专利名称：适用于细菌型豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及用基因序列确定一种细菌菌株，具体为在发酵工业中使用的菌株，即适用于细菌型豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株。
背景技术：
豆豉是一种发酵豆制品，在中国已经有两千多年的历史，作为别有特色的调味品，深受人们的喜爱。按照制曲中起主要作用的微生物的类别，豆豉可以分为两大类细菌型豆豉和霉菌型豆豉。目前，豆豉的生产是靠自然发酵，由于自然界微生物的多样性和不稳定性，造成产品的感官和营养品质的不稳定以及卫生安全隐患，而且生产周期长也造成了生产效率低下，因此有必要找到适合于豆豉生产的菌株，采用纯种发酵的方法来解决上述问题，促进豆豉工业的发展。在CN1096324中，公开了一种生产豆豉的毛霉菌株，但未见有适于豆豉生产的细菌菌株的报道。
本发明的目的就是提供适用于细菌型豆豉纯种发酵的菌株，用纯种发酵的菌株解决产品的感官和营养品质的不稳定以及卫生安全隐患，以及生产周期长，生产效率低下的问题。
发明内容
本发明提供了一种适于豆豉生产的枯草芽孢杆菌菌株，已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.1862。
本发明的菌株来源于细菌型豆豉以山东临沂的细菌型豆豉为原料，采用常规梯度稀释法，涂布于KMB培养基，37℃培养24小时，挑选出菌落形态不同的六种菌株进行划线分离纯化，得到纯培养物，分别命名为BBDC1、BBDC2、BBDC3、BBDC4、BBDC5和BBDC6。经革兰氏染色、芽孢染色、接触酶实验检验都为阳性，证实其符合芽孢杆菌属的特征。再通过提取细菌总DNA，根据芽孢杆菌16srDNA的保守序列设计引物，利用PCR反应扩增得到各菌株的16srDNA，经纯化后用自动核酸测序仪测定16srDNA序列的组成，并将测序结果与genebank中的序列进行比对，鉴定BBDC1、BBDC2、BBDC3、BBDC4和BBDC5为枯草芽孢杆菌，BBDC6为地衣芽孢杆菌。用这些菌株进行了豆豉的试制研究，结果表明除菌株BBDC6发酵得到的产品外，其它都成红褐色或黑褐色，蛋白质含量为40～43％，氨基酸态氮含量为1.3～1.8％，总酸含量为1.0～1.5％，符合豆豉的中国行业标准SB82-80。
菌种保藏方法如下用LB培养基(胰蛋白胨5g、酵母粉2.5g、氯化钠5g、500ml蒸馏水、pH值7.5左右)37℃150rpm培养过夜，添加无菌甘油并使其终浓度为20％左右，放于-70℃保藏。
菌种保藏菌种分类命名枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；保藏日期2006年11月10日；保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；保藏编号NO.1862。
具体实施例方式
本发明为验证以上五种枯草芽孢杆菌BBDC1、BBDC2、BBDC3、BBDC4、BBDC5用于豆豉工艺的生产效果，分别用其作为制曲菌种，以大豆为主料，盐、糖、香辛料等调味料中的若干种为辅料来生产豆豉，具体工艺路线如下(1)大豆的浸泡和蒸煮以原料大豆重量3倍的水浸泡洗净的大豆3～10小时(根据水温差异)，使浸泡后豆的含水量在45～55％，沥尽水，常压蒸煮3小时或高压蒸煮20～60分钟(根据压力差异)。
(2)种子液的制备采用KMB液体培养基，无菌条件下分别接入5种菌种中的任一种，摇床150rpm培养18小时后根据营养琼脂平板菌落计数，用无菌生理盐水将其稀释成含活菌数107个/毫升的种子液。
(3)接种制曲按蒸煮大豆∶种子液(100∶1～3，w/v)的量接种后，在30～37℃放置48～72小时，洗曲。
(4)后酵洗曲后分别按洗曲后大豆重量的0～10％添加食盐和糖，按洗曲后大豆重量的0～0.1％添加香辛料，加水浸泡12～24小时，装坛，45～55℃放置15～30天(也可在后酵结束后进行调味以满足不同人群的口味需要)。
本产品依不同菌种呈红褐色和黑褐色，质地酥软，酱香浓郁，咸淡适口，有的略带甘甜。
本发明的有益效果是(1)使用本发明的纯种菌发酵，生产周期在34天以内，大大缩短了已有技术需要4个月以上的生产周期，提高了生产效率。
(2)使用纯种菌，避免了有害微生物的侵入，最终产品不需要灭菌处理，既可节省能源又可保证豆豉的卫生安全。
(3)避免了生产环境的时间和空间差异，便于生产过程的管理和控制，保证了成品感官和营养品质的稳定。
本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株BBDC4的16srDNA部分序列为以下序列表所示
序列表BBDC4gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta 60agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt 120tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag 180ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc 240cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg 300caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa 360agctctgttg ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct 420aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 480ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt ccttaagtct gatgtgaaag 540cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga 600gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag 660gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 720gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc 780ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa 840ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 900cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct 960tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1020ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct 1080aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1140ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag 1200gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt 1260gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1320tgtacacacc gcccgtcaca cca 134权利要求
1.适用于细菌型豆豉纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.1862，所述菌株的16srDNA序列组成如SEQIDBBDC4所述。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及微生物发酵菌株的确定。提供了5种适于细菌型豆豉生产的枯草芽孢杆菌菌株。5种菌株分别命名为BBDC1、BBDC2、BBDC3、BBDC4 BBDC5。本发明提供的5种菌株均来源于以细菌型豆豉为原料的筛选。采用本发明的菌株生产豆豉，可保证成品感官和营养品质的稳定，生产周期在34天以内，最终产品不需要灭菌处理，可节省能源又保证豆豉的卫生安全。菌株中BBDC4菌株的16srDNA部分序列如本发明的序列表SEQIDBBDC4所示，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.1862。
文档编号C12N15/31GK1986776SQ20061015543
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者李铎, 沈立荣, 冯凤琴, 李华 申请人:浙江大学