专利名称：一种棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法
技术领域：
本发明涉及一种植物领域组织培养的诱导和培养方法，具体涉及棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法。
背景技术：
棉花是世界上重要的经济作物，彩色棉的纤维具有天然色彩，用它进行纺织避免了化工染料对人体的毒害和对棉纤维自身优良品质的破坏，随着人们生活水平的日益提高和纺织工业的飞速发展使其倍受青睐。但彩色棉由于受到产量低、产业化加工规模有限等因素的限制，未能大面积示范推广，利用常规育种手段进行品质改良具有难度，在一定程度上影响了彩色棉产业的发展。转基因抗虫棉育种的突破极大地促进了世界棉花产业的发展，同时使转基因育种作为传统育种的重要补充手段得到育种家的公认，拓展建立不同彩色棉品种类型的再生体系，是利用转基因手段改良彩色棉品种和品质的关键所在，对彩色棉产业的发展具有重要研究价值。利用遗传工程技术改良棉花品种能够提高棉花的种植效益，虽然棉花生物技术育种获得了突破性进展，转基因抗虫棉成功应用于棉花生产，但仍存在许多不足，棉花育种研究仍然存在着很多障碍，其中植株再生的高效体系是棉花转基因育种的先决条件，获得胚性愈伤组织是植株再生的前提，也是能否建立再生体系的关键，如何促进胚性愈伤组织的分化、体细胞胚成熟、提高再生率一直是众多研究者所要突破的难题。棉花遗传转化技术的复杂性(难重复、转化率低)和转基因棉花的农艺性状的变异等，这些问题都是棉花生物技术育种研究的瓶颈，目前获得的再生体系具有很强的基因依赖性。我们首次开展陇棕棉系列品种的再生研究，通过对棕色棉组织培养再生各个阶段关键因素的研究，获得了棕色棉胚性愈伤组织诱导过程中的各种影响因素的最适培养条件，为彩色棉转基因育种提供了技术支撑。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，克服了棕色棉体细胞胚胎发生及植株再生的困难，提供了一种棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，包括有以下步骤I)棕色棉种子人工脱壳后，再经过消毒处理，得到无菌棕色棉种子，再将无菌棕色棉种子放入摇床中遮光悬浮暗培养24-36小时，在胚根生长至O. 8-1. 2cm时，接种于1/2所有元素减半的MSB培养基中，暗培养3-5天，得到2-4cm长的无菌苗下胚轴；2)将步骤I)得到的无菌苗下胚轴在无菌条件下切为5_8mm小段，并置于棕色棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养30天，得到初级培养棕色棉愈伤组织；3)将步骤2)得到的初级培养棕色棉愈伤组织转接至棕色棉愈伤组织增殖培养基并继代培养2次，继代培养周期为25天，得到增殖后棕色棉愈伤组织；
4)将步骤3)得到的增殖后棕色棉愈伤组织转入棕色棉愈伤组织分化培养基，继代培养2-3次，继代培养周期为25天，得到胚性愈伤组织；5)将步骤4)得到的胚性愈伤组织置于棕色棉胚性愈伤组织增殖培养基上，进行扩繁培养。上述棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，所述步骤I)中，消毒处理的过程为棕色棉种子先以O. 1%的贡溶液灭菌8-12分钟，再以无菌水冲洗5-8遍,最后加无菌水在摇床悬浮培养24-36小时至种子胚根伸长；摇床的温度为27_29°C，速度为120rpm。上述的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，所述步骤2)中，棕色棉愈伤组织诱导培养基为按照以下比例加入了 1.9-3.8g/L KNO3>O. 75g/L MgCl2，同时附加有 O. 3-0. 8mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和O. 5-1. 5mg/L吲哚丁酸的MSB培养基。上述的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，所述步骤3)中，棕色棉愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了 O. 1-0. 5mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和O. 4_lmg/L吲哚丁酸的MSB培养基。上述的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，所述步骤4)中，棕色棉愈伤组织分化培养基为按照以下比例加入了 O. 05-0. 2mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和O. 1-0. 5mg/L吲哚丁酸的MSB培养基。上述的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，所述步骤5)中，棕色棉胚性愈伤组织增殖培养基为MSB培养基，其中NH4NO3浓度减半，为O. 825g/L。本发明提供的诱导棕色棉胚性愈伤组织的方法，从外植体的培养到愈伤组织诱导，愈伤组织增殖分化，调节和筛选质地疏松、无硬化、颜色浅绿、灰绿到黄绿的愈伤组织， 对其增殖及分化过程的培养条件进行优化，最终研究得到胚性愈伤组织诱导时间为5-8 月，愈伤组织诱导率高达100 %，胚性愈伤组织分化率达15 % -20 %。外植体培养是建立再生体系的第一步，种子脱壳可有效提高种子萌发率，降低污染率；摇床培养可增加种子发芽率，缩短发芽时间，同时可解决直接浸泡时供氧不足和种子间的相互挤压造成的胚根伤残。无菌苗的生长采用了暗培养处理，幼嫩的下胚轴使诱导出的愈伤组织状态较好， 有利于分化。2，4-D在诱导愈伤组织中是比较有效的一种外源激素，它启动细胞分裂速度快，诱导产生愈伤组织频率高、质量好，在棉花组织培养和遗传转化中被广泛应用，但2，4-D 也会导致愈伤组织褐化，不利于后期胚性愈伤组织的产生。因此，本研究在愈伤组织诱导期直接使用较高浓度的KT和IBA。在后期愈伤组织增殖继代培养中采取降低激素浓度的方法，以提高胚性愈伤的分化率。愈伤组织分化后期去掉外源激素更加有利于胚性愈伤分化。 在愈伤诱导的前期添加1.9-3.8g/L KNO3,0. 75g/L MgCl2有利于愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的形成。本发明的有益效果为本发明充分考虑了愈伤组织诱导过程中生长素和分裂素的影响，通过最佳外植体的培养，外源激素的诱导，愈伤组织向胚性愈伤生长及分化过程转化，最终获得体细胞胚胎及再生植株。在胚性愈伤诱导过程中对激素种类和浓度，凝固剂，氮源的使用量进行摸索， 获得了一个成熟的适应于棕色棉胚性愈伤组织生成的方法。该方法耗时短，诱导率高，拓展了棉花可再生的基因型，该方法适应于棕色棉品种，对彩棉转基因育种的应用具有技术支撑作用。
具体实施例方式本发明技术方案材料中上述材料中提及的的MSB培养基，是利用MS培养基的无机兀素以及B5培养基的有机兀素组合的一种培养基。其主要成分及用量如表I所不表I
组成成分浓度(mg/L)MS大量元素NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H20440MgS04+7H20370KH2POi1170MS微量元素KT0.83H3BO36.2MnS〇4.4H2022.3ZnSO4-TH2O8.6Na2Mn04.2H2〇0.25CuS04.5H200.025CoC12.6H200.025MS铁盐FeSO4-7H2027.8Na9-EDTA-2H9037.3B5有机元素肌醇100烟酸I盐酸吡哆醇(维生素B6)I盐酸硫胺素(维牛.素BI)10以上试剂均为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。KT为N6-异戊烯腺嘌呤；IBA为吲哚丁酸，均为分析纯试剂，购自Sigma公司。Gelrite为植物凝胶,购自Sigma公司。继代培养是植物组织培养的专业术语，意思就是由于诱导培养基中的营养物质和水分的减少，培养物分泌产物积累，导致愈伤组织生长缓慢，影响愈伤组织其细胞分化很难保持一个旺盛分裂、均一的群体状态，需要在一定时间段把愈伤组织转接到新鲜的培养基上继续进行培养，其目的就是使培养的愈伤组织保持旺盛的生长状态。实施例I :(I)供试材料陇棕棉品系 BC05、9501B、BC06-10。(2)外植体培养棕色棉种子先人工脱壳，消毒后进行悬浮培养，胚根长出后接种于1/2MSB培养基暗培养，培养周期为3-5天，培养温度为27-29°C。(3)将获得的无菌苗下胚轴切成5-8mm小段，平放于添加I. 9-3. 8g/L KNO3,0. 75g/ L MgCl2,同时附加 O. 3-0. 8mg/L KT+0. 5-1. 5mg/L IBA 的 MSB 培养基。(4)30天后，棕色棉下胚轴全部成功诱导出愈伤组织，颜色呈黄绿色或淡黄色， 状态疏松。将诱导出的愈伤组织转接至添加I. 9-3. 8g/L KNO3，同时附加O. 1-0. 5mg/L KT+0. 4-1. Omg/LIBA的MSB培养基，继代培养2次。(5)挑选生长旺盛，状态疏松的愈伤组织转入添加I. 9-3. 8g/L KNO3，同时附加 O. 05-0. 2mg/L KT+0. 1-0. 5mg/L IBA的MSB培养基，25天继代培养I次，继代培养2_3次后， 从愈伤组织底部或侧边缘诱导产生淡黄色松散颗粒状的胚性愈伤组织，占总接种愈伤组织的 15% -20%。(6)将挑选出的胚性愈伤组织放置在降低NH4NO3浓度，同时去掉激素的培养基中， 即接种在无激素的NH4NO3浓度降低的改良MSB培养基上，15天继代培养I次，胚性愈伤组织增殖倍数可达2倍。最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行优化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于，包括有以下步骤1)棕色棉种子人工脱壳后，再经过消毒处理，得到无菌棕色棉种子，再将无菌棕色棉种子加适量无菌水放入摇床中遮光悬浮暗培养24-36小时，在胚根生长至O. 8-1. 2cm时，接种于1/2所有元素减半的MSB培养基中，暗培养3-5天，得到2-4cm长的无菌苗下胚轴；2)将步骤I)得到的无菌苗下胚轴在无菌条件下切为5-8_小段，并置于棕色棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养30天，得到初级培养棕色棉愈伤组织；3)将步骤2)得到的初级培养棕色棉愈伤组织转接至棕色棉愈伤组织增殖培养基并继代培养2次，继代培养周期为25天，得到增殖后棕色棉愈伤组织；4)将步骤3)得到的增殖后棕色棉愈伤组织转入棕色棉愈伤组织分化培养基，继代培养 2-3次，继代培养周期为25天，得到胚性愈伤组织；5)将步骤4)得到的胚性愈伤组织置于棕色棉胚性愈伤组织增殖培养基上，进行扩繁培养。
2.根据权利要求I所述的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤I)中，消毒处理的过程为棕色棉种子先以O. 1%的升汞溶液灭菌8-12分钟，再以无菌水冲洗 5-8遍,最后加无菌水在摇床悬浮培养24-36小时至种子胚根伸长；摇床的温度为27-29°C, 速度为120rpm。
3.根据权利要求I或2所述的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，棕色棉愈伤组织诱导培养基为按照以下比例加入了 I. 9-3. 8g/L KN03、0. 75g/ L MgCl2,同时附加有O. 3-0. 8mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和O. 5-1. 5mg/L吲哚丁酸的MSB培养基。
4.根据权利要求3所述的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤3)中，棕色棉愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了 O. 1-0. 5mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和O. 4-lmg/L吲哚丁酸的MSB培养基。
5.根据权利要求4所述的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤4)中，棕色棉愈伤组织分化培养基为按照以下比例加入了 O. 05-0. 2mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和O. 1-0. 5mg/L吲哚丁酸的MSB培养基。
6.根据权利要求5所述的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤5)中，棕色棉胚性愈伤组织增殖培养基为MSB培养基，其中NH4NO3浓度减半，为O.825g/L。
全文摘要
本发明公开了一种棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，包括有以下步骤棕色棉种子消毒后剥去种皮进行培养，得到无菌苗下胚轴；无菌苗下胚轴置于棕色棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养；转接至棕色棉愈伤组织增殖培养基并继代培养；转入棕色棉愈伤组织分化培养基，继代培养得到胚性愈伤组织；再进行扩繁培养。本发明的有益效果为本发明提供的棕色棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，耗时短，诱导率高，拓展了可再生棉花的基因型，适应于彩棉的棕色棉品种，对该类型的彩棉转基因研究具有技术支撑作用。
文档编号A01H4/00GK102577979SQ20121007118
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者刘新星, 厚毅清, 张敏敏, 李忠旺, 王红梅, 罗俊杰, 裴怀弟, 陈子萱, 陈玉梁 申请人:甘肃省农业科学院生物技术研究所