专利名称：一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法。
背景技术：
干细胞(Stem cell)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，根据其发育阶段不同，分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞广泛存在于骨髓、神经、肌肉、表皮、肠、肝等组织或器官。传统观点认为成体干细胞只可向其定居的组织类型分化，而不能分化成其它组织类型的细胞。但近年来研究表明，成体干细胞在一定条件下可分化为与其所在组织不同的其它类型的细胞，成体干细胞的这种可塑性，称为跨越分化。这一潜能的发现，大大拓宽了其在临床医学治疗上的应用前景，如鉴于成体干细胞的跨越分化潜能，利用定向诱导分化技术，可以将来源于不同组织的成体干细胞分化成所需组织的细胞，如利用造血干细胞，不仅能重建患者的造血及免疫功能，还能在患者体内分化成各种成熟的非造血组织细胞，如心肌细胞、肝细胞、上皮细胞、骨骼肌细胞等，这些细胞可以有机地整合到相应的组织和器官中，修复或替换患者丧失功能或受损的组织和器官。
慢性肝炎、肝硬化、门静脉高压病、原发性肝癌、遗传性及代谢性肝脏疾病等诸多难治性肝病已成为全世界共同面临的棘手问题，我国每年因肝病死亡的患者约50万人。当前，对于肝功能衰竭(如肝坏死、肝硬化等)和肝脏相关的遗传性疾病的治疗主要依赖于原位肝移植，但供体肝来源严重不足和移植排斥等问题限制了这一治疗手段的广泛开展。肝细胞移植和生物人工肝作为肝移植的辅助方式，可以部分缓解上述问题，但其来源细胞同样也面临着存活期短，特别是随着培养时间的延长，肝功能逐渐降低等问题，因此，寻找合适的肝细胞来源已成为一个十分紧迫的课题。而利用成体干细胞跨越分化为肝细胞无疑是解决这一问题的一个有效途径，因此这方面的研究也成为当前干细胞以及肝病细胞治疗的研究热点之一。
先前，成体干细胞跨越分化为肝细胞的研究主要集中在肝源性干细胞(如卵圆细胞、成肝细胞)和骨髓源干细胞。而最近研究表明，一直被丢弃的脐带血造血干细胞能在体内分化为肝细胞。将人脐带血单个核细胞注入NOD/SCID小鼠中，利用荧光原位杂交技术，分析小鼠肝内的人源细胞DNA，发现脐带血细胞能整合入小鼠肝中并分化为成熟肝细胞。同样，将转有GFP质粒的人脐血CD34+Lin-细胞植入发育至45～55天的胎羊中，结果在胎羊肝脏中检测到了表达人肝细胞特征抗原、白蛋白、肝细胞核因子及GFP的细胞，DNA定量分析发现，这些细胞没有与胎羊肝细胞发生融合。此外，将人脐带血中分离的CD34+CD38-CD7-造血干细胞移植入免疫缺陷小鼠肝损伤模型，在移植的一个月后用CCl4诱导肝损伤，结果在移植了脐带血造血干细胞的小鼠肝中检测到人特异的白蛋白mRNA，并在小鼠血清中检测到人白蛋白，而在未移植的损伤小鼠或者移植了造血干细胞的未损伤小鼠中均未检测到人白蛋白的表达。另外，一些体外实验也证明脐带血来源的干细胞能在特定细胞因子的组合诱导下分化为肝细胞，目前已报道的细胞因子组合包括FGF-1、FGF-2、SCF、LIF、HGF和OSM等，在这些因子的诱导下，脐带血干细胞在21天后开始表达CK19、白蛋白和CK18等肝细胞特异性标志。最近，有人采用HGF、Dex、ITS和OSM组合，成功诱导了人脐带血间充质干细胞体外分化为肝细胞。但目前的诱导体系普遍采用了5～7种细胞因子，方法较为复杂。本发明则建立了一种三因子诱导体系，大大简化了实验体系，为今后利用脐带血干细胞跨越分化肝细胞，实现肝细胞种子细胞来源及相关临床应用，打下了基础。
发明内容
本发明提供了一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法。通过对肝脏分化发育过程的分析研究，经过不同的组合比较实验，得到一种比已有报道更为优化、简单方便的方法。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下方法来实现的(1)以人脐带血为原料，分离单个核细胞和CD34+细胞；(2)利用三种细胞因子组合诱导培养细胞；(3)分化细胞的鉴定。
所述的步骤(1)主要通过将脐带血(原料)稀释，得到稀释液后用密度梯度离心技术，制备单个核细胞，单个核细胞进一步通过免疫磁珠分离得到CD34+细胞。
所述的脐带血(原料)稀释度为脐带血∶PBS＝1∶2。
所述的步骤(2)中三种细胞因子为肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)和抑瘤素(OSM)。
所述的三种细胞因子的加入量肝细胞生长因子为20ng/ml、成纤维细胞生长因子4为10ng/ml和抑瘤素为10ng/ml。
所述的步骤(3)中分化细胞的鉴定包括形态学观察、高碘酸-希夫反应检测细胞糖原合成、苏木素细胞核染色。
所述的步骤(3)中分化细胞的鉴定包括形态学观察、肝细胞特异性基因表达分析、肝细胞特异蛋白免疫荧光检测、高碘酸-希夫反应(PAS)检测细胞糖原合成、苏木素细胞核染色。
由于采用了以上成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法，本发明的优点是1、构成简单，只需要三种细胞因子20ng/ml HGF、10ng/mlFGF-4和10ng/ml OSM的IMDM培养液诱导脐带血单个核细胞和CD34+细胞，通过体外诱导脐带血干细胞向肝细胞分化，得到有糖原合成能力，显示双核的多边形肝细胞样细胞；2、效果明确，形态学观察、高碘酸-希夫反应(PAS)检测细胞糖原合成和苏木素细胞核染色鉴定分化细胞，都表明本发明的体系能够诱导脐带血单个核细胞和CD34+细胞跨越分化为肝细胞，分化率达到了60％-70％；3、实用有效，经诱导分化的肝细胞有合成糖元等功能性，有应用于肝病细胞治疗的潜在价值。该诱导体系能够达到理想的体外诱导效果，并且构成简单、实用，是肝细胞跨越分化研究和应用的新方法，为人类脐带血干细胞跨越分化肝细胞的研究提供重要证据和实用方法。
具体实施例方式
实施例1三种细胞因子组合诱导脐带血单个核细胞分化为肝细胞的方法为将采集的脐带血用PBS以1∶2稀释，以5∶3的比例将脐带血稀释液小心加到1.077g/ml的Ficoll上，2200rpm，离心25分钟，收集中间白膜层细胞，1500rpm，离心10分钟，弃上清，得到脐带血单个核细胞。用含有10％NBS的IMDM培养液悬浮，置细胞瓶中，37℃，5％CO2培养箱中培养。
调整细胞密度，按2×105/cm2密度接种一次性塑料细胞瓶或孔板，在含10％NBS的IMDM培养液中添加20ng/ml HGF、10ng/ml FGF-4和10ng/ml OSM。72hours后首次换液，弃去没有贴壁的细胞，每周两次换液，共培养21天。
诱导分化细胞鉴定1.形态学观察细胞分化过程中，每天在相差显微镜下观察细胞形态的变化。
2.高碘酸-希夫反应(PAS)检测细胞糖原合成倒去培养液后，用PBS洗两次，用95％酒精固定细胞10min，蒸馏水冲洗1min，再用1％过碘酸水溶液作用15min，蒸馏水冲洗1min后，加入Schiff试剂作用30min，中间每隔数分钟进行摇晃，亚硫酸水洗3遍，再用蒸馏水冲洗1min，相差显微镜下镜检。统计PAS糖原合成反应阳性细胞。
由上述两种方法检测后可分析得到细胞呈阳性，即已具备肝细胞功能的物质，但肝细胞分化率仅为62％。
3.苏木素细胞核染色倒去培养液，用PBS冲洗两次，95％酒精固定细胞10min，苏木素染色10分钟，自来水洗，稀盐酸酒精分色数秒钟，自来水浸洗1min，淡氨水中浸洗5min，使细胞核蓝化。相差显微镜下镜检得细胞显示双核。
实施例2三种细胞因子组合诱导脐带血CD34+细胞分化为肝细胞的方法为参考实施例1的方法获得脐血单个核细胞，用600μl PBS悬浮，加入封闭液200μl，混匀，然后加入200μl带有CD34+抗体的磁珠，混匀，6-12℃孵育30min，加入1ml PBS，1100rpm离心10min，完全去除上清，500μl PBS悬浮细胞，安装好免疫磁珠分离系统(MACs)，用500μl PBS洗分离柱一次，加细胞悬液过柱，PBS洗三次，每次500μl，将分离柱移出磁场，加1ml PBS将细胞迅速吹出，离心收集CD34+细胞。用含有10％NBS的IMDM培养液悬浮，置细胞瓶中，37℃，5％CO2培养箱中培养。
调整细胞密度，按2×105/cm2密度接种一次性塑料细胞瓶或孔板，在含10％NBS的IMDM培养液中添加20ng/ml HGF、10ng/ml FGF-4和10ng/ml OSM。72hours后首次换液，弃去没有贴壁的细胞，每周两次换液，共培养21天。
诱导分化细胞鉴定1.形态学观察细胞分化过程中，每天在相差显微镜下观察细胞形态的变化。
2.高碘酸-希夫反应(PAS)检测细胞糖原合成倒去培养液后，用PBS洗两次，用95％酒精固定细胞10min，蒸馏水冲洗1min，再用1％过碘酸水溶液作用15min，蒸馏水冲洗1min后，加入Schiff试剂作用30min，中间每隔数分钟进行摇晃，亚硫酸水洗3遍，再用蒸馏水冲洗1min，相差显微镜下镜检、拍照。统计PAS糖原合成反应阳性细胞。
由上述两种方法检测后可分析得到细胞呈阳性，即已具备肝细胞功能的物质，且肝细胞分化率为70％。
3.苏木素细胞核染色倒去培养液，用PBS冲洗两次，95％酒精固定细胞10min，苏木素染色10分钟，自来水洗，稀盐酸酒精分色数秒钟，自来水浸洗1min，淡氨水中浸洗5min，使细胞核蓝化。相差显微镜下镜检得细胞显示双核。
肝细胞特异基因表达的RT-PCR检测用Trizol试剂盒抽提总RNA，取总RNA 1μg，逆转录试剂盒转录cDNA；再分别扩增β-actin、AFP、CK19、CK18、ALB、TAT。10μlPCR反应体系中Taq buffer(10×，含Mg2+)lμl、dNTP0.2μl、Taq酶0.2μl、引物各0.4μl、cDNA模板0.2μl、无菌蒸馏水7.6μl。PCR扩增条件94℃预变性5min后；94℃变性30s、退火30s、72℃延伸30s，共30个循环；再72℃延伸l0min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，可得出结论为培育21天后以具备肝细胞的功能，即人类脐带血干细胞已跨越分化为肝细胞。
肝细胞特异蛋白的免疫荧光法检测倒去培养液，用PBS洗3次，每次5min，4％多聚甲醛(PH 7.2)室温固定15min，用枪吸干多聚甲醛后加入甲醇(-20℃预冷)，在-20℃作用20min，倒去甲醇，自然风干，加入5％正常山羊血清封闭(PBS稀释)，室温处理20min，PBS洗一次，分别加入AFP、CK19、CK18或ALB的单克隆抗体作为一抗(均按1∶100稀释在含1.5％正常封闭血清的PBS中)，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5min，再加入对应的FITC和TRITC标记的二抗(均按1∶100稀释在含1.5％正常封闭血清的PBS中)，37℃孵育45min，PBS洗涤3次，每次5min，，加入DAPI工作液，室温孵育10min，PBS反复洗涤后，在激光共聚焦扫描显微镜下观察肝细胞分化情况。
通过以上实施例表明本发明的体系能够诱导脐带血单个核细胞和CD34+细胞跨越分化为肝细胞，且分化率达到60％-70％；该诱导体系能够达到理想的体外诱导效果，并且构成简单、实用。
权利要求
1.一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法，其特征在于包括如下步骤(1)以人脐带血为原料，分离单个核细胞和CD34+细胞；(2)利用三种细胞因子组合诱导培养细胞；(3)分化细胞的鉴定。
2.如权利要求1所述的一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤(1)主要通过将原料稀释得到稀释液后制备单个核细胞，单个核细胞通过免疫磁珠分离得CD34+细胞。
3.如权利要求2所述的一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法，其特征在于所述的原料的稀释度为脐带血∶PBS＝1∶2。
4.如权利要求1所述的一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤(2)中三种细胞因子为肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4和抑瘤素。
5.如权利要求4所述的一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法，其特征在于所述的三种细胞因子的加入量肝细胞生长因子为20ng/ml、成纤维细胞生长因子4为10ng/ml和抑瘤素为10ng/ml。
6.如权利要求1所述的一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤(3)中分化细胞的鉴定包括形态学观察、高碘酸-希夫反应检测细胞糖原合成、苏木素细胞核染色。
7.如权利要求1所述的一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤(3)中分化细胞的鉴定包括形态学观察、肝细胞特异性基因表达分析、肝细胞特异蛋白免疫荧光检测、高碘酸-希夫反应检测细胞糖原合成、苏木素细胞核染色。
全文摘要
本发明公开了一种新的成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法，以人脐带血为原料，制备单个核细胞和CD34+细胞，通过采用肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子4(FGF－4)和抑瘤素(OSM)三种细胞因子组合，体外诱导脐带血干细胞向肝细胞分化，得到有糖原合成能力，显示双核的多边形肝细胞样细胞。该诱导体系能够达到理想的体外诱导效果，并且构成简单、实用，是肝细胞跨越分化研究和应用的新方法，为人类脐带血干细胞跨越分化肝细胞的研究提供重要证据和实用方法。
文档编号C12Q1/04GK101033463SQ20061015535
公开日2007年9月12日 申请日期2006年12月21日 优先权日2006年12月21日
发明者董学君, 陈烨, 张国荣, 邵健忠, 项黎新 申请人:浙江省绍兴市人民医院, 浙江大学