专利名称：适用于淡豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及微生物发酵菌株的确定，特别是适用于淡豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株。
背景技术：
淡豆豉是我国特产的以大豆为原料的发酵类中药，根据我国历代医书，其主要功能为解表、除烦、宣发郁热，用于感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠。现代研究表明，其还具有降血糖、调节血脂、抗氧化、体外抗肝癌细胞的作用。目前，由于淡豆豉的生产还是靠自然发酵，因而存在多种问题1、来自于原料、器具及自然环境中的多种微生物会相互竞争生长，那些最适合于食品底物和生产条件的微生物会快速生长并渐渐成为优势菌种，因此发酵中的优势菌种往往会因生产条件的差异存在可变性，从而导致发酵产品的营养和功能品质的不一致性；2、更糟的是，该优势菌种可能并不适合发酵生产淡豆豉，造成发酵的失败，使得发酵生产的稳定性差。3、有些污染菌可能还是病原菌，如黄曲霉的某些菌株会产生引起人、畜肝脏致癌的黄曲霉毒素，给食品安全带来影响。因此，有必要找到适合淡豆豉生产的发酵菌株，采用纯种发酵来改变当前这种不利的局面，对发酵进行科学化管理，提高其竞争力，发扬我国传统中药。
本发明的目的就是提供一种适用于淡豆豉纯种发酵的菌株，以改变现有淡豆豉生产技术存在的上述问题。
发明内容
本发明提供了一种适于淡豆豉生产的枯草芽孢杆菌菌株，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.1863。菌株命名为DANDC1，菌株的16srDNA部分序列如本发明的序列表所示SEQID DANDC1。
本发明提供的适于淡豆豉生产的枯草芽孢杆菌菌株来源于下述方法以淡豆豉为原料，采用常规梯度稀释法，接种于KMB培养基37℃培养24小时，挑选出菌落形态不同的数量占优的两种菌株进行划线分离纯化，得到纯培养物，分别命名为DANDC1、DANDC2。经革兰氏染色、芽孢染色、接触酶实验检验都为阳性，证实其符合芽孢杆菌属的特征。再通过提取细菌总DNA，根据芽孢杆菌16srDNA的保守序列设计引物，利用PCR反应扩增得到各菌株的16srDNA，经纯化后用自动核酸测序仪测定16srDNA序列的组成，将测序结果与genebank中的序列进行比对，鉴定其为枯草芽孢杆菌。用这两种菌株进行了淡豆豉的试制研究，结果表明产品表面黑色、皱缩不平，断面棕黑色，质柔软，气香，味微甘。经1％吲哚醌∶醋酸(10∶1)的混合溶液检验显紫红色，1％硫酸铜溶液与40％氢氧化钾溶液检验无紫红色出现。以上特征都符合《中国药典》对淡豆豉的要求。
菌种保藏方法如下用LB培养基(胰蛋白胨5g、酵母粉2.5g、氯化钠5g、500ml蒸馏水、pH值7.5左右)37℃150rpm培养过夜，添加无菌甘油并使其终浓度为20％左右，放于-70℃保藏。
菌种保藏菌种分类命名枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；保藏日期2006年11月10日；保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；保藏编号NO.1863。
具体实施例方式
本发明为验证以上枯草芽孢杆菌DANDC1用于淡豆豉工艺的生产效果，用其作为制曲菌种，以大豆为主料，桑叶、青蒿为辅料来生产淡豆豉，具体工艺路线如下(1)大豆的浸泡和蒸煮取桑叶、青蒿各100克加水2500克煎煮，过滤，煎液拌入1000克洗净的大豆中，待吸尽后，0.1MPa高压蒸煮40分钟。
(2)种子液的制备采用KMB液体培养基，无菌条件下接入枯草芽孢杆菌DANDC1菌种，摇床150rpm培养18小时后根据营养琼脂平板菌落计数，用无菌生理盐水将其稀释成含活菌数107个/毫升的种子液。
(3)接种制曲和后酵按蒸煮大豆∶种子液＝100∶1(w/v)的量接种后，在37℃放置48小时，洗曲，再于密闭容器中45℃放置7天，取出干燥。
本产品表面黑色、皱缩不平，断面棕黑色，质柔软，气香，味微甘。经1％吲哚醌∶醋酸(10∶1)的混合溶液检验显紫红色，1％硫酸铜溶液与40％氢氧化钾溶液检验无紫红色出现。本发明的有益效果是(1)为淡豆豉生产的制曲工艺提供了纯种菌，有利于提高发酵生产的稳定性，保证发酵产品的营养和功能品质的一致性。
(2)减少了发酵过程中病原微生物的侵入，有利于提高发酵产品的卫生和安全。
本发明所述枯草芽孢杆菌菌株DANDC1的16srDNA部分序列如以下序列表所示序列表SEQID DANDC1gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 60ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcaaac 120ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 180aggtaacggc tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 240gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 300acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct 360gttgttaggg aagaacaagt accgttcgaa tagggcggta ccttgacggt acctaaccag 420aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 480ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg 540gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 600ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 660ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 720ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg 780ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 840ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 900gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg 960gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1020cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1080actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1140cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag 1200ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1260ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1320caccgcccgt gcaca 133权利要求
1.适用于淡豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.1863，菌株的16srDNA序列组成如SEQIDDANDC1所述。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及微生物发酵菌株。提供了一种适于淡豆豉生产的枯草芽孢杆菌菌株。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.1863，菌株命名为DANDC1，菌株的16srDNA部分序列如本发明的序列表所示SEQIDDANDC1。本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株来源于以淡豆豉为原料的筛选。采用本发明的菌株可提高淡豆豉发酵生产的稳定性和发酵产品的安全性，确保发酵产品的营养和功能品质的一致和减少病原微生物的侵入。
文档编号C12N15/31GK1986775SQ200610155430
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者李铎, 冯凤琴, 沈立荣, 李华 申请人:浙江大学