一种诱导西洋参愈伤组织的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然产物领域，具体地说涉及西洋参不同外植体愈伤组织的诱导方 法。
【背景技术】
[0002] 西洋参（Panax quinquefolium)系五加科人参属多年生草本植物，生长于北美原 始森林中的古老植物，具有"活化石"之称，是一种名贵药材，药用和经济价值高。我国自20 世纪80年代大面积引种西洋参成功以来，已发展成为继美国、加拿大后世界第三大西洋参 生产国和世界第一大消费国。西洋参味苦，性凉，入心、肺、肾经，以补益为主，可滋阴降火、 益气生津。服用方法分为煮、炖、蒸食、切片含化、研成细粉冲服等。西洋参中含有皂甙、多 糖、黄酮类、挥发油、微量元素等丰富的生理活性物质，对人体具有补益作用，在免疫调节、 抗癌、抗衰老等方面有独特效果，因此常用于保健品或"补品"而受到青睐。
[0003] 无论野生或人工栽培的西洋参，因自身生理特性，生长缓慢，大多在4至6年才能 收获入药（主要药效成分是"西洋参皂甙")，且西洋参种子资源稀少，价格昂贵。因此，开展 西洋参细胞培养技术，工厂化方法生产人参皂甙，具有十分巨大的意义和市场前景。西洋参 细胞培养是指在无菌条件下，将离体的西洋参器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、 种子等）、组织、细胞、胚胎、原生质体等外植体，在人工控制的培养基上，给予适宜的环境条 件，诱导产生愈伤组织或潜伏芽，或长成完整的植株。本发明主要侧重于诱导西洋参不同外 植体（叶片、茎段、主根、须根、种胚），获得疏松、活跃的愈伤组织，为西洋参细胞培养、实现 工厂化生产生理活性物质一一皂甙提供前期材料准备和理论依据，对实际应用具有指导意 义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种诱导西洋参愈伤组织的方法，包含原料消毒步骤和愈伤组织诱导 培养步骤，其中消毒是用0. 1-0. 3%取(：12与75%酒精组合进行消毒，其中愈伤组织诱导培 养是将消毒后的原料接种于诱导培养基上，进行诱导培养。
[0005] 西洋参不同外植体的消毒条件与消毒效果有直接关系，控制0. 1%取(：12与75% 酒精处理的消毒时间。本方法中通过控制不同外植体的不同的消毒时间，确保外植体的存 活率及降低污染率，为愈伤组织的诱导提供条件。
[0006] 在本发明的一个具体的实施方式中，其中所述的原料为叶片、茎、主根、须根、种 胚。
[0007] 本发明中原料获得与选择：（1)在西洋参种植地取2年生西洋参完整植株，保持材 料的低温、新鲜带回实验室，部分植株立即进行预处理，另一部分植株移植在花盆中，置于 树荫下，保持湿润和新鲜，使其正常生长，作为外植体采集源；（2)取经过后熟处理，并且已 经"开口的西洋参种子"，取回实验室，5°C冷藏。使用时除去种皮，取出饱满籽粒，用清水反 复清洗，并将部分种子接种于带有湿润纱布的培养皿中，每皿20- 30颗，恒温（23- 28°C ) 条件下暗箱培养，以获得"新鲜、无菌西洋参苗"，另一部分种子经升汞、酒精消毒后清水冲 洗，接种于MS培养基，以获得"无菌苗"。
[0008] 在本发明另一个【具体实施方式】中，所述的诱导西洋参愈伤组织的方法，其 中诱导培养基为 MS+2. 5-3. 5mg/L2, 4-D+0. 5-0. 8mg/L 6-BA 或者 MS+2. 0-3. Omg/L 2, 4-D+6. 0-9. Omg/L GA3或者 MS+2. 0-3. 0mg/L2, 4-D+3. 0-4. 5mg/LGA3。
[0009] 在本发明另一个【具体实施方式】中，所述的诱导西洋参愈伤组织的方法，其中，对于 叶片、茎段、主根、须根，诱导培养基为MS+2. 5-3. 5mg/L2, 4-D+0. 5-0. 8mg/L6-BA;对于种 胚，诱导培养基为MS+2. 0-3.Omg/L2, 4-D+6. 0-9.Omg/LGA3;对于西洋参无菌苗培养为， MS+2. 0-3. 0mg/L2, 4-D+3. 0-4. 5mg/LGA3;其中，西洋参无菌苗为西洋参种仁经升汞、酒精消 毒后接种于MS培养基，获得的无菌苗。
[0010] 本发明培养基激素水平的确定：通过L16(45)正交试验确定2, 4-D、KT、6-BA、NAA、 IBA五种常用激素对西洋参不同外植体（叶片、茎段、主根、须根）诱导愈伤组织的影响，通 过控制2, 4-D与GA3浓度，确定西洋参种胚所需的诱导激素配方。
[0011] 在本发明另一个【具体实施方式】中，所述的诱导西洋参愈伤组织的方法， 其中消毒条件为，根：75 %酒精10s-15s+30min 0? 1-0. 3 % HgCl2;叶片：75 %酒精 8s-12s+15min0. 1-0. 3% HgCl2;茎段：75% 酒精 10s-15s+25min 0? 1-0. 3% HgCl 2;种坯： 75%酒精 15s-20s+30min 0? 1-0. 3% HgCl2。
[0012] 在本发明另一个【具体实施方式】中，所述的诱导西洋参愈伤组织的方法，还包括原 料预处理步骤，选取完整植株及种胚，清水冲洗，并用0. 1-0. 3 %的洗衣粉溶液漂洗，再流 水冲洗l-3h，移至无菌室，备用消毒。
[0013] 在本发明另一个【具体实施方式】中，所述的诱导西洋参愈伤组织的方法，还包括消 毒后，原料切分步骤，其中叶片沿叶脉剪成I.OcmXI.Ocm左右的块状片段；茎段材料，选择 粗壮部分，用剪刀等器具剪除去与消毒液直接接触的部位，然后剪成I.Ocm左右的片段；主 根材料，切成薄片，厚度在〇.1-〇.2mm;种子材料，经预处理开口的种子可直接接种。
[0014] 在本发明另一个【具体实施方式】中，所述的诱导西洋参愈伤组织的方法，培养温度 为23-28± I°C，pH=4. 6-6. 5(灭菌前），暗培养。本发明中，实验采用500mL三角瓶，每瓶 接种8-12个段片材料，每种外植体接种5-10瓶。
[0015] 综上，本发明的目的是通过以下技术措施来实现：一种诱导西洋参愈伤组织的方 法。步骤如下：
[0016] 原料选择一预处理一消毒一接种一培养。
[0017] 本发明还涉及一种用于诱导西洋参愈伤组织的培养的培养基，其特征在于含有 MS+2. 5-3. 5mg/L 2, 4-D+0. 5-0. 8mg/L 6-BA 或者 MS+2. 0-3. Omg/L 2, 4-D+6. 0-9. Omg/L GA3 或者 MS+2. 0-3. 0mg/L 2, 4-D+3. 0-4. 5mg/L GA3。
[0018] 优选地，对于叶片、茎段、主根、须根，诱导培养基为MS+2. 5-3. 5mg/ L2, 4-D+O. 5-0. 8mg/L6-BA;对于种胚，诱导培养基为MS+2. 0-3. 0mg/L2, 4-D+6. 0-9. 0mg/L GA3;对于西洋参无菌苗培养为，MS+2. 0-3. 0mg/L2, 4-D+3. 0-4. 5mg/LGA3;其中，西洋参无菌 苗为西洋参种仁经升汞、酒精消毒后接种于MS培养基，获得的无菌苗。
[0019] 本发明具有以下优点：
[0020] 1、本发明采用并且比较不同原材料的西洋参采集源：新鲜完整3年生植株、新鲜 刚刚出苗1个月的西洋参苗、无菌苗（幼苗）。目的是：有利于西洋参细胞培养和后续工作 的开展；
[0021] 2、系统研宄了西洋参不同外植体的消毒条件，避免因消毒不彻底引发的污染及消 毒剂对外植体的过度损害；
[0022] 3、通过L16(45)正交试验确定了五种常用激素对西洋参不同外植体愈伤组织诱导 的影响，有利于西洋参细胞培养中的外源激素选择；
[0023] 4、在种胚的处理过程中出现了两种情况（无菌苗、愈伤组织），种胚直接诱导的愈 伤长势好、