专利名称：盐芥的一个耐盐基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物中与抗胁迫相关的基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及盐芥中的一个耐盐基因及其编码蛋白与其在培育耐盐性提高植物中的应用。
背景技术：
研究表明，拟南芥的一些近亲具有极强的耐逆性，并且较适宜进行遗传操作。其中，盐生植物—盐芥与拟南芥极为相似，基因序列同源性可达70-90％，不仅具有遗传学模式植物令人满意的形态、生长特性及遗传特点，还对海水的高盐浓度具有较强的耐受能力。因此，盐芥不但是一种可供研究植物自然耐盐机制的优异遗传模式植物，更是一种分离优异耐盐相关基因的资源植物。
发明内容
本发明的目的是提供一个盐芥的耐盐基因及其编码蛋白。
本发明所提供的耐盐基因，名称为ST120，来源于十字花科植物盐芥(Thellungiella halophila)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由633个碱基组成，其编码序列为自5’端第32-355位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
本发明耐盐基因所编码的蛋白(ST120)，也属于本发明的保护范围。它是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐盐性作用的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №2由107个氨基酸残基组成。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增ST120中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
利用植物表达载体，将本发明的耐盐基因导入植物细胞或组织，可获得对高盐耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其他的可参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆储存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用ST120构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明ST120的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜等双子叶植物、将本发明所提供的耐盐基因ST120与拟南芥基因组基因进行序列比对，结果该基因与拟南芥基因组中一个编码Proline-rich蛋白的基因(GenBank登录号At5g59170)具有较高的相似性(50％)，通过对转化本基因后所得到的转基因拟南芥进行逆境胁迫试验，证明该基因转入植物后可显著提高转化植株的耐盐性。本发明为人为控制植物中抗逆和耐逆相关基因的表达奠定了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是水稻、小麦、油菜等农作物)中发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为载体pCB2004的物理图谱图2A为转化体(120)和野生型拟南芥(WT)在含0mM NaCl的MS基本培养基上萌发12天后的生长情况图2B为转化体(120)和野生型拟南芥(WT)在含150mM NaCl的MS基本培养基上萌发12天后的生长情况图2C为在含不同浓度(0mM、150mM)NaCl的MS基本培养基上萌发12天后转化体(120)和野生型拟南芥(WT)的存活率统计结果图3为在土壤中生长两周的ST120转化体(120)和野生型拟南芥经不同浓度(0mM、200mM、250mM)NaCl胁迫处理8天后的生长情况图4为在土壤中生长两周的ST120转化体(120)和野生型拟南芥(WT)，经不同浓度(200mM、250mM)NaCl胁迫处理8天与15天后的莲苔直径比较结果图5为在土壤中生长两周的ST120转化体(120)和野生型拟南芥(WT)，经不同浓度(200mM、250mM)NaCl胁迫处理15天后产生的果荚数比较结果图6为在土壤中生长两周的ST120转化体(120)和野生型拟南芥(WT)，经不同浓度(200mM、250mM)NaCl胁迫处理15天后的死亡率比较结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、盐芥耐盐基因ST120的获得一、盐芥cDNA文库的构建提取盐芥总RNA，反转录得到盐芥全基因组的cDNA，采用高通量构建载体的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统DNA重组技术的新进展。中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)将盐芥cDNA先重组克隆到pDONR207载体(Invitrogen公司)中，得到Entry cDNA文库，然后再用重组克隆的方法将整个cDNA文库穿梭至含有35S启动子的植物过量表达双元载体pCB2004(物理图谱如图1所示)中，得到盐芥cDNA文库。上述重组反应完全按照Invitrogen公司提供的实验指南进行。
二、用盐芥cDNA文库转化野生型拟南芥将步骤一构建的盐芥cDNA文库穿梭到双元载体pCB2004中，再电转化至农杆菌C58，筛选阳性重组子，采用拟南芥花絮浸花转化的方法(floral dip method)(StevenJ，Clough and Andrew F.BentFloral dipa simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The PlantJournalVolume 16 Issue 6 Page 735-December 1998)将阳性重组子大规模转化拟南芥。
三、拟南芥耐盐转化体的筛选1、拟南芥转化体库的创建在土壤中大规模播种步骤二获得的转化有盐芥cDNA文库的拟南芥转化体的种子，在种子发芽后约5天，表面喷洒浓度为0.2％的除草剂(glufosinate ammonium，商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)进行筛选，以野生型拟南芥为对照。约1周后可以观察到转化体植株和野生型植株具有明显差别，野生型植株在0.2％除草剂glufosinate条件下不能存活，而转化体植物不受影响，可以正常生长。以200株转化体植株为一单位进行收种。
2、高通量方法初筛耐盐转化体植株下述各实验中所用的种子均用如下方法进行表面灭菌处理用50％消毒液(广州蓝月亮有限公司)在室温下灭菌15分钟，再用经灭菌的纯净水冲洗4-5遍。
将经消毒的步骤1收获的种子在4℃下放置3天，以使种子发芽一致。然后将种子播种于MS基本培养基(含2％蔗糖，1.5％琼脂粉，pH值5.8，高温蒸汽灭菌15分钟)上使其发芽，种子发芽生长条件为22℃，光照培养。发芽后，再将其播种于含有220mM NaCl和25mg/L除草剂glufosinate的MS基本培养基上高通量筛选耐盐转化体，每个15cm的培养皿播3000粒种子。待植株生长10天后，将存活下来的转化体植株(既抗除草剂又耐盐)移栽到土中，并单株收种。
3、耐盐转化体的复筛对每一可能的耐盐转化体，选取其大约25至30粒种子用上述步骤2的方法进行表面灭菌后，播种于不同浓度的含盐MS基本培养基上，盐浓度在0-220mM NaCl之间。种子生长约一周后进行观察并记录相应数据，观察10天后，统计存活的植株数量，检查存活植株数量和死亡植株数量之间比例，将存活植株移入含有25mg/L除草剂glufosinate的MS基本培养基上，1周后观察小苗存活情况。如果小苗全部存活，表明上述耐盐株系的耐盐性状和抗除草剂基因可能连锁，符合筛选要求。最后，移栽以上耐盐株系到土壤中，单株收种，将种子保存备用。
四、耐盐基因ST120的获得根据盐芥cDNA在载体pCB2004中插入位点的上、下游序列设计引物扩增cDNA序列，引物序列如下Omega(上游引物)5’-TTTTTACAACAATTACCAACAACAACAA-3’attB2(下游引物)5’-TACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTTT-3’提取步骤三筛选得到的耐盐转化体的基因组DNA，并以此为模板，在引物Omega和attB2的引导下进行PCR扩增，50uL PCR扩增体系为0.25uL ExTaq聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)，2uL基因组DNA，10×PCR缓冲液5uL，dNTPs 100uM，上、下游引物各25uM，再用双蒸水将反应体系补充至50uL。用PCR技术扩增转入的盐芥cDNA。PCR反应条件为95℃ 1min，66℃ 1min，72℃ 2min，共40个循环。反应结束后，以Omega作为测序引物对PCR产物进行测序，测序结果表明该基因具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由633个碱基组成，其编码序列为自5’端第32-355位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。将该耐盐基因命名为ST120，该基因所编码的蛋白命名为ST120。
实施例2、转ST120基因的拟南芥在培养基上的耐盐实验用实施例1的方法构建ST120的过量表达载体，将ST120克隆入含有35S启动子的过量表达双元载体pCB2004中，得到ST120的过量表达载体，命名为pCB2004/ST120。经测序鉴定正确后，将pCB2004/ST120用电转化法转化农杆菌C58，筛选阳性重组子，再用拟南芥花絮浸花转化的方法(floral dip method)转化野生型拟南芥植株。然后对转基因植株进行耐盐实验，方法为将转基因种子分别播种于含0mM、120mM、150mM、180mM NaCl的MS固体培养基上，以野生型拟南芥为对照，在常规条件下培养，观察并记录发芽及生长情况。结果在不含NaCl的普通MS培养基上，萌发12天后，转化体(120)生长状况与野生型(WT)基本一致(如图2A所示，黑线上方为野生型(WT)，下方为转化体(120))；在150mM NaCl胁迫条件下，萌发12天后，野生型生长明显受到抑制，而转化体的生长状况显著优于野生型(如图2B所示，黑线上方为野生型(WT)，下方为转化体(120))，表明耐盐性增强。在0mM、150mM NaCl的MS基本培养基上萌发12天后转化体(120)和野生型(WT)的存活率统计结果如图2C所示(*表示差异及显著，P＜0.05，n＝112)，在含150mM NaCl的MS固体培养基上生长12天的转化体(120))的存活率高于野生型(WT)。
实施例3、转ST120基因的拟南芥在土壤中的耐盐实验将实施例2中获得的STT120转基因植株(120)和野生型拟南芥(WT)的种子播种于MS基本培养基中，在相同条件下培养，待子叶打开后，将两种拟南芥植株移至土壤中继续生长，生长两周左右(约10片叶)，各分三组，分别浇灌含OmM NaCl(对照)、200mMNaCl、250mM NaCl的水溶液，观察并记录其生长情况。经上述不同浓度盐胁迫处理8天后的植株生长情况如图3所示(隔线上方为野生型(WT)，下方为转化体(120))，在正常生长条件下(0mM NaCl)，转化体(120)生长状况与野生型(WT)基本一致；在盐胁迫条件下，转化体(120)明显比野生型植株生长快。经上述盐胁迫处理8天和15天后测定转化体(120)和野生型(WT)的莲苔直径，结果如图4所示(*表示差异达显著，P＜0.05，n＝28)，与转化体(120)相比，野生型(WT)植株的生长明显受到抑制。经上述盐胁迫处理15天后统计转化体(120)和野生型(WT)植株产生的果荚数，结果如图5所示(*表示差异达显著，p＜0.05，n＝24)，表明盐胁迫对果荚的产量也有较显著的影响，野生型植株产生的果荚数明显少于ST120转化体(120)。经上述盐胁迫处理15天后统计转化体(120)和野生型(WT)植株的死亡率，结果如图6所示(*表示差异达显著，p＜0.05，n＝55)，表明在盐胁迫条件下，ST120转化体(120)的死亡率明显低于野生型拟南芥植株。
序列表<160>2<210>1<211>633<212>DNA<213>十字花科盐芥(Thellungiella halophila)<400>1gggaaaacta agagggaata tacaaattaa gatgaaatct tccgtagtct cttccatgct 60tgtcgttctt cttcttcttc tcgtgtttcc acatggcgaa caaagggagc tccagaaact 120tagtggagta gagacttacc atcctggtca agtgacggtc caagcaaggg gcattccggg 180aatccatatt cctgaaccaa aacctaatat tcatattcct cctaattttc agtttcctcc 240tcgtcgtcca acattgccgc ctggtactaa gtgcccgaac gggaaaaaat acgtggcatt 300ctgtaagaag tataaaatcc catttgcatc ccctccaccc ccaaggtttc tttgaggcaa 360atatcgacca ccctggccat tgacctccct ttaagcttcg aatgcgtcta tatatatatg 420tgtgtgtcca cttttcttac gttgtactgg tttggcttct gtgcttcttt tcattaccga 480atatgcagat tgggtgtttg tcatacattg tgttattgtc aatttgggtt tgtttctatt 540ttctgccgcc agtttaataa ttatgtttaa taagcggccg ctaatatata taaaatattg 600ttatatcaaa taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 633<210>2<211>107<212>PRT<213>十字花科盐芥(Thellungiella halophila)<400>2Met Lys Ser Ser Val Val Ser Ser Met Leu Val Val Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Val Phe Pro His Gly Glu Gln Arg Glu Leu Gln Lys Leu Ser Gly20 25 30
Val Glu Thr Tyr His Pro Gly Gln Val Thr Val Gln Ala Arg Gly Ile35 40 45Pro Gly Ile His Ile Pro Glu Pro Lys Pro Asn Ile His Ile Pro Pro50 55 60Asn Phe Gln Phe Pro Pro Arg Arg Pro Thr Leu Pro Pro Gly Thr Lys65 70 75 80Cys Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Val Ala Phe Cys Lys Lys Tyr Lys Ile85 90 95Pro Phe Ala Ser Pro Pro Pro Pro Arg Phe Leu100 10权利要求
1.盐芥的一个耐盐基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的耐盐基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID№1的DNA序列。
3.权利要求1所述耐盐基因的编码蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐盐性作用的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列。
5.含有权利要求1所述耐盐基因的表达载体。
6.含有权利要求1所述耐盐基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求1所述耐盐基因的宿主菌。
8.一种培育耐盐植物的方法，是利用植物表达载体将权利要求1所述的耐盐基因导入植物细胞或组织，获得对高盐耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述被转化的植物宿主为水稻、小麦、大豆、油菜或拟南芥。
全文摘要
本发明公开了盐芥的一个耐盐基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供盐芥的一个耐盐基因及其编码蛋白与其在培育耐盐性提高植物中的应用。该基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。编码具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐盐性作用的蛋白质。本发明的耐盐基因将在培育耐盐性增强的植物(特别是水稻、小麦等农作物)中发挥重要作用。
文档编号C12N15/63GK1793364SQ200510115928
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月11日 优先权日2005年11月11日
发明者陈曦, 向成斌 申请人:中国科学技术大学