本申请要求于2015年10月16日提交的美国临时申请序列号62/242,951和美国临时申请序列号62/242,960以及于2016年9月26日提交的美国临时申请序列号62/399,993的权益，其全部内容通过引用并入本文。
联邦资助研究声明
不适用。
本发明一般涉及银菊胶植物、分子标记和引物领域，无融合生殖速率和植物鉴定，使用此类分子标记的表征和育种技术，引物和无融合生殖的速率。
背景技术：
天然橡胶是一种有价值且具有战略意义的生物材料。培育用于商业生产的天然橡胶的主要来源是巴西橡胶树(heveabrasiliensis)，其主要种植在南美洲、东南亚以及非洲和印度地区。为了满足天然橡胶的需求并在另选地理位置提供可再生橡胶的可持续来源，已经研究了其他物种的橡胶生产植物。
银胶菊(partheniumargentatum)是原产于墨西哥北部和德克萨斯西南部的多年生沙漠灌木物种。作为可能的大规模商业生产的天然橡胶的替代来源，银胶菊正在被研究。银胶菊在其细胞内生产橡胶，其通常必须在植物达到成熟之后进行破坏性采收。银胶菊生产的橡胶还提供了不含导致乳胶过敏的蛋白质的益处，而这种过敏可能由源自三叶胶(hevea)的天然橡胶引起。
天然橡胶的生产需要多样化，并改良生产天然橡胶的银胶菊植物的育种和表征。
技术实现要素：
本发明涉及银菊胶的分子标记和使用这些分子标记鉴定、表征和培育银胶菊的方法。在优选的实施方案中，分子标记是单核苷酸多态性(snp)或短串联重复的单核苷酸微卫星、二核苷酸微卫星、三核苷酸微卫星、四核苷酸微卫星、五核苷酸微卫星和六核苷酸微卫星(简单序列重复或ssr)。另外优选地，分子标记是多态的。在另一个优选的实施方案中，分子标记与银胶菊植物的表达性状相关，特别是与改良的植物产量、尺寸、均匀性和橡胶产量相关的那些性状。本发明进一步涉及确定银胶菊植物中无融合生殖速率的方法，以及在用于育种银菊胶植物的方法中使用关于无融合生殖速率的信息，例如单独或组合地鉴定用于育种的银胶菊植物具有确定植物遗传谱系的步骤，如通过使用snp和/或ssr的dna分析。
在另一个实施方案中，本发明涉及与根据本发明的snp或ssr相关的引物。在优选的实施方案中，该引物用于扩增分子标记诸如snp或ssr的方法中，并且在进一步优选的实施方案中，分子标记是多态的。在另外优选的实施方案中，本发明涉及包含待用于根据本发明的方法中的一组引物的引物试剂盒。
在一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于评估来自一个或多个银胶菊种质集合的银胶菊种质的遗传多样性的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于定量一个或多个银胶菊种质集合内的种质资源之间的遗传相似性或距离的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于肠胃外种质筛选和/或选择的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于银胶菊种质遗传进展的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于筛选和选择一种或多种银胶菊细胞、组织、幼苗、植物、植物部分、杂种或其子代的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于开发银菊胶的新品种的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于选择银胶菊细胞、组织、幼苗、植物、植物部分、杂种或其子代的一种或多种性状的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于鉴定、确认和/或质量评估的方法中，该方法包括种质鉴定、亲本背景恢复和种子纯度测试。
在另外的优选实施方案中，根据本发明的分子标记、引物和方法用于鉴定或改良银胶菊植物的表达性状，包括橡胶含量、橡胶质量、橡胶产量、橡胶的平均分子量、植株大小、植物产量、植株活力、植株田间整齐度、耐盐性、耐温性、抗病性或耐旱性。
在另外优选的实施方案中，本发明涉及通过根据本发明的任何方法生产的银胶菊植物细胞、植物组织、幼苗、植物部分、植物及其子代。本发明的另一个实施方案是通过根据本发明的任何方法生产的由此类银胶菊植物生产或从中提取的橡胶组合物。在一个实施方案中，与天然存在的银胶菊或公众可得的银胶菊种质相比，那些银胶菊植物细胞、植物组织、幼苗、植物部分、植物及其子代具有改良的表达性状、表型和/或基因型。
本发明还涉及包括根据本发明由银菊胶植物生产或从中提取的橡胶的产品或通过根据本发明的任何方法生产的植物中的产品。这些产品可包括医疗行业的轮胎和乳胶产品。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参见本发明的详细描述以及附图。
图1是银胶菊种质资源的主坐标分析，其示出了每倍性水平的代表性银胶菊种质之间的2d关系。
图2是使用来自54个ssr标记的单个植物样品之间的成对遗传距离的主坐标分析。
图3是来自受控杂交的银胶菊种质的贝叶斯聚类的图表。
图4是使用ssr标记代表私人银胶菊种质和公共银胶菊种质(红色＝私人种质；黑色＝公共种质)子集之间的遗传关系树。
图5是来自ray，s.和sataya，p.在2014年发表于front.plantsci的“nextgenerationsequencingtechnologiesfornextgenerationplantbreeding”的ngs辅助植物育种的概要。
图6是提供双端rad测序的概述图表。在a分图中，用限制性核酸内切酶消化基因组dna。在b分图中，在与初级衔接子连接后，剪切片段，然后与次级衔接子连接。在c分图中，从每个限制酶消化位点回收可变长度片段的复合混合物。使用双端化学在下一代dna测序平台上对这些片段的大小进行选择、扩增和测序。在d分图中，随后通过生物信息学方法完成在每个消化位点周围的基因组装配的开发。
图7是四种银胶菊dna样品的dna质量检查。
图8是来自nei距离的总邻接树的图表，其示出了不同二倍体hs和usda种质、bart历史种质和其他代表性多倍体如g7-11(rec88716和88717)之间的关系。
图9是示出了每个种质类型(hs或种质资源)的各个植物之间的遗传相似性的树的图表。颜色代表原始组分配。一些簇包含来自一种或多种表明遗传混合物的hs(如hs5和hs14)的植物。多倍体种质示出为与二倍体分离地分组。
图10是每个二倍体种质内snp基因座的期望杂合性的图表。
图11是二倍体种质之间成对差异的平均数目的矩阵。对角线之上表明了种质间的差异，对角线元素示出了种质内的差异，对角线之下为nei成对遗传距离。
图12是来自四倍体x四倍体的可能繁殖类别的图表。
图13是种子成熟度与核染色(红色＝种子；黑色＝2x参考)的图表。
图14是在所有发育阶段可检测到胚胎倍性的图表(红色＝早期；蓝色＝中期；黑色＝后期)。
图15是dna含量-种子+内部对照的图表。
图16是来自4x植物的无融合生殖种子的图表。
具体实施方式
本发明涉及银菊胶的遗传改良。在优选的实施方案中，根据本发明的组合物和方法可以用于改良银胶菊作物的更高的植物产量、尺寸、均匀性和橡胶产量以及其他适合大规模耕作的性状。
本发明涉及银菊胶的分子标记和使用这些分子标记鉴定、表征和培育银胶菊的方法。在优选的实施方案中，分子标记是单核苷酸多态性(snp)或短串联重复的单核苷酸微卫星、二核苷酸微卫星、三核苷酸微卫星、四核苷酸微卫星、五核苷酸微卫星和六核苷酸微卫星(简单序列重复或ssr)。另外优选地，分子标记是多态的。在另外优选的实施方案中，snp选自表9中列出的snp。在另一个优选的实施方案中，ssr选自表11和表12中列出的ssr。
在另一个实施方案中，本发明涉及与根据本发明的snp或ssr相关的引物。在优选的实施方案中，该引物用于扩增分子标记诸如snp或ssr的方法中，并且在进一步优选的实施方案中，分子标记是多态的。在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离的核酸分子或引物，以用于检测代表银胶菊植物dna中的多态性的分子标记，其中所述核酸分子包括至少15个核苷酸，该至少15个核苷酸包括所述多态性或紧邻所述多态性，其中所述核酸分子与在包括所述多态性或紧邻所述多态性的dna的任一链中相同数量的连续核苷酸的序列具有至少90％的同一性。该多态性优选为多态性snp或ssr，例如表9、表11和表12中鉴定的snp或ssr。在另外优选的实施方案中，本发明涉及包含待用于根据本发明的方法中的一组引物的引物试剂盒。在优选的实施方案中，该组引物包括表11和表12中列出的一种或多种引物。
在一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于评估来自一个或多个银胶菊种质集合的银胶菊种质的遗传多样性的方法中。例如，本发明可涉及一种确定银胶菊种群对银胶菊基因组贡献的方法，包括对从测试银胶菊植物获得的样品进行基因分型测定，以确定存在于该测试银胶菊植物基因组中的每个标记组的一个或两个等位基因的身份，其中该标记组指示银胶菊种群对该测试银胶菊植物基因组的贡献。在优选的实施方案中，该方法中使用的标记组包括至少5个标记，或更优选地至少为10个标记。在一个实施方案中，该标记组选自单核苷酸多态性(snp)或单核苷酸重复微卫星、二核苷酸重复微卫星、三核苷酸重复微卫星、四核苷酸重复微卫星、五核苷酸重复微卫星和六核苷酸重复微卫星的简单序列序列重复(ssr)。在另外优选的实施方案中，该分子标记组包括表9、表11和表12中列出的标记。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于定量一个或多个银胶菊种质集合内的种质资源之间的遗传相似性或距离的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于肠胃外种质筛选和/或选择的方法中。例如，优选的实施方案涉及用于确定银胶菊种质的基因型的方法，包括以下步骤：(a)使用包括表11和表12中鉴定的引物的一组引物扩增银胶菊种质；以及(b)使用包括表11和表12中鉴定的分子标记的分子标记组合来确定该基因型。本发明的另一个实施方案是包括表11和12中鉴定的引物的引物试剂盒。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于银胶菊种质遗传进展的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于筛选和选择一种或多种银胶菊细胞、组织、幼苗、植物、植物部分、杂种或其子代的方法中。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于开发银菊胶的新品种的方法中。例如，本发明可以涉及一种银胶菊植物育种的方法，该方法包括：(a)使用客观标准评估银胶菊植物以获得表型评分；(b)使用dna分析确定该银胶菊植物的遗传谱系；以及(c)使用该表型评分和该遗传谱系鉴定一种或多种所选择的银胶菊植物，以在下一代银胶菊植物育种中使用从而产生银菊胶植物的先进代。优选地，使用单核苷酸多态性(snp)的dna或单核苷酸重复微卫星、二核苷酸重复微卫星、三核苷酸重复微卫星、四核苷酸重复微卫星、五核苷酸重复微卫星和六核苷酸重复微卫星的简单序列重复(ssr)进行dna分析。在另外优选的实施方案中，鉴定两种所选择的银胶菊植物，它们在遗传上是不相似的或者是高度不相似的，并且这两种所选择的植物杂交以产生银菊胶植物的先进代。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于选择银胶菊细胞、组织、幼苗、植物、植物部分、杂种或其子代的一种或多种性状的方法中。例如，本发明的一个实施方案涉及用于鉴定与银胶菊植物的性状基因座连锁的遗传标记的方法，该方法包括以下步骤：(a)从银胶菊植物提取核酸；(b)使用包括表11和表12中鉴定的引物的一组引物扩增该核酸；(c)使用包括表11和表12中鉴定的分子标记的分子标记组来确定该基因型；以及(d)将遗传标记与该银胶菊植物的表达性状相关联。在另外优选的实施方案中，遗传标记连锁到诸如橡胶含量、橡胶质量、橡胶产量、橡胶的平均分子量、植株大小、植株活力、植株田间整齐度、耐盐性、耐温性、抗病性或耐旱性的性状。在优选实施例中，耐温性是耐寒性。
在另一个实施方案中，根据本发明的分子标记和引物用于鉴定、确认和/或质量评估的方法中，该方法包括种质鉴定、亲本背景恢复和种子纯度测试。
在另外的优选实施方案中，根据本发明的分子标记、引物和方法用于改善银胶菊植物的特征，包括橡胶含量、橡胶质量、橡胶产量、橡胶的平均分子量、植株大小、植株活力、植株田间整齐度、耐盐性、耐温性、抗病性或耐旱性。
在另外优选的实施方案中，本发明涉及通过根据本发明的任何方法生产的银胶菊植物细胞、植物组织、幼苗、植物部分、植物及其子代。本发明的另一个实施方案是通过根据本发明的任何方法生产的由此类银胶菊植物生产或从中提取的橡胶组合物。在一个实施方案中，与天然存在的银胶菊或公众可得的银胶菊种质相比，那些银胶菊植物细胞、植物组织、幼苗、植物部分、植物及其子代具有改良的表达性状、表型和/或基因型。
本发明还涉及包括由根据本发明的植物产生或从中提取的橡胶的产品，包括用于医疗行业的轮胎和胶乳产品。
实验步骤
进行了研究以开发可用于本发明的方法的微卫星重复序列(ssr)和单核苷酸重复序列(snp)标记，包括其中使用分子标记筛选遗传多样性，进行标记辅助选择以及辅助银胶菊育种的性状渗入。
可公开获得的银胶菊表达序列标签用于开发713个ssr引物对，并在193个ssr上完成测试。用一组ssr筛选美国农业部(usda)银胶菊收集和私人种质收集的遗传多样性，以评估种质材料内和各种银胶菊遗传群体之间的遗传变异。
除了ssr之外，还开发了用于银胶菊育种的snp标记。从四个银胶菊序列文库中共鉴定出1,065个snp，并研究了多态性水平。在表9中鉴定了snp。在表11和表12中鉴定了ssr及其对应的引物。这两种标记系统提供了用于植物改良的银胶菊分子育种的独特机会。
开发银胶菊的分子标记是为了增加在银胶菊改良活动中作决策的可用信息。发现用于估计遗传多样性的标记的研究也旨在鉴定紧密连锁到性状的分子标记。具有这些有用的标记将能够在发育的早期阶段快速筛选分离的表型，从而可能节省时间和成本。
a.微卫星标记(ssr)的开发和测试
开发微卫星(简单重复序列或ssr)标记的引物的最初工作已完成。下载由usda-arselastomics项目通过ncbiest在线数据库公开提供的表达序列标签(est)。总共获得11,739个est序列，并通过使用80％的重叠同一性截断来装配重叠群，并使用掩蔽过程来鉴定重复序列、载体和细胞器序列。从重叠群中鉴定出了337个微卫星单元，而在单拷贝上鉴定出了515个微卫星单元(序列不包含足以与其他序列组合的长度的重叠)。来自重叠群的微卫星具有以下比例的重复单元：73个二核苷酸(21.7％)、242个三核苷酸(71.8％)、12个四核苷酸(3.5％)和10个六核苷酸(3.0％)。基于以下参数设计重叠群和单拷贝中微卫星单元的引物：100-500个扩增子大小、18-24bp引物大小、40％-60％g-c含量、55℃-60℃且58℃为最佳的tm。设计了来自重叠群的总共198个ssr引物，以及来自单拷贝的总共515个ssr引物(引物序列和ssr参见表11和表12)。
使用代表不同倍性水平(2x至6x)的七种银胶菊种质(11591、11604、141660、141678、az-2、s1、s3)进行初步引物测试。在每种种质材料10株至12株单株植株上获得叶组织，并且处理dna以供提取和基因分型。通过合并来自六种不同植物的dna(五种用于三倍体种质材料)来制备每种种质材料两份dna样品。
向所有198个标记的正向引物中加入18bps的m13片段，并使用fam荧光染料标记引物。聚合酶链式反应(pcr)使用applied
进一步评估93个多态性标记以使用单株植株样品来确定标记多态性并确定它们的稳健性。使用代表每种种质材料的两株到五株单株植株。在93个多态性标记中，发现54个标记是最有希望的并且易于评分，因此可以容易地用于分析整个银胶菊种质收集。另外18个标记也被确定为有用的，但这些组将需要使用荧光标记物进行进一步的性能验证。其余21个标记则被发现很难评分，但从长远来看可能具有效用。
使用上述54个标记的结果确定了单株植株样品之间的遗传距离。主坐标图示于图2中。该图示出了每个倍性水平的样品之间的遗传相似性。11591的样品的紧密成簇和低平均成对遗传距离(表1)表明，该种质材料具有比az-2更窄的遗传多样性。二倍体种群(s1和s3)比四倍体种质材料具有更高的平均成对距离值。这些初步观察结果仍有待使用更大的样本集来证实。
表1：平均种群二元遗传距离的成对种群矩阵
微卫星标记在植物的生物学研究、分子基因组学和育种计划中有许多应用。它们可用于确定分类学分类、种群结构、遗传多样性和标记-性状关联。
使用微卫星标记(ssr)对来自多倍体(n＝36)×四倍体(n＝72)银耳菊种质的第一代(f1)子代以及其亲本材料进行基因分型，以测试是否可能验证子代的亲缘关系并确认它们产生于有性重组。所使用的ssr标记是在初步测试期间被确定为最稳健的那些(93个ssr中的54个)。这54个ssr标记对应于表11中的4、5、6、8、10、12、16、18、19、24、26、37、43、51、52、58、61、68、70、71、80、93、107、108、112、114、115、118、119、126、128、132、134、139、140、143、144、156、157、158、162、164、165、170、171、180、181、183、185、186、188、195、197和198。
使用标记数据的贝叶斯聚类结果提供了关于可能的亲子和亲本繁殖模式的附加信息。图3示出了基因分型的种质的簇分配。该方法最初用于确定种群结构，但也适用于此目的。
收集来自140个银胶菊种质的叶组织用于ssr基因分型(表2)。使用15个银胶菊ssr的子集来确定育种材料之间的遗传相似性，并用usda种质收集来协助育种计划。这15个ssr标记对应表11中的4、5、10、12、18、19、68、80、93、134、139、158、185、186和188。
对于基因分型，在引物测试阶段使用的带m13尾的ssr引物由荧光标记的引物代替，该引物比m13标记的引物更稳定、更可靠，并且提供了常规基因分型所需的可重现结果。
表2.利用ssr标记进行基因分型的私人收集和usda收集中的银胶菊种质材料的列表
ssr数据分析表明，标记组的平均主要等位基因频率为0.3752，并且多态信息含量(pic)为0.7309，表明标记组具有高信息量。使用dice系数(dice，1945)对所有种质进行的成对比较具有0.3938的平均值，其中值为0.0000至0.7857(总共有9,730个成对值)。表3列出了高度相似的种质以及极其相异的种质对。
根据huff等人(1993)的方法对显性标记计算所选私人种质和usda种质之间的平均成对遗传距离，结果示于表4中。
表3.具有极其相异度值的银胶菊种质对。(样品id被标注为i和j，而成对的dice相异度值被标注为d(i，j))
表4.通过比较每种种质材料多达5个植株计算的所选的usda种质和私人银胶菊选择物之间的平均成对遗传距离
代表使用15个ssr标记的私人收集和公共收集中不同种质材料之间的遗传相似性的树示于图4中。
ssr将用于建立银胶菊的遗传连锁图谱以及鉴定数量性状基因座(qtl)。这可作为开发作图群体以确定银胶菊的各种连锁群中ssr标记分布的基础。ssr和snp都将用于评估重组事件，建立银胶菊的定量性状和定性性状中的标记-性状关联。
ssr标记可用于将下一代基因组测序数据锚定到染色体中。其中检测到标记的重叠群可用于对遗传标记序列物理作图并评估它们在遗传图谱上的位置。
来自ssr和snp的信息可用于建立未来专门的银胶菊品种的基因型信息。来自两种分子标记系统的信息将允许对种子供应以及基因流或潜在污染的鉴定和纯度测试。
b.开发并测试snp(rad-seq)标记
采用限制性位点相关dna测序(rad-seq)作为下一代测序(ngs)技术平台来获得大量的snp标记。ngs技术用于标记辅助育种的潜力已在文献中进行了综述，并且图5是来自ray，s.，andsataya，p.，2014“nextgenerationsequencingtechnologiesfornextgenerationplantbreeding，”front.plantsci(ray，s.，和sataya，p.，2014年，“用于下一代植物育种的下一代测序技术”，《植物科学前沿》)的示例。
收到来自snp发现项目的4种种质材料的四个单独叶样品。通过使用下一代测序(ngs)技术可以有效地进行snp发现工作。ngs技术和复杂性降低策略的使用可成功应用于大型复杂基因组中的snp发现，而无需参考基因组。限制性位点相关dna测序(rad-seq)通常用于基因组中的snp检测，并基于鉴定限制酶消化位点旁的多态性。双端rad测序应用于检测序列变异和设计snp标记。双端rad测序的概览示于图6中。在a分图中，用限制性核酸内切酶消化基因组dna。在b分图中，在与初级衔接子连接后，剪切片段，然后与次级衔接子连接。在c分图中，从每个限制酶消化位点回收可变长度片段的复合混合物。使用双端化学在下一代dna测序平台上对这些片段的大小进行选择、扩增和测序。在d分图中，随后通过生物信息学方法完成在每个消化位点周围的基因组装配的开发。
为了开发银胶菊的rad基因分型平台，收集来自11591、8150(cal3)、141632a(w6-429)和14m-1-12(s1)种质的叶组织样品以获得dna文库开发所需的3μg高分子量dna。如图7所示，通过琼脂糖凝胶确认dna的质量和数量。对每个样品进行dna测序，随后开发rad文库。下面示出了四个rad文库的相关统计信息。测序读段的数目表明已经测序的短dna片段的数目。
总读段数：30,211,365
每个样品的平均读段数：6,042,273
每个样品的中值读段数：6,488,899
每个样品的目标读段数：4,000,000
每个样品的读段数的标准偏差：1,899,084
符合目标读段数的样品数目：4
序列变异系数：0.31
表5
分析了银胶菊的序列数据以找到对下游基因分型具有良好特征的标记。有1,065个标记符合基因分型所需的特征(80bp的旁侧序列，在50bp内没有其他标记)。这些snp分子标记示于表9中。共设计了970个引物，并对进行标记多态性和信息性测试。
为了测试，从12种二倍体种质材料(14m-7、cal-3、hs10、hs12、hs14、hs15、hs17、hs18、hs2、hs5、hs6和w6-429)的五个植株收获叶组织并进行基因分型。
将两组引物用于二倍体种质材料的初始筛选。第一组的384个引物表明，成功扩增了379个snp，5个失败，3.6％缺失数据。在384个标记中，319个是多态的，而60个是单态的。平均等位基因频率为0.65，pic为0.28，平均杂合度为0.68。利用nei(1972)的方法估计了12种种质材料间的遗传距离(表6)。
表6.使用379个snp标记的银胶菊二倍体种质材料间的遗传距离
表7.通过rad-seq方法发现的snp序列的示例
第二组由针对同一组12种二倍体种质材料筛选的192个snp测定物组成。还鉴定了该组中的145个多态snp标记。在两个测试中总共发现有464个snp为信息性的，这些snp全部用于筛选单样品dna(与之前测试中的大量dna相反)。对单一植物dna样品上的这些标记进行随后分步测试，以评估每个标记对单株植株的有效性。分析每种种质材料的四株植株(总共48个样品)。在使用单样品dna时，在464个snp中，仅发现348个是多态性的，因此这些是用于常规分析的优选组。
多样性分析和用于杂交的亲本选择
收集来自1,144个二倍体银胶菊种质的叶组织用于snp基因分型。使用348个snp的组来确定这些育种材料之间的遗传相似性以及与usda二倍体种质收集和代表性多倍体种质的遗传相似性。来自nei距离的总邻接树示于图8中。有四个主要簇表示种质类群。usda二倍体种质w6-429和cal-3按14m-7和6种hs分组。有一个独特的组包含g7-11(8817、8816)和其他多倍体以及hs16。
图9示出了一个详细的树，其中所有单株植株按hs和种质材料分组进行颜色编码。一些hs与具有非常相似的基因型的单株植株在遗传上一致(例如.hs10、hs12、hs13、hs16、hs17和hs18)，而另一些则显示出遗传上的混合(例如，hs2、hs5和hs6)。
估计来自348个snp标记的二倍体hs的平均总期望杂合度(基因多样性)为0.37。在14m-7上观察到最高的杂合度(0.43)，而在hs14上观察到最低的杂合度(0.32)。图10示出了二倍体的所有snp基因座上的期望杂合度。
在图11中示出了二倍体种质材料之间和之内的相似性。来自这些遗传关系的信息在为育种计划选择遗传距离较远(不太相似)的亲本时很有用。
c.银胶菊种质的无融合生殖率分析
在本发明的另一方面，测定银胶菊种质的无融合生殖率并将其用于培育银胶菊，包括选择银胶菊种质以产生先进的银胶菊植株、种子或植物组织。在本发明的另一个实施方案中，用于培育银胶菊植物的方法包括使用得到的关于植物的无融合生殖率的信息来确定一种或多种银胶菊植物的无融合生殖率，以鉴定一种或多种所选的银胶菊植物，以供在银胶菊植物育种中使用从而产生先进的银胶菊植株、种子或植物组织。在另一个优选的实施方案中，通过流式细胞术确定无融合生殖率。在另一个优选的实施方案中，从叶样品、种子样品或两者确定无融合生殖率。本发明还涉及由这种育种方法产生的银胶菊植物、种子和植物组织。这些方法中提到的植物组织包括由银胶菊植物产生的天然橡胶。
在另一个实施方案中，用于培育银胶菊的方法包括(a)确定一种或多种银胶菊植物的无融合生殖率，(b)确定一种或多种银胶菊植物的遗传谱系；以及(c)使用关于无融合生殖率和遗传谱系的信息鉴定一种或多种所选的银胶菊植物，以供用于在银胶菊植物育种中产生先进的银胶菊植物、种子和植物组织。在优选的实施方案中，使用单核苷酸多态性(snp)或单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸简单重复序列(ssr)的dna进行dna分析。在另一个优选的实施方案中，通过流式细胞术确定无融合生殖率。在另一个优选的实施方案中，由叶样品、种子样品或两者确定无融合生殖率。本发明还涉及由这种育种方法产生的银胶菊植物、种子和植物组织。这些方法中提到的植物组织包括由银胶菊植物产生的天然橡胶。
为了增强银胶菊育种，研究了银胶菊种质的无融合生殖率。银胶菊具有一系列繁殖类型的种群，从有性二倍体植物到兼性无融合生殖多倍体品系。由于多倍体集合中兼性无融合生殖的复杂化，通过传统育种进行植物改良一直是银胶菊的挑战。
如表8所示，花粉活力还可涉及植物是多倍体、四倍体还是二倍体。
表8.花粉活力(多倍体、四倍体和二倍体)
银胶菊多倍体涵盖了三倍体(2n＝3x＝54)到八倍体(2n＝8x＝144)。多倍体产生自4x(4x＝72)母体植物减少和未受精。在倍性分析仪上，当对叶组织采样时，它们可以看起来与二倍体相同但繁殖不同。
在20世纪40年代的“emergencyrubberproject”期间，通过对根尖或花粉母细胞中的染色体进行计数并用适当的染色剂对多倍体进行了研究。使用新型研究技术和设备可以提高对多倍体的了解，而这种方式以前过于劳动密集而不切实际。这方面的一个示例是使用台式倍性分析仪(流式细胞仪)，这是一种用于测量胚胎和胚乳倍性的快速且简易的技术。流式细胞术(或倍性分析)允许分析种群中的数百株植物，并鉴定每个的倍性。由于大多数品系或种群都是兼性无融合生殖，这是非常有价值的信息。
这种技术还扩展到不仅分析植物的倍性，而且还确定性繁殖类型和非性繁殖类型的发生率。这种方法结合分子标记可以成为识别银胶菊育种项目中新型遗传多样性的非破坏性方法。
在这个实验中采用了一种新颖的方法，其使用由单一植物产生的种子来利用胚胎和胚乳倍体数目的组合来检测从这种单一植物发生的繁殖类型，称为无融合生殖率。虽然这种方法在技术上具有破坏性，但是无融合生殖率的知识是有价值的，一旦它是已知的，则可以在叶组织中鉴定分子标记以区分有性类型和无性(无融合生殖)类型，并允许从所得的性繁殖中选择植物，以获得更大的遗传多样性来改良橡胶。
美国农业部国家植物种质系统(npgs)包含51份银胶菊(p.argentatum)的种质资源加上种间杂种的种质资源。除了两个二倍体银胶菊收集之外，所有收集均通过无融合生殖来繁殖；这两个二倍体种质资源是有性繁殖。本研究的目的是估计无融合生殖率，以及大孢子母细胞是否存在减数分裂的减少以及是否有受精来形成胚胎。作为本研究对象的种质包括两种基本类型-2种二倍体(有性繁殖)种质资源和48种多倍体(兼性无融合生殖)种质资源。多倍体范围从三倍体(3x＝54)到八倍体(8x＝144)。所有的种质在美国农业部的种质资源信息网络(grin)中公开发布。
对母体植物的嫩叶组织和来自这些植物的100个子代种子进行分析，以估计它们的无融合生殖率。由于两种不同种子结构(胚胎和胚乳)的倍性水平，该种子提供了额外的见解。在uv染料中制备二倍体叶样品作为对照以校准倍性分析仪。在uv染料中将种子样品切碎以制备具有2x叶样品的样品，并在倍性分析仪中进行分析。
该研究试图鉴定该种子产生的四种潜在繁殖类中的哪一种：(1)卵+受精的减数分裂的减少；(2)卵+不受精的减数分裂的减少；(3)卵+受精的减数分裂没有减少；以及(4)卵+不受精的减数分裂没有减少。结果可能表明早期的假设：(1)胚囊发育和(2)雄性(花粉)中的正常减数分裂并非总是如此。该研究的结果表明，如果仅使用叶样品，则不会鉴定离型子代(种子)，从而导致对加入无融合生殖率的估计过高。三倍体中的隔离就是一个示例。
例如，四倍体x四倍体可以涉及如图12所示的繁殖类别。
这些结果可有助于指导银胶菊的育种项目，并更好地利用由减少和/或受精造成的植物导致的新重组。该技术还将有助于更好地表征新的育种品系和代代相传的预期变异量。
还研究了种子成熟度和核染色。收集了来自不同发育阶段(早期、中期和晚期)的植物头部种子。如图13至图14所示，结果表明胚胎倍性在所有发育阶段均可检测到。
usda的收集r1100-4x的无融合生殖率为93％。usda的收集11604-2x多倍体的无融合生殖率为0％。进一步的研究和分析将进一步扩大这项技术在开发改良银胶菊植物和由此类植物生产的橡胶中的实用性。
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