一种生物合成共轭亚油酸cla的方法

专利名称：一种生物合成共轭亚油酸cla的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物合成共轭亚油酸CLA的方法，尤其涉及一种合成脂肪酸的方法。
背景技术：
自然界来源的食物成分中，共轭亚油酸CLA(Conjugated linoleic acid)是目前 发现的唯一一种具有抗癌活性的天然物质。CLA是一类位置和几何异构体组成的十八碳二 烯酸，即双不饱和脂肪酸成分的总称。其中最常见和含量最高的cis-9，trans-11异构体 (c9tll-CLA)具有抗癌特性，能降低心血管疾病的发病率，改善免疫功能，抵抗糖尿病等； 另外一种trans-10，cis_12异构体(tl0cl2_CLA)的含量较低，参与控制身体脂肪的沉积， 减少肥胖症发生的概率，也是当前研究的热点。2008年，美国FDA颁发食品许可证，同意CLA 可以作为食品添加剂使用。目前，CLA已经被许多食品和制药企业作为保健品生产并出售。目前，商品CLA制剂主要是由亚油酸丰富的植物油类通过碱性异构化生成，主要 获得的是c9tll和tl0cl2的CLA混合物，二者的比例一般为1 1，这与牛奶中约80-90 1 的自然比例相差甚远；另外，碱性异构化过程中，会生成其它杂质性异构体，它们的比例甚 至能够达到30%以上，这些混杂的成分被人或动物消化吸收后，容易通过花生四烯酸代谢 途径衍生出多种有负面生物学效应的共轭类异构体。由此可见，作为食品添加剂的CLA，最 好来自生物合成的单一组分，而不是工业合成的复杂成分.除了部分植物种籽和猪牛羊肉含有极微量的CLA成分外，牛羊等反刍动物的乳汁 是目前已知的CLA含量最高的食物类型，一升牛奶中，CLA的平均含量在1. 4克左右。问题 是全球牛奶产量远远不能满足市场的需求；另外，约有20%的人对牛奶过敏，他们无法利 用牛奶CLA。生物学研究发现，牛奶中的c9t 11-CLA异构体占整个CLA总量的80-90 %之 间。当瘤胃微生物将亚油酸氢化成硬脂酸时，中间产物CLA通过逃逸方式进入动物血液，然 后分泌至乳汁中。目前，还未见动物细胞或者组织中表达外源SCD基因的报道，我们不清楚异源表 达SCD酶的具体功能，也不清楚异源表达的SCD酶是否能有效地生物合成CLA成分。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种合成脂肪酸的方法。本发明提供方法，为培养重组细胞，获得脂肪酸；所述重组细胞为将S⑶1的编码基因导入宿主细胞得到的重组细胞，所述S⑶1为 下述1)或2)的蛋白质1)由序列表中的序列2所示的蛋白质，2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由1)衍生的蛋白质。上述序列表中的序列2由359个氨基酸残基组成。所述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。所述培养的方法如下1)将所述重组细胞在不含反式十八碳烯酸的培养基中培养(10-14)小时，优选为10小时、12小时或14小时，2)再在含有反式十八碳烯酸的培养基中继续培养(45-50)小时获得脂肪酸；所述 培养优选为培养45、48或50小时。所述不含反式十八碳烯酸的培养基按照如下方法配制向DMEM培养基中添加胎 牛血清，所述胎牛血清在所述不含反式十八碳烯酸的培养基中的浓度为10% (体积百分 比)；所述含有反式十八碳烯酸的培养基按照如下方法配制向DMEM培养基中添加胎 牛血清和反式十八碳烯酸，所述胎牛血清在所述含有反式十八碳烯酸的培养基中的浓度为 10% (体积百分比)，所述反式十八碳烯酸在所述含有反式十八碳烯酸的培养基中的浓度 为(8-12) μ Μ,优选为 8 μ Μ、10 μ M 或 12 μ Μ。所述步骤1)和步骤2)的培养条件均为培养温度为37°C，CO2的含量为5%。所述S⑶1的编码基因为如下1)或2)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性具有相同功能的DNA分子。所述S⑶1的编码基因是通过重组表达载体导入宿主细胞。所述宿主细胞为真核细胞，所述真核细胞优选为HEK 293细胞。所述重组载体为将S⑶1的编码基因插入出发载体的EcoRI识别位点构建的重组 载体，所述出发载体优选为pCAGGS。所述脂肪酸为共轭亚油酸CLA和n-7脂肪酸家族；所述共轭亚油酸优选为顺 式-9，反式-11异构体c9tlI-CLA和/或反式_10，顺式-12异构体tl0cl2_CLA ；所述n_7 脂肪酸家族优选为棕榈油酸16: ln-7和/或顺式十八碳烯酸18: ln-7。所述方法在提高细胞内脂肪酸含量的应用也是本发明保护的范围，所述脂肪酸优 选为共轭亚油酸CLA和n-7脂肪酸家族；所述共轭亚油酸尤其优选为顺式_9，反式-11异 构体c9tlI-CLA和/或反式-10，顺式-12异构体tl0cl2_CLA ；所述n_7脂肪酸家族尤其优 选为棕榈油酸16: ln-7和/或顺式十八碳烯酸18: ln-7。本发明的另一个目的是提供一种重组细胞。本发明提供的重组细胞为将S⑶1的编码基因导入宿主细胞得到的重组细胞，所 述SCDl为下述1)或2)的蛋白质1)由序列表中的序列2所示的蛋白质，2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由1)衍生的蛋白质；所述S⑶1的编码基因为如下1)或2)中任一所述的DNA分子
1)序列表中的序列1所示的DNA分子； 2)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性具有相同功能的DNA分子；所述宿主细胞为真核细胞，所述真核细胞优选为HEK 293细胞。本发明的实验证明，将人类乙酰辅酶A脱氢酶(Stearoyl-CoA desaturase，SCD) 基因序列(GenBank accession number BC062303)的编码基因转入HEK 293细胞中，建立 稳定表达S⑶1基因的细胞系，异源表达的S⑶酶具有多种生物学活性，显著(p<0. 05)增 加了 4种脂肪酸组分的含量，其中共轭亚油酸CLA的c9tll异构体含量提高了 161-178% ； tl0cl2异构体含量提高了 229-312 % ；n-7脂肪酸家族的棕榈油酸(16:ln-7)含量从 1. 56-2. 26%提高至3. 47-4. 04% ；顺式十八碳烯酸(18: ln_7)含量由2. 42-3. 97%提升至 6. 20-7. 22%。本专利为进一步研究S⑶1基因功能以及利用S⑶生物合成CLA和n_7脂肪 酸家族的相关应用性研究提供了依据和方法。


图1为编号22的S⑶1阴性细胞(只表达neomycin基因)和编号34的SOTl阳 性细胞(同时表达neomycin和SCDl基因)的高压液相色谱分析过程中的部分图谱。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、外源S⑶1基因在HEK 293细胞中的稳定表达一、真核基因表达结构的构建人类SCDl基因克隆购自Open Biosystems公司。克隆中包含1080bp的cDNA片 段(发表的DNA序列见GenBank accession number BC062303)，该cDNA的核苷酸序列为 序列表中的序列1，序列1编码蛋白SCD1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。根据 cDNA的核苷酸序列设计并合成PCR引物，上游引物为5，-CCG GAA TTC CGGGCC ACC ATG GAG CAG AAA CTC ATC TCT GAA GAG GAT CTG ATG CCG GCC CAC TTG CTG-3’ ；下游引物 为 5，-GGA ATT CCT CAT CAG CCA CTC TTG TAG TTT CCA TCT CCG-3，，以人类 SCDl 基因 克隆为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物，然后将PCR产物经EcoRI酶切后的片段连接 到同样经 EcoRI 单酶切的 pCAGGS 质粒(Xu L, Daly T, Gao C, FlotteTR, Song S, Byrne BJ, Sands MS, Parker Ponder K. CMV—beta—actin promoter directshigher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than thecytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results intherapeutic levels of human factor X in mice. Human Gene Therapy，2001 ;12 :563_573，公众可从中国农业大学获 得。)上，构建成PS⑶质粒。将pS⑶质粒进行酶切鉴定和DNA测序分析，结果证明，构建的 真核表达载体正确，S⑶1基因序列没有突变。苯酚一氯仿抽提并纯化PS⑶质粒，用于转 染 HEK 293 细胞(Sigma,目录号 85120602)。同时，苯酚一氯仿抽提并纯化pNeomycin质粒DNA备用(Kaufman RM, Lu ZH, BehlR, Holt JM, Ackers GK, Ley TJ. Lack of neighborhood effects from ^transcriptionalIy active phosphoglycerate kinase-neo cassette locatedbetweenthe murine beta-major and beta-minor globin genes. Blood,2001 ；98 :65_73 ； 公众可从中国农业大学获得。)。二、细胞培养与转染 按照常规方法，在37°C，5% CO2培养条件下，HEK 293细胞用DMEM细胞培养液 (high glucose，Gibco 公司)+10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS, GIBC0)培养。细 胞传代时，使用0. 05% (w/v) trypsin (胰蛋白酶)+0. 04% (w/v)EDTA溶液在37°C消化2分 钟即可。转染细胞前5-10分钟，8 μ g上述的pSCD质粒DNA和2 μ g上述的pNeomycin质 粒DNA充分混合备用；总数为4 X IO6的HEK 293细胞，消化并充分洗涤后，重悬浮至400 μ 1 Ca2+-free PBS (pH 7. 4)，细胞溶液移至 P/N 640 型电转杯底部(4_mm，BTX Co. Ltd.，USA)， 然后加入两种DNA的混合物，轻轻的彻底混勻，冰浴10分钟，紧接着，将电转杯接入ECM 2001型电转仪(BTX)，准备电转染。电转染的具体参数是连续5次直流电脉冲，每次脉冲强 度是0. 575kV/cm,时长4毫秒。电刺激后，细胞/DNA混合物在冰上再静置10分钟。将细胞溶 液轻轻转入离心管中，用DMEM溶液离心(1000rpm，5min)洗涤2次，重新悬浮至DMEM+10% FBS培养液中，调整细胞密度至2X 105/ml，然后将细胞铺至24-孔培养板(Nunc公司)中， 培养24小时，再添加G418(Geneticin，Gibco)至终浓度为400μ g/ml。继续培养4天后， G418抗性细胞克隆用无菌玻璃细管挑至新的培养孔中，继续用G418筛选10天，然后逐渐撤 除G418，获得稳定生长的59株抗G418细胞，这些细胞正常扩增并冻存待用。三、RT-PCR转录分析消化并离心回收汇合度达70%的59株抗G418细胞，按照标准方法用RNAiso Plus (TaKaRa)试剂提取细胞总RNA，并且用DNase I (TaKaRa)消化去除混杂的DNA成分。用 纯化RNA进行反转录获得cDNA，使用M-MLV反转录酶(Promega)，按照生产商提供的说明操 作。为了检测是否存在基因组DNA的污染，每个RNA样品均有不添加反转录酶的阴性对照。设计并合成不同基因的PCR扩增引物，具体地，SCDl (188bp)基因上游引物5’_GTG CTG GTT GTT GTG 0^-3，，下游引物5，-狀〇 TTA TCT CCT CCA TTC TGC-3，;HPRT (HPRT 属于 哺乳类的持家基因，作为一个阳性参照物)(352bp)基因上游引物5’-CCT GCT GGA TTA CAT TM AGC ACT G-3，，下游引物 5，-GTC MG GCA TAT CCMCA ACA AAC-3，；neomycin (neomycin 基因属于抗G418药物的基因，用来筛选药物抗性细胞，494bp)基因上游引物5’ -TCA CTG AAG CGG GAA GGG ACT-3，，下游引物 5，-AGC GGC GAT ACC GTA AAG CAC-3，。以上述反转 录获得的cDNA为模板，分别以上述三个基因的引物为引物，用相同的PCR条件，分别扩增三 个基因的部分特异片段。PCR条件是94°C，lmin，60°C，lmin，72°C，lmin，共35个循环。PCR 产物进行凝胶电泳分析并拍照。RT-PCR实验结果证明，59株抗G418细胞中，有11株细胞同时整合并且转录表达 S⑶1基因(同时表达neomycin和HPRT两个基因，且都能够存活并生长。)，命名为SOTlW 性细胞系；有48株细胞仅转录neomycin基因，将这些细胞命名为SOTl阴性细胞系。实施例2、脂肪酸测定及外源S⑶1基因指导的CLA生物合成分别从由实施例1获得的S⑶1阴性细胞系和S⑶1阳性细胞系，随机选择4株S⑶1 阴性细胞(编号分别为1，2，19和22)和2株SCDl阳性细胞(编号分别为3和34)分别按 每毫升2 X IO5个细胞的密度接种至100-mm培养皿(Nunc)中，其中22号SOTl阴性细胞多1份，作为不添加底物的空白对照。方法一将上述接种100-mm培养皿(Nunc)中的4株SOTl阴性细胞(编号分别为1，2，19和 22, 2 XlOVml)和2株SCDl阳性细胞(编号分别为3和34，2 X 105/ml)正常培养(DMEM培养 基+10%胎牛血清；37°C，5% C02) 12小时后，再在含有反式十八碳烯酸(VA，Sigma V1131) 的培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清+10 μ M反式十八碳烯酸)(空白对照除外，不加底 物)，继续培养48小时后，将各株细胞收集至带聚四氟乙烯瓶盖的玻璃甲基化管中，参照文 献(陈青，柳青，吴至芳，王宗义，苟克勉.棉花脂肪酸脱氢酶FAD2能够实现转基因小鼠η-6 脂肪酸的内源性生物合成.中国科学C辑生命科学.2009 ;39 (8) :755-780)所述方法，进 行高压液相色谱分析。具体步骤是管内细胞先溶于1.5ml正己烷，接着添加1.5ml 14% 的BF3/Me0H试剂(Sigma)混勻，向玻璃管中充入氮气，沸水浴Ih后自然冷却至室温，添加 1.5ml双蒸水，离心(3, OOOrpm, Imin)分离的上相直接进样到DB-23型色谱柱(Agilent, Palo Alto，CA，USA)，使用HP6890全自动气相色谱仪(Agilent)进行分析。参照脂肪酸标准 品(Sigma 05632，46905-U和47015-U) (3个标准品混合后使用，且表1中各成分在混合后 的标准品都有。)的峰面积，将仪器检测到的信号，用GC ChemStation Software(Agilent) 软件处理，计算相对含量，细胞培养和脂肪酸测定的实验连续重复4次。1、脂肪酸测定高压液相色谱见图1，图1显示了液相色谱仪监测到的部分脂肪酸组分的信号图， 包括SCDl阴性细胞22号(上图)和SCDl阳性细胞34号(下图)样品。从图中看出，相 对于22号阴性细胞的脂肪酸含量来说，34号阳性细胞中的两种n-7脂肪酸成分(16: ln_7 和18: ln-7)和两种CLA组分(c9tIl-CLA和tl0cl2_CLA)显著升高(ρ < 0. 05)；而添加的 底物VA含量显著下降(ρ < 0. 05)。2、脂肪酸测定结果统计分析上述6株细胞的脂肪酸测定结果计算并汇总成表1。其中，阳性细胞脂肪酸各组分 的显著性差异是与阴性细胞的数据最高值统计分析得到的。参照RT-PCR的转录分析结果， 6株细胞分为两 组，第一组包括1，2，19和22号S⑶1基因的阴性细胞；第二组包括3和34 号SCDl基因的阳性细胞。对应的脂肪酸成分的转化效率用产物/ (底物+产物)X 100%来表不。表1. S⑶1细胞的相关脂肪酸组分. 表格说明表中数据为mean士SD，来自4次重复实验的结果。代表各脂肪酸组分 占细胞脂肪酸总量的百分比。ND表示未检测到该组分；Total CLA表示c9tll和tl0cl2 总量；Total n-6 表示 18 2n_6+18 3n_6+20 2n_6+20 4n_6+22 4n_6 之禾口 ；Totaln_3 为 18:3n-3，20:5n-3，22:5n-3 和 22:6n_3 组分之和；n_7 转化率=产物(16 ln-7+18 ln_7) / [底物(16:0) +产物(16: ln-7+18: ln-7)] X 100% ；c9tll 转化率=产物 c9tll_CLA/(产物 c9tIl-CLA+底物VA) X 100%。用t_检验分析阳性和阴性细胞组间各组分的差异，*表示 阳性和阴性细胞相应组分间差异显著(P < 0. 05)。从表1中可以看出基因表达能够将VA底物转化成c9tll-CLA。c9tlI-CLA(c9tll)在SCDl阴性细胞中的含量范围是0· 73_1· 09%，而在SCDl阳 性细胞的含量为2. 69-2. 86% (ρ < 0. 05)，相对于数值最高的22号阴性细胞而言，SOTl阳 性细胞中的c9tll-CLA含量至少升高了 161-178% (ρ < 0. 05)。S⑶1阴性细胞中，VA生成 c9tIl-CLA的转化效率只有5. 11-6. 88%，SOTl阳性细胞中，VA生成c9tll_CLA的转化效率 高达16. 49-20. 06%，差异显著(ρ <0.05)。34号样品中，底物VA的含量明显降低。说明SCD能够将VA脱氢转化为c9tl I-CLA (c9t 11)。
2) SSDl基因表达能够提高细胞中tl0cl2_CLA的含量。S⑶1阴性细胞的tl0cl2_CLA含量是0. 1-0. 41%，但是SOTl阳性细胞样品的该组分含量达到了 1.35-1.69% (ρ <0.05)。相对于数值最高的1号阴性细胞而言，SOTl 阳性细胞中tl0cl2-CLA的含量升高了至少229-312%。说明SOTl基因的表达，会影响到 tl0cl2-CLA组分的含量。这个结果表明S⑶1基因的表达能够同时提高两种CLA组分，这两 种组分都具有比较好的生物学活性，更增强了 SCDl基因的应用价值。将两种CLA组分综合 在一起计算，S⑶1阴性细胞的CLA总量只有1. 00-1. 37%，SOT1阳性细胞的CLA总量提升至 4.21-4.38%。相对于数值最高的2号阴性细胞而言，提升了至少207-220% (ρ < 0. 05)。3) S⑶1基因表达能够提高η-7脂肪酸家族的含量η-7脂肪酸家族的基本成分是棕榈油酸(16: ln-7)，在细胞正常代谢酶系的作用 下，棕榈油酸能够继续延长碳链，合成其它η-7成分。SCDl基因具有Delta-9脱氢酶活性， 它应该可以将棕榈酸(16:0)脱氢生成棕榈油酸，进而可以提高整个η-7脂肪酸家族的含 量。本发明中，对于η-7家族的两个主要成分来说，SCDl阴性细胞中，棕榈油酸(16: ln-7) 和顺式十八碳烯酸(18: ln-7)的含量分别是1.56-2. 26%和2.42-3.97%，SCDl阳性细 胞中，棕榈油酸(16:ln-7)和顺式十八碳烯酸(18:ln-7)的含量分别升到了 3.47-4.04% (P < 0. 05)和 6. 20-7. 22 % (ρ < 0.05)，相应的转化效率((16 ln—7+18 ln_7) / (16 ln-7+18 ln-7+16 0)，即 n_7 转化率)由 12. 01-16. 70 % 提升至 22. 63-24. 13 % (ρ < 0. 05)。4) S⑶1基因表达没有提高η-9脂肪酸家族的含量η-9脂肪酸家族的基本成分是油酸(18: ln-9)，在细胞正常代谢酶系的作用下， 油酸能够继续延长碳链，合成其它η-9成分。在SCDl阴性细胞和SCDl阳性细胞中，油酸 (18: ln-9)含量以及油酸转化效率(18:ln-9/18:0)都没有显著变化(ρ > 0.05)。也就是 说，S⑶不能有效地将18:0生成η-9家族脂肪酸。除了上述相关脂肪酸成分外，需要说明的是，S⑶1基因表达不影响η-6和η_3家 族的脂肪酸含量，η-6/η-3比例仍然保持在1 1左右(见表1)。这两种不饱和脂肪酸成 分是细胞的必需脂肪酸，最理想比例也应该在5-1 1左右。也就是说，S⑶1基因的表达 并不影响必需脂肪酸的代谢，在实际应用过程中没有任何消极的影响。综上所述，S⑶1基因不仅具有广泛的生物学活性，而且具有明显的应用价值。方法二与方法一的步骤基本相同，不同的是正常培养10小时后，在含有反式十八碳烯酸 的培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清+8 μ M反式十八碳烯酸)，继续培养40小时获得共 轭亚油酸。检测方法与结果与方法一无显著差异。方法三与方法一的步骤基本相同，不同的是正常培养14小时后，在含有反式十八碳烯酸 的培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清+12 μ M反式十八碳烯酸)，继续培养50小时获得共 轭亚油酸。检测方法与结果与方法一无显著差异。
权利要求
一种合成脂肪酸的方法，为培养重组细胞，获得脂肪酸；所述重组细胞为将SCD1的编码基因导入宿主细胞得到的重组细胞，所述SCD1为下述1)或2)的蛋白质1)由序列表中的序列2所示的蛋白质，2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由1)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述培养的方法如下1)将所述重组细胞在不含反式十八碳烯酸的培养基中培养(10-14)小时，优选为10小 时、12小时或14小时，2)再在含有反式十八碳烯酸的培养基中继续培养(45-50)小时获得脂肪酸；所述培养 优选为培养45、48或50小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤1)和步骤2)的培养条件 均为培养温度为37°C，C02的含量为5%。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述SCD1的编码基因为如下1) 或2)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性具有相同功能的DNA分子。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述SCD1的编码基因是通过重 组表达载体导入宿主细胞。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述宿主细胞为真核细胞，所述 真核细胞优选为HEK 293细胞。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述重组载体为将SCD1的编码 基因插入出发载体的EcoRI识别位点构建的重组载体，所述出发载体优选为pCAGGS。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述脂肪酸为共轭亚油酸CLA 和n-7脂肪酸家族；所述共轭亚油酸优选为顺式-9，反式-11异构体c9tll-CLA和/或反 式-10，顺式-12异构体tl0cl2-CLA ；所述n-7脂肪酸家族优选为棕榈油酸16 ln-7和/或 顺式十八碳烯酸18: ln-7。
9.权利要求1-8所述方法在提高细胞内脂肪酸含量的应用，所述脂肪酸优选为共 轭亚油酸CLA和n-7脂肪酸家族；所述共轭亚油酸尤其优选为顺式_9，反式-11异构体 c9tll-CLA和/或反式-10，顺式-12异构体tl0cl2-CLA ；所述n_7脂肪酸家族尤其优选为 棕榈油酸16: ln-7和/或顺式十八碳烯酸18: ln-7。
10.一种重组细胞，为将S⑶1的编码基因导入宿主细胞得到的重组细胞，所述S⑶1为 下述1)或2)的蛋白质1)由序列表中的序列2所示的蛋白质，2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能由1)衍生的蛋白质；所述SCD1的编码基因为如下1)或2)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性具有相同功能的DNA分子；所述宿主细胞为真核细胞，所述真核细胞优选为HEK 293细胞。
全文摘要
本发明公开了一种生物合成共轭亚油酸的方法。本发明提供重组细胞，为将SCD1的编码基因导入宿主细胞得到的重组细胞，所述SCD1的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述SCD1的编码基因为序列表中的序列1。所述SCD1的编码基因是通过重组表达载体导入宿主细胞。本发明提供的合成共轭亚油酸的方法，为培养所述的重组细胞，获得共轭亚油酸。本发明的实验证明，将人类乙酰辅酶A脱氢酶(Stearoyl-CoAdesaturase，SCD)基因序列的编码基因转入HEK 293细胞中，G418筛选获得稳定表达SCD1基因的细胞系，异源表达的SCD酶具有多种生物学活性，显著(p＜0.05)增加了共轭亚油酸和n-7脂肪酸组分的含量。
文档编号C12R1/91GK101864463SQ20101020022
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月9日 优先权日2010年6月9日
发明者苟克勉 申请人:中国农业大学