启 动子或者是诱导表达启动子来代替组成型启动子，以期更好地调控植物基因表达。诱导型 启动子虽然优点突出，利用诱导型启动子获得转基因植株尽管也有一些报导，但到目前为 止能用于生产实际的还比较少，而组织器官特异表达的启动子有望用于生产实际则有一些 较成功的例子(Cai et al.，2007 ；Ye et al. ,2009) 所谓组织特异型启动子是指除具有一般启动子的结构外，通常还有增强子和沉默 子的一般特性。在组织特异型启动子调控下，基因的表达常常只发生在某些特定的器官或 组织部位，并常常表现出发育调节的特性。这些启动子的调控往往受到组织细胞生理状态 和化学物理信号等物质的诱导，还受到发育阶段的调控，其表达是多种因子相互作用的结^ ο果实和种子是植物的生殖器官，也是营养物质主要的储藏场所。利用果实或种 子等器官特异性启动子调控基因表达，不仅可提高基因在这些部位的表达量，将生物能耗 降到最低，利于表达产物的分离，而且可有目的地提高转基因植物果实或种子的营养或改 善其品质。Sandhu等利用E8启动子(成熟果实中乙烯应答性基因的启动子)驱动呼吸 道合胞病毒F抗原基因成功转化番茄植株，用果实特异表达抗原喂饲小鼠，可诱导小鼠产 生特异的粘膜免疫反应、血清学抗体反应及THl型细胞免疫反应(Sandhu et al.，2000)。 Vasconcelos等用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因，使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加，而且铁蛋白主要积累在胚乳中，不会在食品加工过程中丢失(Vasconcelos et al.，2003)。研究人员在一些单子叶植物的种子储藏蛋白中也分 离了一些胚乳特异表达的顺式作用元件，最著名的GCN4元件被认为对维持胚乳特异表达 活性是必须的(Wu et al.，1998)。但也有文献报导，GCN4元件仅仅是起到增强启动子在 胚乳中的表达强度的作用，其并不能决定启动子胚乳特异表达的特性(Vickers et al., 2006)。另外，一些种子中特异表达的启动子如PsGNS2启动子(Buchner et al. ,2002), FAEl (Rossak et al. ,2001)启动子等也有相关的报导。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是禾本科作物功能基因组学研究的模式植 物。启动子是精确调控基因表达的“开关”。因此对水稻组织器官特异表达启动子的分离克 隆及深入研究，不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，还可以指导转基因 育种，创造巨大的经济效益和社会效益，更好的为人类生产生活服务。本发明就是利用有关 分子生物学方法，从水稻“明恢63”基因组中分离克隆了同一个胚乳特异表达基因上游不同 长度的启动子区域，将不同长度的启动子融合报告基因GUS导入水稻“中花11”中，验证其 表达模式，进而鉴定出控制表达量及表达模式区段。

发明内容
本发明的目的在于克服现有可用于水稻基因工程研究的组织特异表达启动子数 目的不足，从水稻“明恢63” (我国广泛应用的优良水稻恢复系)基因组中分离并鉴定出胚 乳特异表达的启动子，有望将这些启动子用于水稻的基因工程改良。为了便于研究利用，我 们创建了 EnP3、EnP3-859、EnP3_678、EnP2_471、EnP3_292 和 EnP3_110 共 6 个不同长度的 启动子。将这些启动子融合报告基因葡糖醛酸酶基因(以下简称GUS基因)导入水稻 “中花11”(中国农业科学院作物研究所商业经营品种)中，验证其表达模式，并进行表达量 的测定，为日后利用该启动子奠定了基础。本发明是这样实现的(本发明的技术路线见图1)利用华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数据 库 CREP(http://cr印.ncpgr. cn) (Wang et al.，2010)及反转录 PCR (以下简称 RT-PCR)等 方法，从水稻“明恢63”(我国广泛推广应用的优良水稻恢复系)基因组中分离并鉴定出 具有胚乳特异性表达的启动子。申请人将其命名为EnP3、EnP3-859、EnP3_678、EnP3_471、 EnP3-292和EnP3_110。所述的启动子EnP3序列，它是序列表SEQ ID NO 1所示的序列。 通过分析该启动子驱动GUS报告基因在转基因水稻中的表达模式发现该启动子仅在转化 植株的胚乳表达，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势；在其他组织如 叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达。所述的启动子EnP3-859、EnP3-678、 EnP2-471 和EnP3-292序列，分别是序列表SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5所示的序列，它们分别是由启动子EnP3截短的核心区859bp、678bp、471bp及292bp 的序列。这4个片段均具有独立的启动基因表达的功能，并且在转化植株中的表达模式与 EnP3相同，即仅在胚乳表达，不过表达量各有区别。所述的启动子EnP3-110序列，它是序列 表SEQ ID NO 6所示的序列，是由EnP3-292进一步截短的IlObp的序列，分析其驱动⑶S 报告基因在转基因水稻中表达情况发现，这个区段的表达模式发生了显著的改变在叶片、 叶鞘、茎杆及颖壳这些绿色组织中可以检测到表达，但是在根、花及种子(包括胚和胚乳)中却检测不到表达，成为一个短的绿色组织特异表达启动子。本发明的具体步骤是首先在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数 据库CREP(http://cr印.ncpgr.cn) (Wang et al. ,2010)上发现了一个可能是胚乳特异表 达的候选基因，在美国国立生物研究所网站NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上获 得该基因的序列，如SEQ ID NO 7所示，共459bp，以这459bp的序列设计引物来做RT-PCR 反应从而进一步确定其表达谱，RT-PCR结果显示(见图2)该基因仅在胚乳中表达。在此 基础上用特异性引物以PCR的方法从水稻“明恢63”基因组中扩增得到一个被命名为EnP3 的启动子候选片段，将该启动子候选片段EnP3与报告基因GUS编码序列构建成融合基因 并装载到双元Ti载体DX2181(载体图及多克隆位点等信息见图3 )上，装配成EnP3-GUS 载体(见图4)，再通过农杆菌介导的遗传转化方法，将EnP3-GUS载体转入水稻受体“中 花11”中，同时转化空载体DX2181作为阴性对照，转化花椰菜花叶病毒35S启动子驱动 ⑶S(CaMV35S-GUS)作为阳性对照。获得转基因植株后通过细织化学染色及⑶S活性定量 分析，考察该启动子在胚乳发育各时期的表达变化，进而验证和克隆该启动子。检测结果表 明该启动子仅在转化植株的胚乳表达，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下 降趋势；在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达。采用片段缺失 的方法，我们构建了 5个来源于EnP3的5’端缺失片段连接GUS的表达载体，同样通过农杆 菌介导的遗传转化方法将其转入水稻受体“中花11”中，分析这5个片段的表达模式，结果 显示来源于启动子EnP3的4个区段(EnP3-859、EnP3_678、EnP3_471和EnP3_292)均具 有独立的启动基因表达的功能，并且在转化植株中的表达模式与EnP3相同，即仅在胚乳表 达，不过表达量各有区别；由EnP3-292进一步截短的EnP3-110区段的表达模式发生了显 著的改变在叶片、叶鞘、茎杆及颖壳这些绿色组织中可以检测到表达，但是在根、花及种子 (包括胚和胚乳)中却检测不到表达，成为一个短的绿色组织特异表达启动子。本发明的优点在于(1)本发明鉴定了胚乳特异表达的启动子EnP3及控制其表达量及表达模式的核 心区域，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。(2)本发明可以直接应用于水稻胚乳特异表达的启动子的鉴定和克隆。


序列表SEQ ID NO :1，公开了本发明克隆的的水稻胚乳特异表达启动子EnP3的核 苷酸序列，长度为1040bp。序列表SEQ ID NO :2是从所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作为另一 个启动子应用的核苷酸序列，长度为859bp。序列表SEQ ID NO :3是从所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作为另一 个启动子应用的核苷酸序列，长度为678bp。序列表SEQ ID NO :4是从所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作为另一 个启动子应用的核苷酸序列，长度为471bp。序列表SEQ ID NO :5是从所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作为另一 个启动子应用的核苷酸序列，长度为292bp。
序列表SEQ ID NO :6是从所述的SEQ ID NO :1核苷酸序列的克隆得到的作为另一 个启动子应用的核苷酸序列，长度为UObp。序列表SEQ ID NO 7是本发明克隆的水稻胚乳特异表达启动子EnP3在基因组中 所驱动的基因(Genebank登录号为GI =31415924)的核苷酸序列，长度为459bp。序列表SEQ ID NO 8是本发明克隆的水稻胚乳特异表达启动子EnP3在基因组中 所驱动的基因(Genebank登录号为GI =31415924)编码的氨基酸序列，长度为134个氨基酸。图1 :实现本发明的技术路线图。图2 利用RT-PCR的方法来分析EnP3在基因组中所驱动的基因(GI =31415924) 的表达模式。上下列分别表示的为内参水稻Actinl基因和目的基因(GI =31415924)在各 个组织中的表达情况。图3 表示双元载体DX2181结构示意图。该载体是在pCAMBIA1380的基础上改造 而来，在多克隆位点处以相反的方向分别构建了一个GUS基因和EGFP基因。图4 构建好的以DX2181为骨架的表达载体简图。a为阴性对照，即DX2181空载 体，无启动子驱动⑶S基因表达；b为阳性对照，即用CaMV35S启动子来驱动⑶S基因表达； c为EnP3及其系列缺失片段来驱动⑶S基因表达。LB、RB分别为DX2181中T-DNA的左边 界和右边界；hyg为潮霉素抗性筛选基因；gus为报告基因GUS ( β -葡萄糖苷酸酶)；egfp 为报告基因EGFP (增强的绿色荧光蛋白)；MCS表示多克隆位点；35sP表示CaMV35S启动子 (花椰菜花叶病毒35S启动子)；EnP3-X表示EnP3及其系列缺失片段；箭头方向表示基因 或启动子表达的方向。图5 由EnP3驱动⑶S基因的转化植株的各个组织的组织化学染色。a为叶片；b 为叶鞘；c为茎杆；d为根；e为花；f为种子(含胚与胚乳)。图6 由EnP3及其系列缺失片段驱动GUS基因的转化植株的成熟种子的组织化 学染色。a、b、c、d、e、f 分别表示的是启动子片段 EnP3、EnP3_859、EnP3_678、EnP3_471、 EnP3-292和EnP3_110的表达情况，图中En表示胚乳，Em表示胚。图7 由EnP3-110驱动⑶S基因的转化植株的各个组织的组织化学染色。a为叶 片；b为叶鞘；c为茎杆；d为根；e为花；f为种子(含胚与胚乳)。图8 由EnP3-110驱动⑶S基因的转化植株的各个组织的⑶S活性定量检测， DX2181表示阴性对照。图9 由EnP3及其系列缺失片段驱动GUS基因的转化植株的胚乳在不同发育时期 的⑶S活性定量检测。图例中的DAF表示开花后天数(days after flowering) ；DX2181表 示阴性对照。
具体实施例方式实施例1 胚乳特异表达候选基因(Genebank登录号为GI =31415924)的表达谱验 证材料准备本实施例所用材料是籼稻品种(Oryza sativa ssp. Indica)明恢 63 (我国广泛应用的优良水稻恢复系)，种植方法是水培。营养液成分如下所示1.44mM NH4NO3, 0. 3mM NaH2PO4, 0. 5mM K2SO4,1. OmM CaCl2, 1. 6mM MgSO4, 0. 17mM NaSiO3, 50 μ mFe-EDTA，O. 06 μ M (NH4)6Mo7O24,15 μ M H3BO3, 8 μ MMnCl2, 0. 12 μ M CuSO4, 0. 12 μ M ZnSO4, 29 μ M FeCl3,40. 5μ M Citric acid, ρΗ5. 5 (Yoshida et al.，1976)。在孕穗期取叶片、 叶鞘、茎杆、根、穗，受精14天后取胚乳。RNA提取采用Trizol Reagent (Invitrogen, Carisbad,CA,USA)方法。总RNA经1. 4%琼脂糖胶电泳检测和浓度测定确认质量合格(18S、 28S两条主带清晰无拖尾，0D260/0D280 = 1.8-2.0)后方可进行后续试验。将各个组织的 RNA反转录成cDNA，置于_20°C冰箱保存。反转录使用的试剂盒是Promega公司的M-MLV， 按照产品说明书操作即可。首先在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数 据库CREP(http://cr印.ncpgr.cn) (Wang et al. ,2010)中发现了一个可能是胚乳特异表 达的候选基因，所对应的探针号是Os. 13536. 1.31_站，芯片显示在胚乳发育的7，14，21天 均高量表达，在其他组织无表达或表达量很低。该探针所表征的基因在TIGR上的登录号是 L0C_0s03g55734,在NCBI上 的基因号为GI =31415924,基因功能注释为“可能的醇溶谷蛋白 (putative prolamin) ”。基因大小为459bp，mRNA大小为459bp，编码134个氨基酸(见序列 表 SEQ ID NO :8)。设计能扩增部分mRNA 的 RT-PCR 引物(YRJTZ3F :AAGCATCTCCCATACGCTGT， YRJTZ3R :TCAACAACAACCATAAGGAAAGA，扩增大小为430bp)，以水稻“明恢63”的叶片、叶鞘、 茎杆、根、穗、胚乳的RNA反转录产物为模板，以水稻Actinl为内参(扩增引物为actinlF GCCACACTGTCCCCATCTAT, actinlR GCGACCACCTTGATCTTCAT)。PCR 反应条件94 "C 5min, 94°C 30sec,55. 5°C 30sec,72°C 50sec，30 个循环，72°C 7min。PCR产物经 0· 8%琼脂糖胶 电泳检测。检测结果见附图2。结果显示，候选基因GI :31415924在胚乳中表达，在其他组 织不表达。实施例2 胚乳特异表达启动子EnP3候选片段及相应缺失片段的获得(相应分子 生物学常规操作参考《分子克隆实验指南(第二版)》(J.萨姆布鲁克等，1996))明恢63基因组DNA的抽提在明恢63分蘖盛期取新鲜叶片用于抽提其基因 组DNA，具体方法为Murray报道的十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，以下简称CTAB)抽提法(Murray and Thompson. 1980)，抽提出的DNA完全溶解后 置于-20°C冰箱保存。在生物信息学网站NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)上提取候选基因 GI =31415924的上游序列，具体来讲是-976至+54(转录起始点为+1)区间共计1130bp 作为启动子候选片段。将其命名为EnP3。利用PCR法，以抽提的明恢63基因组DNA 为模板，通过设计特异引物(EnP3F Ce<S AAGCTTGGAGCATTTGTAGGAATGCC ；EnP3R CGC GGATCCTGTTGACAGCGTATGGGAGA)来扩增EnP3，为了后续构建载体的方便，左右引物分别添 加Hindlll、BamHI酶切位点(下划线表示)及相应的保护碱基(阴影表示)。PCR反应条 件94°C 5min，94°C lmin，66°C 50sec,72°C lmin30sec，30 个循环，72°C 7min。取EnP3的部分PCR产物用0.8%琼脂糖电泳检测。剩余的PCR产物用于做TA克隆。 使用的试剂盒为Promega公司的T-Vctor系统。反应体系为5. O μ 1，具体如下EnP3PCR产 物 1. 9 μ 1、T-Vctor 0. 3 μ 1、2 倍缓冲液(以下简写为 buffer) 2. 5 μ 1、T4 Iigase 0·3μ1。连接产物于16°C低温水浴10h，然后电转化(1800伏，电击2_3秒)入大肠杆 菌DH5ci (该菌株为商业化的大肠杆菌菌株)，37°C复苏40min，涂含氨苄霉素(Amp)、异 丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5_溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(Χ-gal)的平板，37°C培养过夜，挑选白斑用含Amp的LB培养基来扩大培养。抽提所摇菌的质粒，用 HindIII和BamHI双酶切来筛选阳性克隆。酶切体系为20. Oy 1，具体如下质粒3. 0μ 1、 IOXK buffer2. 0 μ UHindIIIO. 1 μ l.BamHIO. 1 μ l,ddH2014. 8 μ 1，37°C反应 4h，酶切产物 用0.8%琼脂糖电泳检测。挑选阳性克隆用ABI3730测序仪进行测序。测序结果显示来源 于明恢63基因组的EnP3序列(序列表SEQ ID NO 1所示)与NCBI上报道日本晴的序列 并非是100%完全匹配，存在少量差异，最终大小为1040bp，后续5’缺失片段的设计均以明 恢63基因组的序列为准。5个5’缺失片段与全长启动子共用同一个右引物(EnP3R CGC GGATCCTGTTGACAGCGTATGGGAGA)，左引物根据它们最终的扩增片段大小分别 命名为 EnP3F-859 ( CCC AAGCTTTTGGAATTGCGCGAAGTTAG)、EnP3F~678 ( CCC AAGCTTGCTAAATGTTACTTCCTCCG)、EnP3F~471 (C Q€ AAGCTTGTCGTGACTTATGTAACACG)、 EnP3F-292 ( CCC AAGCTTGCACCAATGC ACCATTGATC)禾口 EnP3F_110( CCC AAGCTTCCTATAAATAATCCCCTAGAGC)。在每条左引物5，端都引入HindIII酶切位点(以下划 线表示)及相应的保护碱基(以阴影表示)。PCR模板为测序正确的TA-EnP3质粒。得到 扩增产物之后，后续操作按照构建TA-EnP3的方法进行。实施例3 胚乳特异表达启动子EnP3候选片段及相应缺失片段的转化载体构建 (相应分子生物学常规操作参考J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》，科学出 版社(1996)。(1)酶切载体DX2181。DX2181载体是在pCAMBIA1380 (该载体是澳大利 亚 CAMBIA(Center forthe Application of Molecular Biology to International Agriculture, CAMBIA)实验室在全世界公开交流使用的载体)的基础上改造而来，在多克 隆位点处以相反的方向分别构建了一个GUS基因和EGFP基因，载体图及多克隆位点等信息 见图3。用HindIII、BamHI双酶切DX2181，酶切产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上 海生工生物工程技术服务有限公司生产)回收，电泳检测其酶切完整性，置于-20°C冰箱保 存。(2)酶切EnP3及相应缺失片段的TA克隆质粒。用HindIIIjamHI双酶切经过测 序为正确的EnP3及相应缺失片段的TA克隆质粒，酶切产物用0. 8%琼脂糖电泳分离，然后 目标带用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，电泳检测其酶切完整性，置于-20°C冰箱保存。(3)将酶切回收的EnP3及相应缺失片段构建到载体DX2181上(见附图4)，电转 化入大肠杆菌DH5ci (该菌株为商业化的大肠杆菌菌株)。酶切检测与测序后将构建好的载 体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105菌株(该菌株为商业化的农杆菌菌株)，构成可用于 转化的工程菌株。然后通过农杆菌介导的遗传转化法(林拥军等，2002)转化水稻品种“中 花 11”。实施例4 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化方法主要参照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验 室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法(林拥军等，2002)。转化受体为 水稻品种“中花11”的成熟种子所诱导产生的胚性愈伤组织。经过预培养、侵染、共培养、筛 选得到具有潮霉素抗性的愈伤，再经过分化、生根、炼苗和移栽，得到转基因植株。本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基配制过程中所涉及到得的主要试剂的名称及缩写表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)； KT (Kinet in, Mij] Μ) ；NAA (Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ； IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS (Acetosringone, Zi lit T # Sll ) ；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate, /K I S S )； HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max (N6 大量元素 成分溶液);N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量 元素成分溶液)(2)主要溶液配方DN6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(IOX)配制)硝酸钾(KNO3)28. 3g磷酸二氢钾(KH2PO4)4. Og硫酸铵((NH4)2SO4)4. 63g硫酸镁(MgSO4· 7H20) 1. 85g氯化钙(CaCl2· 2H20) 1. 66g将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制碘化钾(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g硫酸锰(MnSO4· 4H20) 0. 44g硫酸锌(ZnSO4· 7H20) 0. 15g将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。3)铁盐(Fe2-EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制):将3. 73克乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H20)和2. 78克FeSO4 · 7H20分别溶解， 混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70°C温浴2小时，4°C保存备用。4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制):烟酸(Nicotinic acid)0. Ig维生素Bl (Thiamine HCl) 0. Ig维生素B6(Pyridoxine HCl) 0. Ig甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)IOg加蒸馏水定容至1000ml，4°C保存备用。 5) MS培养基大量元素母液(按照10X浓缩液配制):硝酸铵(NH4NO3)16. 5g硝酸钾(KNO3)19. Og磷酸二氢钾(KH2PO4)1. 7g硫酸镁(MgSO4· 7H20) 3. 7g
氯化钙(CaCl2· 2H20) 4. 4g将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。6) MS培养基微量元素母液(按照100X浓缩液配制):硫酸锰(MnSO4· 4H20)2. 23g硫酸锌(ZnSO4· 7H20) 0. 86g硼酸(H3BO3)0. 62g碘化钾(ΚΙ)0. 083g钼酸钠(Na2MoO4· 2H20) 0. 025g硫酸铜(CuSO4· 5H20) 0. 0025g氯化钴(CoCl2· 6H20) 0. 0025g将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。7) 2，4-D 贮存液(lmg/ml)的配制称取2，4-D IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全 后定容至100ml，于室温下保存。8)6_BA 贮存液(lmg/ml)的配制称取6-BA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后 定容至100ml，室温保存。9)萘乙酸(NAA)贮存液(lmg/ml)的配制称取NAA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后 定容至100ml，4°C保存备用。10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(lmg/ml)的配制称取IAA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后 定容至100ml，4°C保存备用。11)葡萄糖贮存液(0. 5g/ml)的配制称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4°C保存备用。12) AS贮存液的配制称取AS 0. 392g，WADMS0 IOml溶解，分装至1. 5ml离心管内，4°C保存备用。13) IN氢氧化钾贮存液配制称取氢氧化钾5. 6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)诱导培养基N6max母液(取已经制备好的IOX浓缩液，下同)IOOmlN6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)IOmlFe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)IOml维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)IOml2,4-D贮存液(取上述制备好的)2. 5ml脯氨酸(Proline)0. 3gCH0.6g蔗糖30g
Phytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121°C下灭菌25分钟，下述的培养 基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。2)继代培养基
N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X)IOml维生素贮存液(100X)IOml2，4-DC存液2.0ml脯氨酸0. 5gCH0. 6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。3)预培养基N6max 母液(IOX)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 15g蔗糖5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入 培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基N6max 母液(IOX)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 2g蔗糖5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。5)悬浮培养基N6max 母液(IOX)5mlN6mix 母液(100X)0.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)0.5ml维生素贮存液(100X)Iml2，4-DC存液0.2mlCH0. 08g蔗糖2g加蒸馏水至100ml，调节pH值到5. 4，分装到两个IOOml的三角瓶中，封口，按上述
方法灭菌。使用前加入Iml无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。6)选择培养基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.625mlCH0. 15g蔗糖7. 5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6. 0，封口，按上述方法灭菌。使用前溶解培养基，加入250微升HN(50mg/ml)和400微升CN(250mg/ml)分装倒 入培养皿中(25ml/皿)。(注第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400mg/升，第二次及以后选择培养基 羧苄青霉素浓度为250mg/l)。7)预分化培养基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml6-BA 贮存液0. 5mlKT C存液0. 5mlNAA贮存液50微升IAA贮存液50微升CH0. 15g蔗糖7. 5g琼脂粉1.75g
加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，250微升HN(50mg/ml) 250微升CN(250毫g/ml)，分装倒入培 养皿中(25ml/皿)。8)分化培养基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X)IOml维生素贮存液(100X)IOml6-BA 贮存液2mlKT C存液2mlNAA C存液0.2mlIAA 贮存液0.2mlCHIg蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6. 0。煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方 法灭菌。9)生根培养基MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)5ml维生素贮存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，用IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并用蒸馏水定容至IOOOml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法灭菌。(4)农杆菌介导的遗传转化步骤1)愈伤诱导a.将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯 化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；b.用灭菌水洗种子4-5次；c.将种子放在诱导培养基上；d.将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25士 1°C。2)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度 25 士 1°C。3)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25 士 1°C。4)农杆菌培养a.在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105 (该菌株来自CAMBIA 公司商业化的农杆菌菌株)两天，温度28°C ；b.将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。5)农杆菌侵染a.将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；b.调节农杆菌的悬浮液至OD6J). 8-1. 0 ；c.将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；d.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放在共培养基上培养3天，温度 19-20 "C。6)愈伤洗涤和选择培养a.灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；b.浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；c.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；d.转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。7)分化a.将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；b.转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(1500-2000LUX)下培养，培养温 度 26°C。8)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照(1500-2000LUX)下培 养2-3周，培养温度26 °C。9)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保 持水分湿润。实施例5 =PCR法检测转基因阳性植株转化苗移入温室后，待其返青，然后分单株取l-2cm幼嫩叶片，抽提其基因组DNA 为模板，用PCR法检测阳性植株。扩增片段为报告基因gus的部分片段，大小为699bp。引 物序列为 GUS-F GGGCGAACAGTTCCTGATTA, GUS-R :AACGTATCCACGCCGTATTC。PCR 反应条件 940C 5min，94°C 50sec，57°C 40sec，72°C 50sec，30 个循环，72°C 7min。PCR产物经 0· 8% 琼脂糖胶电泳检测。通过此法，可剔除阴性植株。小量叶片基因组DNA的提取方法取适量幼嫩叶片，加SOOul 1. 5XCTAB(1. 5XCTAB 配方1· 5 % CTAB、75mM Tris-HClU5mM EDTA 及 1· 05M NaCl)研 磨，转入1.5ml离心管中；65°C水浴30min;加入600 μ L氯仿/异戊醇(体积比为24 1) 上下颠倒数次(约15min)，下层液相呈深绿色为止；室温下12000r/min离心IOmin ；取 500 μ L上清于一新1. 5ml离心管，加入预冷的95%乙醇lmL，混勻后置-20°C，30min ；室温 下12000r/min离心lOmin，去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100 μ LddH2O溶 解，备用。
实施例6 =GUS组织染色法分析EnP3候选片段及相应缺失片段各种组织中的表达 模式分别取经PCR检测(参考实施例5)为阳性的EnP3_GUS转化植株(10株以上)的 根、叶片、叶鞘、茎杆、颖壳、花、种子切成约0. 5CM长度的适当大小，浸入约200 μ 1的⑶S染 液，37°C过夜，然后用75%酒精脱色，观察是否有蓝色出现。染色液的配方参照Jefferson 等报道的方法(Jefferson等，1987)。结果表明EnP3候选片段仅在转化植株的胚乳表达， 在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达(见附图5)。这些结果 证实，EnP3为一个胚乳特异表达的启动子。用同样的办法分析了 EnP3的系列缺失片段驱动下的⑶S在各种组织中的表达模 式(见图6)。结果表明启动子EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471、EnP3-292均具有独立的启 动基因表达的功能，并且在转化植株中的表达模式与EnP3相同，即仅在胚乳表达，不过表 达量各有区别。同时发现，由EnP3-292进一步截短的EnP3-110区段的表达模式发生了显 著的改变在叶片、叶鞘、茎杆及颖壳这些绿色组织中可以检测到表达，但是在根、花及种子 (包括胚和胚乳)中却检测不到表达，成为一个短的绿色组织特异表达启动子(见图7)。实施例7 启动子EnP3及相应缺失片段⑶S活性定量检测取EnP3及相应缺失片段经⑶S组织化学染色为阳性(参考实施例6)植株及转空 载体DX2181植株的Ttl代种子，统一播种。待其开花受精后7天、14天、21天时取胚乳组织， 抽提其总蛋白，然后测定其GUS活性(见图9)；同时取EnP3-110及空载体DX2181抽穗期 的叶片、叶鞘、茎杆、穗子和根组织，同样抽提其总蛋白，然后测定其GUS活性(见图8)。具 体方法参考 Bradford 及 Jefferson 等报道的方法(BradfordM, 1976 Jefferson 等，1987)。 结果表明在胚乳组织发育的不同时期，启动子片段(EnP3、EnP3-859、EnP3_678、EnP3-471 和EnP3-292)和阴性对照DX2181相比，均有显著差异；启动子片段EnP3_110的主要绿色组 织(叶片、叶鞘、茎杆、颖壳(实验测量时为整穗))和阴性对照DX2181相比，均有显著差异 这和组织化学染色结果是吻合的，即EnP3、EnP3-859、EnP3_678、EnP3_471和EnP3_292为 胚乳特异表达启动子，而EnP3-110为一绿色组织特异表达启动子。从胚乳组织的表达量上 来看，全长启动子EnP3的表达量最高(在各个发育时期均是如此)，并且随着胚乳发育阶 段的不断进行，表达量呈现下降趋势。对EnP3-678、EnP3_471和EnP3_292这三个启动子 来讲，它们的表达模式与EnP3相同，即随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋 势；并且随着启动子长度的逐渐缩短，对同一发育时期比较而言，表达量呈现下降趋势。与 其他几个胚乳特异表达的启动子相比而言，EnP3-859的表达模式略有不同，即在胚乳发育 前期(开花受精后7天及14天)表达量无明显变化，在后期有一个急剧下降的过程。绿色 组织特异表达启动子EnP3-110在叶片、叶鞘中的表达量(以阴性对照DX2181的相应组织 为基准)要强于在茎杆和穗子中的表达量。同时从图上可以发现胚乳中开花受精后7天的 ⑶S活性从EnP3到EnP3-859以及EnP3_471到EnP3_292有一个急剧下降的现象；而开花 受精后14天及21天的⑶S活性的急剧下降则出现在EnP3-471到EnP3_292。从上面所有 结果可以推测启动子EnP3是一个在胚乳发育前期高量表达的特异表达启动子；在胚乳发 育早期1040-859及471-292这两个区段中可能存在控制其表达量的顺式作用元件；在胚乳 发育的中后期471-292这个区段中可能存在控制其表达量的顺式作用元件。EnP3-110为 一绿色组织特异表达启动子，而EnP3-292为一胚乳特异表达启动子，表达模式发生显著改变，说明292-110这个区段可能存在控制启动子表达模式的顺式作用元件。参考文献1.林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002， 28(3) 294-300 ；2. J.萨姆布鲁克，E. F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南(第二版).科 学出版社，1996;3. Bradford M，A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye binding. Anal Biochem，1976，72 :248-254 ;4. Buchner et al.，Characterization of a tissue-specific and developmentalIy regulated beta-1，3-glucanase gene inpea (Pisum sativum). Plant Mol Biol，2002，49 :171_186 ；5. Cai M et al.，A rice promoter containing both novel positive and negative cis—elements for regulation of greentissue-specific gene expression in transgenic plants. Plant Biotechnology Journal, 2007, 5 664-674 ；6. Ehsani P et al. Expression of anti human IL-4 and IL-6 scFvs in transgenic tobacco plants. Plant Mol Biol，2003，52 :17_29 ;7. Jefferson et al.，GUS fusions :beta_glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higherplants. EMBO J，1987，6 :3901_3907 ;8.Karlowski W M， Hirsch A M. The over-expression of an alfalfa RING-H2 gene induces pleiotropic effects onplant growth and development. Plant Mol Biol, 2003,52 121-133 ；9.Kumpatla S P et al. ， Genome intruder scanning and modulation systems and transgene silencing. Trends inPlant Sciences, 1998, 3 96~104 ；10. Murray and Thompson. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 1980，8 :4321_4325 ；11. Robinson D J. Environmental risk assessment of release of transgenic plants containing virus-derived inserts. Transgen Res，1996，5 :359_362 ;12. Rossak et al. ,Expression of the FAEl gene and FAEl promoter activity in developing seeds of Arabidopsisthaliana. Plant Mol Biol，2001，46 :717_725 ;13. Sandhu et al.，Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing respiratory syncytial virus-Fprotein induces a systemic immune response.Transgenic Res，2000，9 :127-135 ；14. Vasconcelos et al. ,Enhanced iron and zinc accumulation in transgenic rice with the ferritin gene. Plant Sci,2003,164 371-378 ；15. Vickers et al.，A novel cis-acting element，ESP, contributes to high-level endosperm-specific expression in anoat globulin promoter. Plant Mol Biol，2006，62 :195_214 ；16. Wang L et al., A dynamic gene expression atlas covering the entirelife cycle of rice.Plant J. 2010，61 :752_766 ;17. Wu et al.，The GCN4 motif in a rice glutelin gene is essential for endosperm specific gene expression and isactivated by 0paque-2 in transgenic rice plants. Plant J，1998，14 :673_683 ;18.Ye RJ et al. , Development of inseet-resistant transgenic rice with CrylO-free endosperm. Pest Managementscience，2009，65 :1015—1020 ;19. Yoshida et al. ,Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice， 3rd Edn. International Rice Researchlnstitute, Manila. 1976 ；20. Zambryski et al.，Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of theirnormal regeneration capacity. EMBO J， 1983,2 :2143-2150o
权利要求
一个水稻胚乳特异性表达的启动子EnP3，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.一个水稻胚乳特异性表达的启动子EnP3-859，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 2所示。
3.一个水稻胚乳特异性表达的启动子EnP3-678，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3所示。
4.一个水稻胚乳特异性表达的启动子Enra-471，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 4所示。
5.一个水稻胚乳特异性表达的启动子EnP3-292，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 5所示。
6.一个水稻绿色组织特异性表达的启动子EnP3-110，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 6所示。
7.权利要求1-6任一项所述的启动子在水稻遗传改良中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程领域。从水稻基因组中克隆了同一胚乳特异表达基因(登录号为GI31415924)上游6个不同长度的启动子(EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471、EnP3-292和EnP3-110)，其核苷酸序列如SEQ ID NO1-6所示；其中5个启动子(EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471和EnP3-292)仅在转化植株的胚乳表达，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势；在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达。启动子EnP3-110在叶片、叶鞘、茎杆及颖壳这些绿色组织中可以检测到表达，但是在根、花及种子(包括胚和胚乳)中却检测不到表达，成为一个短的绿色组织特异表达启动子。公开了6个启动子及其相应表达载体的制备方法，以及通过农杆菌介导的转基因方法导入水稻的应用。
文档编号A01H5/00GK101831429SQ20101015103
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月15日 优先权日2010年4月15日
发明者叶荣建, 林拥军, 陈浩 申请人:华中农业大学