专利名称：一种枯草芽孢杆菌gu及其在制备高效生物复合磷肥中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于生产高效生物复合磷肥的土壤解磷芽孢杆菌及一种用该 菌株生产的高效生物复合磷肥。
背景技术：
磷是植物生长必需的矿质元素之一，是植物体内核酸的重要组成元素，而核酸又 是形成核蛋白的重要组成部分，核酸广泛地参与原生质及细胞器的组成。土壤中的磷，95% 以上为无效形式，主要与一些金属离子形成矿物磷酸盐类化合物，植物很难直接吸收利用， 化肥磷肥在当季作物中的利用率仅为5% 25%。我国缺磷土壤面积很大，有74%的耕地 土壤缺磷，即使经过多年不断的施用磷肥也没有明显的改善。土壤中的磷元素并不缺乏，经 过常年施用化肥的积累，磷元素在土壤中的含量很高，但植物无法吸收利用这些磷，如能提 高土壤中磷的利用效率将为中国农业带来巨大变化。由于土壤磷主要存在于土壤矿物或有 机质中，在自然状况下其释放速度很慢，很难满足植物生长发育的需要。某些微生物具有很 强的解磷功能，通过其分泌物或吸收作用把土壤中无效磷转化成有效磷，从而提高植物对 磷的利用率。筛选解磷微生物并生产，是解决植物缺磷问题的有效途径。解磷微生物除了 能够提高植物对磷的吸收率外还有其他优点，可促进植物生长，提高其他元素的吸收率，肥 效高，缓解环境等。目前农业上普遍使用的磷肥的磷元素利用率普遍不高，现有的生物肥料不但价格 贵、见效慢，而且活力损失快。筛选一种能够在田间存留时间长、解磷效果好高效的解磷微 生物，是解决此问题的关键，并用其生产一种速效、稳定、廉价的生物复合磷肥对我国种植 业具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有良好解磷效果、田间存留 时间长的枯草芽孢杆菌GU，以克服现有生物复合磷肥在价格、肥效和活力方面的缺点。本发明的目的还在于提供上述枯草芽孢杆菌GU在制备高效生物复合磷肥中的应用。本发明的另一目的在于提供一种高效生物复合磷肥，其具有速效、稳定、廉价的优 点，用于提高肥料中的磷素原料的利用率，并增加土壤中的可溶磷含量。为了实现上述目的，本发明提供的一种枯草芽孢杆菌⑶(Bacillus subtilis⑶)， 该菌株于2009年10月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 209228，该菌株具有高效解磷能力。上述菌种具有如下性质1、形态及生理特征单个细胞为0. 7 0. 8X2 3微米，芽孢为0. 6 0. 9X 1. 0 1. 5微米，革兰氏阳性菌，无荚膜，全身鞭毛，能活动。芽孢位於菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。在 液体培养基中静置培养时形成菌膜，兼性好氧。可在营养肉汤培养基和LB培养基上生长， 24小时可形成3 5mm直径菌落，菌落表面粗糙不透明，白色或微黄色。2、采用的培养基固体斜面分离及计数培养基蛋白胨0. 6%，牛肉膏0. 3%，琼脂1. 8%，pH值6. 8， 121 °C 灭菌 20min。液体种子培养基蛋白胨0.8%，牛肉膏0.3%，酵母膏0. 1%，NaCl 0.5%, KCl 0. 2%, MgSO4 · 7H20 0. 05%, CaCl2 0. 002%, MnSO4 · H2O 0. 001% g, pH 值 6. 8，121°C灭菌 20mino筛选及解磷性能测定培养基葡萄糖0.8%, (NH4)2SO4 0. 05%, NaCl 0. 02%, KCl 0. 02%,Ca3(PO4)21 %,MgSO4 ‘7H20 0. 02%,MnSO4 ·4Η20 0· 003%，琼脂 1· 6%，pH 7. 0,115°C 灭菌20min。发酵生产培养基玉米淀粉0. 5 % 2 %，玉米浆干粉1 % 5 %，酵母膏0. 01 % 0. 3%，蛋白胨 0. 05% 0. 5%, KH2PO4 0. 0. 4%, Na2HPO4 0. 2%~ 0. 8%, MgSO4 · 7H20 0. 01% 0. 04%, CaCl2 0. 01% 0. 04%, MnSO4 · H2O 0. 001% 0. 008% g，pH 值 6. 0 7. 5。3、培养条件培养温度35°C 40°C ；培养pH6. 5 7. 24、鉴定方法将筛选出的菌株样品分别按SDS方法提取总DNA，PCR扩增后对ITS序列进行测 定，使用Blast工具将测序结果与NCBI数据库进行对比，确定所分离得到的菌株为枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis) Identities = 96%, Gaps =1%。5、本发明所用的分析方法使用平板计数法测定产品的活菌总数。使用筛选培养基测量溶磷圈的大小判断菌株的解磷能力。使用国标GB/T 8573-1999的方法进行可溶磷的测定，并检测菌株的性能。相应地，本发明提供了上述菌株筛选、驯化方法将采集的样品(磷肥厂采集)称量10g，置于250ml锥形瓶中，加入IOOml生理 盐水，室温摇晃20min，吸取悬液Iml至装有9ml生理盐水的试管中，充分震荡摇勻；吸取 0. 2ml稀释液转移至上述固体培养基平板上，用三角玻璃棒涂布；将其置于30°C培养箱中 培养30小时。挑取长势良好的单一菌落，再上述固体培养基平板上进行划线，将其置于 30°C培养箱中培养30小时。用无菌牙签挑取长势良好的单一菌落，在上述筛选培养基上进 行点样，于30°C下培养3天，挑取溶磷圈较大的菌株至试管斜面培养基上培养保存；将试管 菌种接种到250ml锥形瓶(装液50ml)液体培养基中，培养基为上述液体培养基，将刚接种 的培养基取样用国标GB/T 8573-1999的方法进行可溶磷的测定，其结果作为空白，将锥形 瓶至于30°C下摇床培养，转速为200rpm，培养3天，再取样测定可溶磷的含量，将结果减去 空白得到菌株的解磷性能；筛选出的最优菌株。进一步地，本发明通过以下技术方案实现上述菌株菌粉的生产1、从斜面接种至摇瓶种子培养基中，36°C 38°C培养18 24小时后以0. 2% 的接种量接入发酵罐中。发酵培养条件为37°C培养48 56小时。2、培养完成后添加吸附载体0. 5% CaC03、l% 2%麸皮及助滤剂2%珍 珠岩、沸石粉。使用板框压滤机过滤。3、在滤渣中加入2. 3%的蔗糖均勻混合后进行闪蒸干燥，制得菌粉。4、菌粉芽孢率为89% 97%，总菌数为380 X IO8 460 X 108cfu/g。另外，本发明还提供了一种高效生物复合磷肥，该高效生物复合磷肥中含有有机 载体、磷素原料、以及强化刺激因子，所述有机载体中含有上述枯草芽孢杆菌GU的菌粉。其中，所述菌粉占所述有机载体的3% 5% (重量百分比)。优选地，所述有机载体中还包含占该高效生物复合磷肥重量百分比如下的成分 麸皮2% 10%，稻壳粉5% 15%，花生壳粉2% 4%。优选地，所述磷素原料为磷矿粉。优选地，所述强化刺激因子中含有占该高效生物复合磷肥重量百分比如下的 成分硫酸锰0. 15 % 0.2%、硫酸铜0. 18% 0.21%、尿素1.2% 1.8%、柠檬酸铵 1. 3% 1. 6%，蛋白胨 0. 0. 3%。在本发明高效生物复合磷肥的配置和组分优化过程中，将所得到的上述枯草芽孢 杆菌⑶的菌粉与有机载体充分混合，菌粉占有机载体的3 5% (重量比)，再将混合后的 有机载体与强化刺激因子充分混合，再与磷素原料磷矿粉混合，最后造粒。本发明设计了强化刺激因子配方组分，以加强在田中的应用效果。强化刺激因子 的组要成分是硫酸锰、硫酸铜、尿素、柠檬酸铵、及生长因子。通过各种实验进行优化后的强化刺激因子的成分为硫酸锰0. 15% 0.2%、 硫酸铜0. 18% 0.21%、尿素1.2% 1.8%、柠檬酸铵1.3% 1. 6 %，蛋白胨0. 1 % 0. 3%，其中各百分比含量是指占该高效生物复合磷肥重量百分比。采用本发明的菌种和生产方法生产出的生物复合磷肥，可直接施用于缺磷土壤 中，有效解决因缺磷造成的植物生长缓慢、苍老、无光泽、成熟延迟、抗病性差、产量和品质 下降等症状。且生产成本低廉，磷素原料粗放简单。采用本发明的菌种，可使施用后土壤 中的可溶磷含量维持在一定的浓度，在酸性土壤中可维持可溶磷含量大于25mg/kg，并可持 续。采用本发明的生物复合磷肥，不但可以长期为植物提供磷素，还可速效解决植物的缺磷 问题。在实验中，本发明中的生物复合磷肥可消除香蕉叶片出现的斑点，促进生长，抗病能 力增加。通过借助以下实施例将更详细地说明本发明，需要指出地是，以下实施例仅是说 明性的，本发明并不受这些实施例的限制。
具体实施例方式实施例一菌粉的生产1、从斜面接种至液体种子培养基中，37°C培养24小时。其中固体斜面培养基为蛋白胨0.6%，牛肉膏0.3%，琼脂1.8%，pH值6.8， 121 °C 灭菌 20min。液体种子培养基为蛋白胨0.8%，牛肉膏0.3%，酵母膏0. 1%，NaCl 0.5%, KCl 0. 2%, MgSO4 · 7H20 0. 05%, CaCl2 0. 002%, MnSO4 · H2O 0. 001% g, pH 值 6. 8，121°C灭菌
520min。2、种子培养完成后以0. 2%的接种量接入发酵罐中。发酵培养基为玉米淀粉1. 1%，玉米浆干粉3%，酵母膏0. 1%，蛋白胨0.2%， KH2PO4 0. 2%, Na2HPO4 0. 5%, MgSO4 · 7H20 0. 02%, CaCl4 0. 02%, MnSO4 · H2OO. 005% g, pH 值 6. 8。发酵培养条件为37°C培养50小时，转速250rpm，溶氧含量保持在30% 50%之 间。3、培养完成后添加吸附载体CaC03、2%麸皮和助滤剂2%珍珠岩、沸石 粉。使用板框压滤机过滤。4、在滤渣中加入2. 3%的蔗糖均勻混合后进行闪蒸干燥，干燥工艺为进口风温 度为160°C，出口风温度为140°C。5、收集菌粉，检测菌粉的芽孢率为95%，总菌数为434 XlO8Cfugt56、菌种解磷检测，使用解磷性能测定培养基葡萄糖0. 8%, (NH4)2SO4O. 05%,NaCl
0.02%,KCl 0. 02%,Ca3(PO4)2 1%,MgSO4 ·7Η20 0. 02%,MnSO4 ·4Η20 0· 003%，琼月旨 1· 6%， pH 7. 0，115°C灭菌20min。在平板上点样，30°C培养72小时，测得溶磷圈为6mm。实施例二 生物复合磷肥的生产1、选用有机载体麸皮、稻壳粉、花生壳粉比例为2 3 1，添加按质量比添加3% 的菌粉，充分混合。2、将混合载体后的菌粉按1 7与磷矿粉混合，添加强化刺激因子。3、强化刺激因子的成分为硫酸锰0. 16%、硫酸铜0. 18%、尿素1. 4%、柠檬酸铵
1.5%，蛋白胨 0. 15%。4、混合后造粒。5、充分混合后阴凉干燥处保存。6、经检验此生物复合磷肥的活菌数为1. 2X108，总磷含量为11. 2%，水溶性溶磷 含量为0.6%。实施例三应用试验实验作物香蕉试验样品在实验中使用了两种其他磷肥作为对照，并用清水做空白对照。土壤类型砖红壤试验方法一次施用磷肥后跟踪土壤中的可溶磷含量变化并对照亩产量。实验结果如下表1 土壤中可溶磷的含量测定(mg/kg) 表2:亩产量对比试验 实验证明使用本发明生物复合肥料可保持土壤较高的可溶磷含量，并对植物生长 具有良好的促进作用。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
权利要求
一种枯草芽孢杆菌GU，其保藏编号为CCTCC M 209228，具有高效解磷能力。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌GU，其特征在于该菌株为革兰氏阳性菌，菌体 杆状，能产生芽孢，无荚膜，全身鞭毛，能活动。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌GU，其特征在于该菌株的单个细胞为0.7 0. 8X2 3微米，芽孢为0. 6 0. 9X1. 0 1. 5微米。
4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌GU，其特征在于可在营养肉汤培养基和LB培 养基上生长，培养温度35°C 40°C，pH6. 5 7. 2，24小时可形成3 5mm直径菌落，菌落 表面粗糙不透明，白色或微黄色。
5.权利要求1 4中任意一项所述的枯草芽孢杆菌GU在制备高效生物复合磷肥中的 应用。
6.一种高效生物复合磷肥，该高效生物复合磷肥中含有有机载体、磷素原料、以及强化 刺激因子，其特征在于所述有机载体中含有如权利要求1 4中任意一项所述的枯草芽孢 杆菌GU的菌粉。
7.根据权利要求6所述的高效生物复合磷肥，其特征在于所述菌粉占所述有机载体 的3% 5% (重量百分比)。
8.根据权利要求7所述的高效生物复合磷肥，其特征在于，所述有机载体中还包含占 该高效生物复合磷肥重量百分比如下的成分麸皮2% 10%，稻壳粉5% 15%，花生壳 粉2% 4%。
9.根据权利要求6所述的高效生物复合磷肥，其特征在于所述磷素原料为磷矿粉。
10.根据权利要求6所述的高效生物复合磷肥，其特征在于，所述强化刺激因子中含有 占该高效生物复合磷肥重量百分比如下的成分硫酸锰0. 15% 0. 2%、硫酸铜0. 18% 0.21%、尿素1.2% 1.8%、柠檬酸铵1.3% 1.6%，蛋白胨0. 0. 3%。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌GU及其在制备高效生物复合磷肥中的应用。该枯草芽孢杆菌GU的菌种保藏号为CCTCC NoM 209228，其具有高效解磷能力，可用于制备高效生物复合磷肥。本发明还公开了一种高效生物复合磷肥，该高效生物复合磷肥中含有有机载体、磷素原料、以及强化刺激因子，所述有机载体中含有本发明的枯草芽孢杆菌GU的菌粉。本发明的高效生物复合磷肥，将本发明的枯草芽孢杆菌GU的菌粉，与磷矿粉和增强刺激因子按比例进行配伍，具有很强的供磷能力，一次施肥后可保持土壤中可溶磷含量大于25mg/kg并持续6个月，对促进我国种植业增产具有重要意义。
文档编号C12R1/125GK101899405SQ20101001950
公开日2010年12月1日 申请日期2010年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者曹昱 申请人:辛伟成