专利名称：制备鸟苷二磷酸——岩藻糖的方法
技术领域：
本发明涉及制备鸟嘌呤核苷5’-二磷岩藻糖(后文称作”GDP-岩藻糖”)和鸟嘌呤核苷5’-二磷4-酮基-6-脱氧甘露醇(后文称作”GKDM”)的方法。GDP-岩藻糖的使用价值在于例如它作为复合碳水化合物的合成基质，应用于免疫疗法防止由细菌、病毒等引起的感染和心血管疾病。同时，GKDM也是有用的，例如它作为制备GDP-岩藻糖的中间体。
已知的制备GDP-岩藻糖的方法是化学合成法(碳水化合物研究，24269(1993))，但是，该方法在立体选择性和基质的供给方面存在缺陷。该方法中所使用的酶(农业生物化学，48823(1984)，WO93／08205，WO99／09180)不适合大批量的生产，因为这些酶所使用的原料价值昂贵。另外，这些酶还需要复杂的纯化步骤。目前已经开发出利用微生物活性制备该物质的可行的方法(WO98／12343)，但是，在工业制备中采用该方法还需要进一步对其进行改变。除此之外，人们已知由GDP-甘露糖生物合成GDP-岩藻糖中的作为起始酶的GDP-甘露糖4，6-脱水酶的活性受到终产物GDP-岩藻糖的抑制(生物化学生物物理学报，11779(1966)；FEBS Lett．，412126(1997))。
本发明的一个目的是提供制备GDP-岩藻糖和GKDM的有效方法。
本发明提供了上述目的和其他的目的，涉及下面(1)至(18)的内容。
(1)一种制备GDP-岩藻糖的方法，包括使GKDM和一种酶源存在于含水介质中，其中所述的酶源是能够将GKDM转化为GDP-岩藻糖之微生物的培养液或该培养液的处理产物；在该含水介质中形成和积聚GDP-岩藻糖；和从上述含水介质中回收GDP-岩藻糖。
(2)一种制备GDP-岩藻糖的方法，包括使鸟嘌呤核苷5’-三磷酸盐(后文称作”GTP”)前体、糖和酶源存在于含水介质中，其中所述的酶源是能够使GTP前体形成GTP之微生物的培养液或该培养液的处理产物，以及能够使糖和GTP形成GKDM之微生物的培养液或该培养液的处理产物；
在该含水培养基中形成和积聚GKDM；使用作为酶源的能够将GKDM转化为GDP-岩藻糖之微生物的培养液或该培养液的处理产物，将积聚的GKDM转化为GDP-岩藻糖，在含水培养基中形成和积聚GDP-岩藻糖；和从该含水培养基中回收GDP-岩藻糖。
(3)一种制备GKDM的方法，包括使GTP前体、糖和酶源存在于含水培养基中，其中酶源是能够使GTP前体形成GTP之微生物的培养液或该培养液的处理产物，以及能够使糖和GTP形成GKDM之微生物的培养液或该培养液的处理产物；在该含水培养基中形成和积聚GKDM；和从该含水培养基中回收GKDM。
(4)根据(1)、(2)或(3)的方法，其中所述的培养液的处理产物选自以所述培养液的浓缩产物、所述培养液的干燥产物、纯化该培养液得到的细胞、该细胞的干燥产物、该细胞的冷冻干燥产物、该细胞的表面活性剂处理的产物、该细胞的超声波处理的产物、该细胞的机械研磨处理的产物、该细胞的溶剂处理的产物、该细胞的酶处理的产物、该细胞的蛋白质部分、该细胞的固化产物和从该细胞提取获得的酶制剂。
(5)根据(2)或(3)的方法，其中GTP前体选自鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、黄苷、肌苷、鸟苷5’-一磷酸、黄苷5’-一磷酸和肌苷5’-一磷酸。
(6)根据(2)或(3)的方法，其中糖选自葡萄糖、果糖和甘露糖。
(7)根据(2)或(3)的方法，其中能够使GTP前体形成GTP的微生物选自属于棒状杆菌属的微生物。
(8)根据(7)的方法，其中微生物是产氨棒杆菌。
(9)根据(2)或(3)的方法，其中能够使糖和GTP形成GKDM的微生物为至少一种微生物。
(10)根据(9)的方法，其中至少一种微生物是选自属于埃希氏杆菌属和棒状杆菌属的至少一种微生物。
(11)根据(11)的方法，其中属于埃希氏杆菌属的微生物是大肠杆菌。
(12)根据(12)的方法，其中属于棒状杆菌属的微生物是产氨棒杆菌。
(13)根据(2)、(3)的方法，其中能够使糖GTP形成GKDM的微生物是酶活性强的微生物，至少一种酶选自葡糖激酶(后文称作”glk”)、磷酸甘露糖变位酶(后文称作”manB”)、甘露糖1-磷酸盐鸟苷酰基转移酶(后文称作”manC”)、磷酸葡萄糖变位酶(后文称作”pgm”)、磷酸果糖激酶(后文称作”pfk”)和GDP-甘露糖4，6-脱水酶(后文称作”gmd”)。
(14)根据(13)的方法，其中微生物是具有重组DNA的至少一种微生物，该重组DNA包括一个载体和DNA片段，DNA片段含有至少一种选自以下的基因glk-编码基因、manB-编码基因、manC-编码基因、pgm-编码基因、pfk-编码基因和gmd编码基因。
(15)根据(14)的方法，其中glk-编码基因、manB-编码基因、manC-编码基因、pgm-编码基因、pfk-编码基因或gmd编码基因是从大肠杆菌产生的基因。
(16)根据(1)或(2)的方法，其中能够将GKDM转化为GDP-岩藻糖的微生物是具有强GKDM差向异构酶／还原酶(后文称作”wcaG”)活性的微生物。
(17)根据(16)的方法，其中微生物是具有重组DNA的微生物，该重组DNA包括一个载体和一个含有wcaG-编码基因的DNA片段。
(18)根据(17)的方法，其中wcaG-编码基因来自大肠杆菌。
图1表示能够表达glk、manB和manC的质粒pNK11的构建步骤。
图2表示能够表达gmd的质粒pGE19的构建步骤。
图3表示能够表达wcaG的质粒pGE8的构建步骤。
本申请的基础是1999年8月10日申请的日本专利申请公开11-225889，该申请的全部内容在此引作参考文献。
为了达到上述和其他的目的，本发明人进行了深入的研究，出乎预料地发现GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性受GDP-岩藻糖的抑制能够避免，因此，可以有效地形成GDP-岩藻糖，方法是形成和积聚GKDM(GDP-岩藻糖的前体)，然后将积聚的GKDM转化成GDP-岩藻糖。
本发明的方法优选在能够使GTP前体形成GTP之微生物的培养液或该培养液的处理产物中进行。只要具有这样的活性，可以使用任何微生物。合适的GTP前体是已知的，包括后面所述的那些。所述微生物的例子包括属于埃希氏杆菌属和棒状杆菌属的那些微生物。
属于埃希氏杆菌属的微生物的例子包括大肠杆菌等，属于棒状杆菌属的微生物的例子包括产氨棒杆菌等。特定的例子包括产氨棒杆菌ATCC21170等。
另外，本方法还优选在能够使糖和GTP形成GKDM之微生物的培养液或该培养液的处理产物中进行。合适的糖也是已知的，包括以后记载的那些糖。这些微生物的例子包括至少一种酶具有强活性的微生物，所述的酶选自glk、manB、manC、pgm、pfk和gmd。具有强活性酶的上述微生物是指比亲本菌株的酶活性提高的具有至少一种选自glk、manB、manC、pgm、pfk和gmd的酶的微生物。该亲本菌株是指在构建变种、细胞融合株、转导或重组株中用作起端的微生物。比亲本菌株的酶活性提高的具有至少一种选自上述酶的微生物可以是任何的变种、细胞融合株、转导和重组株。
上述微生物的例子包括属于埃希氏杆菌属和棒状杆菌属的微生物。优选的例子包括大肠杆菌和产氨棒杆菌。
此外，还可以利用转化株，其中选自glk、manB、manC、pgm、pfk和gmd的至少一种酶的活性经重组DNA技术得以提高。它们的例子包括具有包含来自大肠杆菌的glk基因的重组DNA(pNK11)的大肠杆菌NM522(细菌学杂志，1791298(1997))；包含来自大肠杆菌的manB基因的重组DNA(pNK11)的大肠杆菌NM522(细菌学杂志，1784885(1996))；包含来自大肠杆菌的manC基因的重组DNA(pNK11)的大肠杆菌NM522(细菌学杂志，1784885(1996))；包含来自大肠杆菌的pgm基因的重组DNA(pNT55)的大肠杆菌NM522(细菌学杂志，1761298(1994))(WO98／12343)；包含来自大肠杆菌pfkB基因的重组DNA(pNT55)的大肠杆菌NM522(基因，28337(1984))(WO98／12343)；包含来自大肠杆菌的gmd基因的重组DNA(pGE19)的大肠杆菌NM522(细菌学杂志，1784885(1996))；等等。
如果微生物能够使GTP前体形成GTP，而且同时能够使糖和GTP形成GKDM，那么通过该微生物就能够使GTP前体和锗形成GKDM。此外，在微生物一个菌株中仅具有使糖和GTP形成GKDM所需的部分活性的情况下，可以通过适当地混合至少两种微生物来形成GKDM。
只要是具有上述的转化活性，本发明可以使用能够使GKDM转化为GDP-岩藻糖的任何微生物。例如，可以使用具有强wacG活性的微生物。
具体地说，可以例举的属于埃舍利希氏杆菌属或棒状杆菌属的微生物例如有大肠杆菌、产氨棒杆菌，等等。
另外，还可以使用通过重组DNA技术KDM差向异构酶／还原酶活性提高的转化株。它们的例子包括含有大肠杆菌wacG基因的重组DNA(pGE8)的大肠杆菌NM522。
在上述使用重组DNA技术制备GDP-岩藻糖和GKDM中，根据已知的方法可以进行各种与基因重组有关的操作，例如，来自微生物的质粒DNA的分离和纯化，质粒DNA与限制酶的消化，消化的DNA片段的分离和纯化，DNA片段的酶连接，使用重组DNA的转化等(例如，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)(后文称作”分子克隆，第二版”)和分子生物学的当前进展，John Wiley & Sons(1987-1997)(后文称作”当今分子生物学进展”))。此外，根据已知的方法(PCR方案，学术出版社(1990))也可以进行聚合酶链反应(后文称作”PCR”)。
与形成GDP-岩藻糖或GKDM有关的基因能够表达在一宿主中利用限制酶或通过PCR将含有该基因的DNA片段制成具有合适长度的含有该基因的DNA片段，将所得的片段插入到合适的表达载体的启动子的下游，然后将该DNA-插入表达载体引入到适合该表达载体的宿主细胞中。
只要能够表达该目的基因，可以使用任何细菌，如酵母等作为宿主细胞。
表达载体的例子包括在上述宿主细胞中能够自动复制或能够被整合进入染色体的那些表达载体，并在转录该目的基因的位置上含有启动子。
当使用原核生物如细菌等作为宿主细胞时，优选基因表达载体能够在该原核生物中自动复制，并且是由启动子、核糖体结合序列、目的DNA和转录终止序列构建的重组DNA。
表达载体的例子包括pKK2233和pGEX-2T(它们由Amersham PharmaciaBiotech Co．制造)，pSE280(由Invitrogen Co．制造)，pGEMEX-1(由Promega Co．制造)，pQE-30(由Quiagen Co．制造)，pET-3(由Novagen Co．制造)，pKYP10(日本公开的未审专利申请110600／83)，pKYP200(农业生物化学，48669(1984))，pLSAl(农业生物化学，53277(1989))，pGEL1(美国国家科学院院报，824306(1995))，pBluescript ⅡSK+(由Stratagene Co．制造)，pBluescriptⅡSKˉ(由Stratagene Co．制造)，pTrS30(由大肠杆菌JM109／pTrS30(FERMBP-5407)制备)，pTrS32(由大肠杆菌JM109／pTrS32(FERM BP-5408)制备)，pUC19(基因，33103(1985))，pSTV28(由Takara Shuzo Co．，Ltd．制造)，pUC118(由Takara Shuzo Co．，Ltd．制造)，pPAC31(WO98／12343)，等等。
只要能够在宿主细胞例如大肠杆菌等中起作用，可以使用任何启动子。它们的例子包括来自细菌或噬菌体的启动子，如trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子(PL)，PR启动子，PSE启动子等，SPO1启动子，SPO2启动子，penP启动子等。另外的例子还包括人工设计和改变的启动子，例如两个Ptrp串联连接制成的启动子、tac启动子、Lac T7启动子和Let I启动子。
优选使用质粒，其中作为核糖体结合顺序的Shine-Dalgarno顺序与起始密码子之间的空间控制在合适的距离(例如6至18个碱基)。
在本发明的重组DNA中，转录终止序列不总是需要目的DNA的表达；但是，优选在该结构基因下排列转录终止序列。
原核生物的例子包括埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、微杆菌属、假单胞菌属。特定的例子包括大肠杆菌XL1-Blue，大肠杆菌XL1-Blue，大肠杆菌XL2-Blue，大肠杆菌DH1，大肠杆菌MC1000，大肠杆菌W1485，大肠杆菌NM522，大肠杆菌JM109，大肠杆菌HB101，大肠杆菌49，大肠杆菌W3110，大肠杆菌NY49，无花果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、Brevibacteriumimmariophilum ATCC14068、解糖短杆菌ATCC 14066、产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870、嗜氨微杆菌ATCC 15354、假单胞菌D-0110，等等。
作为引入重组DNA的方法，可以使用任何方法，只要是该方法能够将该DNA引入宿主细胞，例如，使用钙离子的方法(美国国家科学院院报，692110(1972))，原生质体方法(日本公开的未审专利申请248394／88)，电穿孔方法(Nucleic AcidsResearch，166127(1988))等。
当酵母菌株用作宿主细胞时，所用的表达载体的例子包括YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Yep50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
只要能够在酵母菌株中起作用，可以使用任何启动子。它们的例子包括pH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFá1启动子、CUP1启动子等。
宿主细胞的例子包括属于糖酵母属、裂殖糖酵母菌属、克鲁维氏酵母属、丝孢酵母属、许旺氏酵母属、毕赤氏酵母属、假丝酵母属等。特定的例子包括啤酒糖酵母、粟酒裂殖糖酵母、乳克鲁维氏酵母、茁芽丝孢酵母、河岸许旺氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、产朊假丝酵母等。
作为引入重组DNA的方法，可以使用任何方法，只要是该方法能够将该DNA引入酵母。它们的例子包括电穿孔方法(Methods in Enzymol．，194182(1990))，球状体方法(美国国家科学院院报USA，814889(1984))，乙酸锂方法(J．Bacteriol．，153163(1983))等。
在培养基中培养本发明的转化株可以根据通常用来培养宿主的方法进行。
作为培养用原核生物获得的转化株的培养基，可以使用任何一种天然培养基和合成培养基，只要该培养基含有能够被生物体同化并能有效培养该转化株的碳源、氮源、无机盐等，作为宿主的原核生物例如大肠杆菌等，或真核生物如酵母等。
作为碳源可以使用能够被生物体同化的任何原料。它们的例子包括碳水化合物(例如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉、淀粉水解产物等)，有机酸(例如乙酸、丙酸等)，醇(例如乙醇、丙醇等)，等等。
氮源的例子包括氨、无机或有机酸的铵盐(例如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等)，其他含氮的化合物，蛋白胨，肉提取物，酵母浸出物、玉米浆、酪蛋白水解产物、大豆粉、大豆粉的水解产物、各种发酵过的细胞和它们的消化物等。
用于培养基的无机原料的例子包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
通常是在需氧条件下进行上述培养，例如摇瓶培养法、浸没需氧搅拌培养法等。培养的温度优选15-40℃，培养的时间通常是5小时至7天。在培养的过程，培养基pH控制在3．0至9．0。利用无机或有机酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨等调节pH。
另外，在培养的过程可以在该培养基中选择添加抗生素如氨苄青霉素和氯霉素等。
当对用表达载体转化的微生物(表达载体中以可诱导的启动子用作启动子)进行培养的时候，培养基中可以选择地添加诱导物。例如，当对用lac启动子的表达载体转化的微生物进行培养的时候，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷；当对用trp启动子的表达载体转化的微生物进行培养的时候，可以添加吲哚丙烯酸。
当在本发明的方法中使用至少两种微生物时，这些微生物可以使用各自的培养基分别培养，或同时接种至单独的培养器中进行混合培养，然后使用所得的培养液。此外，在任何一种微生物的培养过程或完成之后，接种剩余的微生物并培养，使用该得到的培养液。
经培养获得之微生物的培养液或在各种处理之后该培养液的处理产物可以用作本发明方法含水培养基中的酶源。
该培养液的处理产物的例子包括该培养液的浓缩产物、该培养液的干燥产物、离心分离该培养液得到的细胞、该细胞的干燥产物、该细胞的冷冻干燥产物、该细胞的表面活性剂处理的产物、该细胞的超声波处理的产物、该细胞的机械研磨处理的产物、该细胞的溶剂处理的产物、该细胞的酶处理的产物、该细胞的蛋白质部分、该细胞的固化产物、由该细胞提取得到的酶制剂，等等。
本发明方法中的微生物的用量基于湿细胞为1至500g／l，优选5至300g／l。而且，当同时使用至少两种微生物进行反应时，含水培养基中全部微生物湿细胞的量是2至500g／l，优选10至400g／l。
本发明方法所用的GTP前体的例子包括鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、黄苷、肌苷、鸟苷5’-一磷酸、黄苷5’-一磷酸和肌苷5’-一磷酸等。只要污染物不会抑制反应，所用的前体包括纯化的化合物、前体的盐、通过微生物发酵制得的含有前体的培养液或由该培养液部分纯化的前体。GTP前体的使用浓度为0．1mM至1．0M，优选0．01至0．5M。
本发明方法使用的糖的例子包括葡萄糖、果糖、甘露糖及其衍生物等。只要污染物不会抑制反应，糖可以是纯化的产品或含有所述糖的原料。该糖可以在反应的开始一次全部添加，或者在反应过程中分别或连续添加。所用的糖的浓度是0．1mM至2．0M。
在本发明的方法中，还可以选择性地添加能量供体、辅酶、磷酸根离子、镁离子、螯合剂(如植酸等)、表面活性剂和有机溶剂。
只要能促进反应，可以使用任何化合物作为能量供体。它们的例子包括碳水化合物(如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)、有机酸(如丙酮酸、乳酸、乙酸等)、氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸等)、糖蜜、淀粉水解产物等。该能量供体的使用浓度是1．0mM至2．0M。
磷酸根离子的例子包括正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸、聚磷酸、偏磷酸、无机磷酸盐(如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等)等等。磷酸根离子的使用浓度是1．0mM至1．0M。
镁离子的例子包括无机镁盐(如硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等)、有机镁盐(如柠檬酸镁等)等。该镁离子通常的使用浓度是1至100mM。
只要能促进反应，可以使用任何表面活性剂。它们的例子包括非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯十八烷基胺(例如由NOF公司制造的Nymeen S-215)等)、阳离子表面活性剂(例如溴化十六烷基三甲铵、杀藻铵(如由NOF公司制造的Cation F2-40E)等)、阴离子表面活性剂(如月桂酰肌氨酸盐等)、叔胺(例如烷基二甲基胺(如由NOF公司制造的叔胺FB)等)等，它们可以单独使用或至少以两种混合的形式使用。该表面活性剂的通常使用浓度是0．1至50g／l。
有机溶剂的例子包括二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等。该有机溶剂通常的使用浓度是0．1至50ml／l。
用于本发明方法的含水培养基的例子包括水、缓冲剂(如磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷缓冲剂等)、醇(如甲醇、乙醇等)、酯(例如乙酸乙酯等)、酮(例如丙酮等)、酰胺(如乙酰胺等)等。另外，微生物的培养培养基还可以使用含水培养基。
本发明的方法在含水培养基中进行1至96小时，pH为5至10，优选pH为6至8，温度为20至50℃。
在含水培养基中形成的GDP-岩藻糖和GKDM可以根据WO98／12343中所述的方法利用HPLC等进行测定。
在含水培养基中形成的GDP-岩藻糖和GKDM根据通常方法使用活性碳或离子交换树脂进行回收(碳水化合物研究，24269(1993))。
本发明优选的实施方案记载于以下的实施例中，但是，本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1构建表达glk、manB、manC、pgm和pfkB的菌株利用由Perceptive Biosystems公司制造的8905型DNA合成合成剂合成具有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA引物和具有SEQ ID NO2核苷酸序列的DNA引物。
使用这些合成的DNA引物，作为模板利用含glk基因的质粒pNT46(WO98／12343)DNA进行PCR。使用40μl的反应溶液进行PCR，该反应溶液含有1ng的pNT46 DNA、0．5μM的一种引物、2．5单位的Pfu DNA聚合酶(由Stratagene公司制造)、4μl×10的作为Pfu DNA聚合酶的缓冲剂(由Stratagene公司制造)和200μM的一种deoxyNTP，94℃1分钟、42℃2分钟和72℃3分钟的循环重复30次。
使1／10体积的反应溶液进琼脂糖凝胶电泳以确定目的片段的扩增，然后剩余的反应溶液与相同体积的TE(10mM Tris-HCL(pH8．0)和1mM的EDTA)-饱和苯酚／氯仿(1体积／1体积)混合。
离心分离上述混合物后，所得的上层与两体积的冷乙醇混合，该混合物于-80℃下静置30分钟。离心分离所得溶液，得到DNA沉淀。
该DNA沉淀溶解在20μl的TE中。用5μl的所得溶液，利用限制酶BglⅡ和SalⅠ消化DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离所得的DNA片段，然后使用Gene CleanⅡ试剂盒回收1．3kb的片段。
利用限制酶BglⅡ和SalⅠ消化manB和manC表达质粒pNK7(WO98／12343)(0．2μg)，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，然后用相同的方法回收8．2kb的片段。
使用连接试剂盒，在16℃下1．3kb和8．2kb的片段进行连接反应16小时。使用连接反应溶液，根据上述已知的方法转化大肠杆菌NM522，所得的转化株涂在含有50ìg／ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，随后在30℃下培养过夜。
根据上述已知的方法从生长的转化株的菌落提取质粒，得到能够表达glk、manB和manC的质粒pNK11。该质粒的结构由限制酶消化确定(
图1)。在
图1中，符号“Ampr”和”cI857”分另表示抗氨芐青霉素基因和cI857阻遏物。
使用所得的质粒pNK11，根据已知的方法转化大肠杆菌NM522／pNT55(WO98／12343)，得到的转化株涂在含有50ìg／ml氨苄青霉素和10μg／ml氯霉素的LB琼脂培养基上，随后在30℃下培养过夜。通过选择生长的转化株，得到作为能够同时表达glk、manB、manC、pgm和pfkB的菌株的大肠杆菌NM522／pNK11／pNT55。
实施例2构建表达大肠杆菌gmd的菌株通过《分子生物学的当前方法》中所述的方法培养大肠杆菌W3110(ATCC27325)，然后分离和纯化该微生物的染色体DNA。
使用通过Perceptive Biosystems公司制造的8905型DNA合成剂合成的DNA，作为引物，其具有SEQ ID NO3和4的核苷酸序列，根据实施例1所述的方法，使用0．1μg大肠杆菌W3110(ATCC27325)的染色体DNA作为模板，进行PCR。
使1／10体积的反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳以确定目的片段的扩增，然后剩余的反应溶液与相同体积的TE-饱和苯酚／氯仿混合。
离心分离上述混合物后，所得的上层与两体积的冷乙醇混合，该混合物于-80℃下静置30分钟。离心分离所得溶液，得到DNA沉淀。
该DNA沉淀溶解在20μl的TE中。用5μl的所得溶液，利用限制酶HindⅢ和XbaⅠ消化DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离所得的DNA片段，然后使用GeneCleanⅡ试剂盒回收1．1kb的DNA片段。
使用通过Perceptive Biosystems公司制造的8905型DNA合成剂合成的DNA制剂，作为引物，其具有SEQ ID NO5和6的核苷酸序列，根据实施例1所述的方法，使用含trp启动子的质粒pNT54(WO98／12343)的DNA作为模板，进行PCR。
使1／10体积的反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳以确定目的片段的扩大，然后剩余的反应溶液与相同体积的TE-饱和苯酚／氯仿混合。
离心分离上述混合物后，所得的上层与两体积的冷乙醇混合，该混合物于-80℃下静置30分钟。离心分离所得溶液，得到DNA沉淀，该DNA沉淀溶解在20μl的TE中。
用5μl的所得溶液，利用限制酶EcoRI和XbaⅠ消化DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离所得的DNA片段，然后用相同的方法回收0．4kb的DNA片段。
利用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ消化0．2μg的pBluescriptⅡ SK+DNA之后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，然后用相同的方法回收3．0kb的DNA片段。
使用连接试剂盒，在16℃下1．1kb、0．4kb和3．0kb的片段进行连接反应16小时。使用连接反应溶液，根据上述已知的方法转化大肠杆菌NM522，所得的转化株涂在含有50μg／ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，随后在30℃下培养披。
根据上述已知的方法从生长的转化株的菌落提取质粒，得到表达质粒pGE19。该质粒的结构由限制酶消化确定(图2)。
实施例3构建表达大肠杆菌wcaG的菌株
使用通过Perceptive Biosystems公司制造的8905型DNA合成剂合成的DNA，作为引物，其具有SEQ ID NO7和8的核苷酸序列，根据实施例1所述的方法，使用大肠杆菌W3110(ATCC27325)的染色体DNA作为模板，进行PCR。
使1／10体积的反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳以确定目的片段的扩增，然后剩余的反应溶液与相同体积的TE-饱和苯酚／氯仿混合。
离心分离上述混合物后，所得的上层与两体积的冷乙醇混合，该混合物于-80℃下静置30分钟。离心分离所得溶液，得到DNA沉淀，该DNA沉淀溶解在20μl的TE中。用5μl的所得溶液，利用限制酶ClaI和XhoI消化DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离所得的DNA片段，然后用Gene CleanⅡ试剂盒回收1．0kb的DNA片段。
利用限制酶ClaⅠ和SalⅠ消化0．2μg的pPAC31 DNA之后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，然后用相同的方法回收5．2kb的DNA片段。
使用连接试剂盒，在16℃下1．0kb和5．2kb的片段进行连接反应16小时。
使用连接反应溶液，根据上述已知的方法转化大肠杆菌NM522，所得的转化株涂在含有50μg／ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，随后在30℃下培养过夜。
根据上述已知的方法从生长的转化株的菌落提取质粒，得到表达质粒pGE8。该质粒的结构由限制酶消化确定(图3)。
实施例4制备GKDM将实施例1得到大肠杆菌NM522／pNK11／pNT55接种到1L隔板式圆锥瓶中，其含有补充了50μg／ml氨苄青霉素和10μg／ml氯霉素的125ml LB培养基，然后在28℃、22rpm下培养17小时。将所得的培养夜(125ml)接种至5L的培养容器中，该容器含有2．5L的液体培养基(pH不调节)，其由10g／l的葡萄糖、12g／l的细菌用胰蛋白胨(由Difco公司制造)、24g／l酵母浸出物(由Difco公司制造)、2．3g／l KH2PO4、12．5g／l K2HPO4和50μg／ml氨苄青霉素组成，随后在30℃、60rpm和2．5L／分钟通风的条件下培养4小时，再于40℃下培养3小时。在培养过程中，使用28％氨水将培养基的pH维持在7．0。此外，如果需要，在培养过程中可以添加葡萄糖。将所得的培养液离心分离得到湿的细胞。由于按照常规的要求湿的细胞能够在-20℃下保存，所以在使用前可以将它们融化后再利用。
将实施例2得到大肠杆菌NM522／pGE19接种到1L隔板式圆锥瓶中，其含有增补了50ìg／ml氨苄青霉素的125ml LB培养基，然后在28℃、220rpm下培养17小时。将所得的培养液(125ml)接种至5L的培养容器中，该容器含有2．5L的液体培养基(pH不调节)，其由10g／l的葡萄糖、12g／l的细菌用胰蛋白胨(由Difco公司制造)、24g／l酵母浸出物(由Difco公司制造)、2．3g／lKH2PO4、12．5g／lK2HPO4和50μg／ml氨苄青霉素组成，随后在37℃、600rpm和2．5L／分钟通风的条件下培养6小时。在培养过程中，使用28％氨水将培养基的pH维持在7．0。此外，如果需要，在培养过程中可以添加葡萄糖。将所得的培养液离心分离得到湿的细胞。由于按照常规的要求湿的细胞能够在-20℃下保存，所以在使用前可以将它们融化后再利用。
将产氨棒杆菌ATCC 21170接种到300ml的隔板式圆锥瓶中，其含有25ml的液体培养基，它由50g／l葡萄糖、10g／l聚蛋白胨(由Nihon制药有限公司制造)、10g／l酵母浸出物(由Oriental Yeast有限公司制造)、5g／l尿素、5g／l(NH4)2SO4、1g／l KH2PO4、3g／l K2HPO4、1g／l MgSO4．7H2O、0．1g／l CaCl2．2H2O、10mg／lFeSO4．7H2O、10mg／l ZnSO4．7H2O、20mg／l MnSO4．4-6H2O、20mg／l L-半胱氨酸、10mg／l D-泛酸钙、5mg／l的维生素B1、5mg／l的烟酸和30μg／l生物素(用10N的NaOH调节pH为7．2)，然后在28℃和220rpm的条件下培养24小时。
将所得的培养液(20ml)接种至2L含有250ml具有上述相同组合物的液体培养基的隔板式圆锥瓶中，然后在28℃和220rpm的条件下培养24小时。所得到的培养液用作种子培养液。
将该种子培养液(250ml)接种到5L的培养容器中，其含有2．25L的液体培养基，它由150g／l葡萄糖、5g／l肉提取物(由Kyokuto制药工业有限公司制造)、10g／l KH2PO4、10g／l K2HPO4、10g／l MgSO4．7H2O、0．1g／l CaCl2．2H2O、20mg／lFeSO4．7H2O、10mg／l ZnSO4．7H2O、20mg／l MnSO4．4-6H2O(分别灭菌)、15mg／l的β-丙氨酸(分别灭菌)、20mg／lL-半光氨酸、100μg／l生物素、2g／l尿素和5mg／l的维生素B1(分别灭菌)(用10N的NaOH调节pH为7．2)，然后在32℃和600rpm及2．5L／分钟通风的条件下培养24小时。在培养过程中，培养基pH用28％的氨水调节至6．8。
将所得的培养液离心分离得到湿的细胞。由于按照常规的要求湿的细胞能够在-20℃下保存，所以在使用前可以将它们融化后再利用。
将反应溶液放入200ml的烧杯中，该反应溶液是25g／l上述大肠杆菌NM522／pNK11／pNT55湿细胞，15g／l上述大肠杆菌NM522／pGE19湿细胞，150g／l上述产氨棒杆菌ATCC 21170湿细胞，60g／l果糖，30g／l甘露糖，20g／l GMP，25g／lKH2PO4、5g／l MgSO4．7H2O、5g／l植酸、4g／l NymeenS-215和10ml／l二甲苯，利用磁搅拌器搅拌该反应溶液(900rpm)，在32℃下反应12小时。在反应过程中，该反应溶液的pH用4N的NaOH维持在7．2，如果需要，可以添加果糖和KH2PO4。
反应结束后，通过HPLC分析反应产物，确定在反应溶液中形成和积聚了18．6g／l(29．4mM)的GKDM(2Na盐)。
实施例5制备GDP-岩藻糖利用实施例4所述的方法培养由实施例1获得的大肠杆菌NM522／pNK11／pNT55，然后离心分离得到湿细胞。
利用实施例4所述的方法培养由实施例2获得的大肠杆菌NM522／pGE19，然后离心分离得到湿细胞。
利用实施例4所述的大肠杆菌NM522／pNK11／pNT55相似的方法培养由实施例3获得的大肠杆菌NM522／pGE8，但是以仅仅添加氨苄青霉素来代替添加氨苄青霉素和氯霉素，然后离心分离得到湿细胞。
利用实施例4所述的方法培养产氨棒杆菌ATCC 21170，然后离心分离得到湿细胞。
由于按照常规的要求湿的细胞能够在-20℃下保存，所以在使用前可以将它们融化后再利用。
将反应溶液(30ml)放入200ml的烧杯中，该反应溶液是25g／l上述大肠杆菌NM522／pNK11／pNT55湿细胞，15g／l上述大肠杆菌NM522／pGE19湿细胞，150g／l上述产氨棒杆菌ATCC 21170湿细胞，60g／l果糖，30g／l甘露糖，30g／l GMP，25g／lKH2PO4、5g／l MgSO4．7H2O、5g／l植酸、4g／l Nymeen S-215和10ml／l二甲苯，利用磁搅拌器搅拌该反应溶液(900rpm)，在32℃下反应12小时。反应12小时之后，添加大肠杆菌NM522／pGE8湿细胞，使浓度为15g／l，反应持续10小时。在反应过程中，该反应溶液的pH用4N的NaOH维持在7．2，如果需要，可以添加果糖和KH2PO4。
反应结束后，通过HPLC分析反应产物，确定在反应溶液中形成和积聚了14．0g／l(29．4mM)的GDP-岩藻糖。
在反应开始时添加大肠杆菌NM522／pGE8(15g／l)湿细胞使反应进行22小时，积聚GDP-岩藻糖(2Na盐)的量是3．7g／l(5．9mM)。
在本发明详细的描述以及相关的特定实施方案的描述同时，对于本技术领域人员来说，各种变化和改进都是显然的，并没有脱离本发明的精神和范围。
序列表<110>KYOWA HAKKO KOGYOCO．，LTD．<120>制备GDP-岩藻糖的方法<140><141><160>S<170>Patentln Ver．2．0<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>1ccgcaagatc tcgtaaaaag ggtatcgata agc33<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>2gagctgactg ggttgaaggc20<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>3gaatctagaa tgtcaaaagt cgctctc 27<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>4ctcaagctta tgactccagc gcgat25<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列的描述合成DNA<400>5caagaattct catgtttgac agct 24<210>6<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>6cattctagac ctccttaatt cgcgaaaatg galcgatacc ctttttac 48<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>27gtcatcgata tgagtaaaca acgagtt 27<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列的描述合成DNA<400>8ataaactcga gagagacaag cggag 2权利要求
1 一种制备鸟苷5’-二磷酸岩藻糖的方法，包括使鸟苷5’-二磷酸4-酮基-6-脱氧甘露糖(GKDM)和一种酶源存在于含水培养基中，其中所述的酶源是能够将GKDM转化为鸟苷5’-二磷酸岩藻糖(GDP-岩藻糖)之微生物的培养液或该培养液的处理产物；在该含水培养基中形成和积聚GDP-岩藻糖；和从上述含水培养基中回收GDP-岩藻糖。
2 一种制备鸟苷5’-二磷酸岩藻糖的方法，包括使鸟苷5’-三磷酸(“GTP”)前体、糖和酶源存在于含水培养基中，其中所述的酶源是能够使GTP前体形成GTP之微生物的培养液或该培养液的处理产物，以及能够使糖和GTP形成鸟苷5’-二磷酸4-酮基-6-脱氧甘露糖(GKDM)之微生物的培养液或该培养液的处理产物；在该含水培养基中形成和积聚GKDM；使用作为酶源的能够将GKDM转化为GDP-岩藻糖之微生物的培养液或该培养液的处理产物，将积聚的GKDM转化为鸟苷5’-二磷糖岩藻糖(GDP-岩藻糖)，在含水培养基中形成和积聚GDP-岩藻糖；和从该含水培养基中回收GDP-岩藻糖。
3 一种制备鸟苷5’-二磷酸4-酮基-6-脱氧甘露糖的方法，包括使鸟苷5’-三磷酸(“GTP”)前体、糖和酶源存在于含水培养基中，其中酶源是能够使GTP前体形成GTP之微生物的培养液或该培养液的处理产物，以及能够使糖和GTP形成鸟苷5’-二磷酸4-酮基-6-脱氧甘露糖(GKDM)之微生物的培养液或该培养液的处理产物；在该含水培养基中形成和积聚GKDM；和从该含水培养基中回收GKDM。
4 根据权利要求1至3中任一权利要求的方法，其中培养液的处理产物选自该培养液的浓缩产物、该培养液的干燥产物、离心离该培养液得到的细胞、该细胞的干燥产物、该细胞的冷冻干燥产物、该细胞的表面活性剂处理的产物、该细胞的超声波处理的产物、该细胞的机械研磨处理的产物、该细胞的溶剂处理的产物、该细胞的酶处理的产物、该细胞的蛋白质部分、该细胞的固定化产物、由该细胞提取得到的酶制剂。
5 根据要求2或3的方法，其中GTP前体选自鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、黄苷、肌苷、鸟苷5’-一磷酸、黄苷5’-一磷酸和肌苷5’-一磷酸。
6 根据权利要求2或3的方法，其中所述的糖选自葡萄糖、果糖和甘露糖。
7 根据权利要求2或3的方法，其中能够使GTP前体形成GTP的微生物选自棒状杆菌属。
8 根据权利要求7的方法，其中微生物是产氨棒杆菌。
9 根据权利要求2或3的方法，其中能够使糖和GTP形成GKDM的微生物是至少一种微生物。
10 根据权利要求9的方法，其中至少一种微生物选自属于埃希氏杆菌属和棒状杆菌属的微生物的至少一种。
11 根据权利要求10的方法，其中属于埃希氏杆菌属的微生物是大肠杆菌。
12 根据权利要求10的方法，其中属于棒状杆菌属的微生物是产氨棒杆菌。
13 根据权利要求2或3的方法，其中能够使糖和GTP形成GKDM的微生物是酶活性强的微生物，至少一种酶选自葡糖激酶(“glk”)、磷酸甘露糖变位酶(“manB”)、甘露糖1-磷酸鸟苷酰基转移酶(“manC”)、磷酸葡萄糖变位酶(“pgm”)、磷酸果糖激酶(“pfk”)和GDP-甘露糖4，6-脱水酶(“gmd”)。
14 根据权利要求13的方法，其中微生物是具有重组DNA的至少一种微生物，该重组DNA包括一个载体和DNA片段，DNA片段含有至少一种选自以下的基因glk-编码基因、manB-编码基因、manC-编码基因、pgm-编码基因、pfk-编码基因和gmd-编码基因。
15 根据权利要求14的方法，其中glk-编码基因、manB-编码基因、manC-编码基因、pgm-编码基因、pfk-编码基因或gmd编码基因是来自大肠杆菌的基因。
16 根据权利要求1或2的方法，其中能够将GKDM转化为GDP-岩藻糖的微生物是具有强GKDM差向异构酶/还原酶(“wacG”)活性的微生物。
17 根据权利要求16的方法，其中微生物是具有包括一个载体和含有wacG-编码基因的DNA片段的重组DNA的微生物。
18 根据权利要求17的方法，其中wacG-编码基因来自大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及制备GDP－岩藻糖的方法,包括使GKDM和能够将GKDM转化为GDP－岩藻糖之微生物的培养液存在于含水介质中形成和积聚GDP－岩藻糖;和从上述含水介质中回收GDP－岩藻糖;或包括使GTP前体、糖、能够使GTP前体形成GTP之微生物的培养液,以及能够使糖和GTP形成GKDM之微生物的培养液存在于含水介质中形成和积聚GKDM,使用能够将GKDM转化为GDP－岩藻糖之微生物的培养液将积聚的GKDM转化为GDP－岩藻糖,在该含水介质中形成积聚的GDP－岩藻糖,从上述含水介质中回收GDP－岩藻糖。
文档编号C12P19/00GK1292422SQ0012869
公开日2001年4月25日 申请日期2000年8月10日 优先权日1999年8月10日
发明者小泉聪司, 长野宏, 远藤彻夫, 田畑和彦, 尾崎明夫 申请人:协和发酵工业株式会社