专利名称：大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28 K的RNAi植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一个大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体的构 建，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
大豆[Glycine max(L. )Merr.]食物过敏是一个全世界密切关注的公共健康问题。 大豆蛋白在食品加工业的广泛应用，给大豆过敏人群带来了一定的食物安全问题。调查发 现，全世界约2 %的成年人和6 % 8 %的儿童患有食物过敏症，大豆过敏症多发于5岁以下 的幼儿，主要表现为胃部不适或过敏性皮炎，主要的症状是口周红斑、唇肿、起疹子、皮肤发 痒、腹泻等，严重时可危及生命。RNA干扰(RNA interference,简称RNAi)，又称为转录后基因沉默，是一种快速关 闭基因的新方法。也是研究生物体基因表达、调控与功能的一项新技术，其实质是小干扰 RNA(small interfering RNA, siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默。其作用 机理是siRNA与对应的mRNA特异结合并引起降解，从而阻止mRNA的翻译，特异性抑制靶基 因的表达，因此成为基因敲除的强大工具。大豆蛋白质中含有多种过敏蛋白。主要的有以下8种Gly m Bd 28K、Gly m Bd30K、Gly m Bd 60K(即β-伴球蛋白的α亚基)、胰蛋白酶抑制剂、Gly m lA、Gly m IB、 Gly m 2和Gly m 3。最安全有效防止大豆食品过敏的措施就是培育脱致敏的大豆新品种。 尽管传统育种技术已经成功地改善了大豆的营养价值，然而，这种过程不仅耗时，而且利用 空间有限，也很难同时改变大豆多个品质性状，毕竟，大豆可改良的遗传资源是有限的，并 且对于大豆性状的改良只限于已经得到的突变体材料。而RNA干扰技术，能够扩大可操作 基因的范围和突变的种类，且对目的基因的表达有了可控性，同时RNAi所具有的特异性、 稳定性、高效、快速以及不改变其它基因的表达等特性，为RNAi在植物功能基因组学研究 以及植物的遗传改良等方面提供了一个强有力的手段。RNAi技术在作物品质改良上具有广 阔的应用前景。
发明内容
技术问题本发明涉及大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体 的构建，属于分子生物学领域。构建的RNAi植物表达载体可导入大豆及其它含有过敏蛋白 质的植物，消除过敏蛋白质对过敏人群的危害，可用于植物品种改良。技术方案大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体，其构建方法为1)ρΒΙ121的nos序列的改造设计引物Pl、P2，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Asc I位点的nos终止子片 段，上游引物Pl :5~-AGGCGCGCCGATCGTTCAAACATTTGGCA-3、
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下游引物 P2 5~ -GGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3、PCR扩增产物连入pMD19-T simple vector中，测序验证；设计引物P3，与下游引物P2，以含Asc I位点的nos终止子片段为模板，扩增得到 含Sac I和Asc I两个酶切位点的nos片段，上游引物P3 5~ -CGAGCTCGGCGCGCCGATCGTTCA-3、PCR 扩增产物连入 pMD19-T simple vector 中，测序验证，得 PMD-nos ；质粒pMD-nos和质粒pBI121分别EcoR I/Sac I双酶切，回收pMD_nos中的小段 和pBI121的大片段后连接，得到中间载体pBI121-n0S ；2)pBI121的GUS序列的改造设计引物P4、P5，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Pac I位点的⑶S片段，上游引物P4 5~ -CCTTAATTAAATGTTACGTCCTGTAGAA-3、下游引物P5 -CGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTGC-3、PCR 扩增后，连入 pMD19-T simple vector 中，测序验证；设计引物P6，与上游引物P4，以含Pac I位点的⑶S片段为模板，扩增得到上游含 XbaI和Pac I两个酶切位点的⑶S片段，上游引物P6 -CTCTAGATTAATTAAATGTTACGTCCTGT-3、PCR 扩增产物连入 pMD19-T simple vector 中，测序验证，得 pMD-GUS ；质粒pMD-GUS和质粒pBI121_nos分别Sac I/Xbal双酶切，回收pMD-GUS中的小 片段和pBI121-n0S中的大片段后连接，得到载体pBI121-n0S-GUS ；3)质粒 pBI121-nos-GUS 和质粒 pCAMBIA3301 分别 EcoR I/Hind III 双酶切，回收 pBI121-nos-GUS的小片段和pCAMBIA3301的大片段连接，得到载体pGSB ；4)将CHAS内含子序列连入载体pGSB选用‘南农32’作为材料，取幼嫩叶片，按照TaKaRa公司提供的基因组DNA提取试 剂盒说明书要求，提取大豆叶片基因组DNA ；设计引物Fl、F2，以基因组DNA为模板，获得含酶切位点的CHAS片段，上游引物Fl -CCTTAATTAAGTGTAAGAATTTCTTATGTTACA-3、
下游引物 F2 5~ -CGAGCTCACCTGCAAATTGACCAA-3、PCR 扩增产物连入 pMD19-T simple vector 中，测序验证，得 pMD-CHAS ；质粒pMD-CHAS和质粒pGSB分别Sac I/Pac I双酶切，回收pMD-CHAS的小片段和 PGSB的大片段，连接得到载体pGSBI ；5) Gly m Bd 28K干扰片段的获得选用‘南农32’作为材料，取幼嫩荚果，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒 说明书提取豆粒总RNA，取2 μ g总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。根据NCBI上 公布的GenBank :AB046874. 1大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 28K的序列信息设计特异引物， 进行常规聚合酶链式PCR反应，分别扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列SEQ IDN0. 13 和反义序列SEQ ID N0. 14，扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列引物上游引物Rl 5~ -CGAGCTCAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3、下游引物R2 -TTGGCGCGCCCATCATTTTCTTCAGCTGT-3、
扩增Gly m Bd 28K干扰片段的反义序列引物上游引物R3 -GCTCTAGACATCATTTTCTTCAGCTGTTG-3~
下游引物 R4 5~ -CCTTAATTAAAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3、PCR扩增产物分别连入PMD 19-T simple vector中，测序验证，得pMD_28S和 PMD-28A ；6) Gly m Bd 28K RNAi植物载体的构建pMD-28A与pGSBI分别Pac I/Xba I双酶切，回收pMD_28A的小片段与pGSBI的大 片段连接，得到含反义片段的载体PGSBI-28A ；pMD-28S与pGSBI_28A进行Sac I/Asc I双酶切，回收pMD_28S的小片段与 PGSBI-28SA的大片段连接，得同时含Gly m Bd 28K正义和反义片段的RNAi植物表达载体 PYZ, Xba I/Asc I双酶切验证，构建成功。有益效果1.本发明构建的Gly m Bd 28K RNAi载体为大豆中首次报道，可导入大豆及其它 过敏作物中，消除过敏蛋白质对过敏人群的危害，可进行植物品种改良。2. RNAi比反义RNA技术更有效，能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，使目标 基因表达降到极低水平甚至完全“剔除”，从而产生缺失突变体表型，因此更容易产生功能丧失。3.国内外研究表明利用RNAi技术，能快速有效地关闭相应基因，使得生物体产生 相应的功能缺表型，从而可确定对应基因的功能，且具有特异性、高效性和广泛性的优势。
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图1干扰载体的双酶切鉴定1 :pYZ 质粒；2 :pYZ/Xba I/Asc I ；3 :DNA Marker(10kb/8kb/6kb/5kb/4kb/3kb/2kb/lkb/0. 5kb)图2Gly m Bd 28K发卡结构示意3Gly m Bd 27K的RNAi植物表达载体质粒图谱
五具体实施例方式LpBI 121载体的改造1)ρΒΙ121的nos序列的改造①设计引物PI、P2，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Asc I位点的nos终止子 片段，上游引物Pl -AGGCGCGCCGATCGTTCAAACATTTGGCA-3、下游引物P2 -GGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3、扩增体系模板pBI121 质粒 1. 0μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0 μ L, PU Ρ2 弓I · # 1· 0 μ L(20 μ mol · Ι71)， dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · I71) ， PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0. 2 μ L, ddH20 37.8 μ L ；扩增程序94°C预变性4min，94°C变性 308，51.91退火308，721延伸308，721延 伸IOmin, 30个循环；
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PCR产物连入克隆载体pMD19-T simple vector中，测序验证；②设计引物P3，与下游引物P2，以含Asc I位点的nos终止子片段为模板，扩增得 到含Sac I和Asc I两个酶切位点的nos片段，上游引物P3 -CGAGCTCGGCGCGCCGATCGTTCA-3、扩增体系模板质粒1. 0 μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0 μ L, Ρ3、Ρ2 引物各 1· 0 μ L(20 μ mol · Ι71)，dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Ι71)，Prime STAR HS DNA Polymerase 0. 2μ L, Ckffl2O 37. 8μ L ；扩增程序94°C预变性4min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，72°C延伸 10min，30个循环；PCR 扩增产物连入 pMD19_T simple vector 中，测序验证，得 pMD-nos ；③质粒pMD-nos和质粒pBI121分别EcoR I/SacI双酶切，双酶切反应 2. 0 μ LNEBuffer 1,0. 2μ L BSA，质粒彡 1 μ g，EcoR I 和 Sac I 各 0. 5 μ L，补水至 20 μ L， 37。C 反应 2h ；回收pMD-nos中的小段和pBI121的大片段，连接得到中间载体pBI121_n0S ；2)pBI121的GUS序列的改造①设计引物P4、P5，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Pac I位点的⑶S片段，上游引物P4 -CCTTAATTAAATGTTACGTCCTGTAGAA-3、下游引物P5 CGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTGC-3、扩增体系模板pBI121 质粒 1. 0μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0 μ L, Ρ4, Ρ5 弓I · # 1· 0 μ L(20 μ mol · Ι71)， dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Ι71) ， PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0. 2 μ L, ddH20 37.8 μ L ；扩增程序94°C预变性4min，94°C变性 30s, 57. 2°C退火 30s，72°C延伸 Imin 45s， 72°C延伸10min，35个循环；PCR扩增产物连入pMD19_T simple vector中，测序验证；②设计引物P6，与上游引物P4，以含Pac I位点的⑶S片段为模板，扩增得到上游 含XbaI和Pac I两个酶切位点的⑶S片段，上游引物P6 -CTCTAGATTAATTAAATGTTACGTCCTGT-3、扩增体系模板1. 0 μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0 μ L, Ρ6、Ρ5 引物各 1· 0 μ L(20 μ mol · Ι71)， dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Ι71)， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 2μ L, Ckffl2O 37. 8μ L ；扩增程序94°C预变性 4min，94°C 变性 30s，56. 8 °C 退火 30s，72°C 延伸 30s，72 °C 延 伸10min，30个循环；PCR 扩增产物连入 pMD 19-T simple vector 中，测序验证，得 PMD-GUS ；③质粒pMD-GUS和质粒pBI121_nos分别Sac I/Xba I双酶切，双酶切反应 2. 0 μ LNEBuffer 4,0. 2μ L BSA，质粒彡 1 μ g，XbaI 禾口 Sac I 各 0. 5 μ L，补水至 20 μ L， 37 °C反应2h ；回收pMD-GUS中的小片段和pBI 121-nos中的大片段后连接，得到载体 pBI121-nos-⑶S3)质粒pBI121-nos-GUS和质粒pCAMBIA3301 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任 公司)分别EcoR I/Hind III双酶切，双酶切反应2. 0 μ L Buffer Ε,0. 2μ L BSA，质粒
7≤ 1 μ g，EcoR I 和 HindIII 各 0. 5μ L，补水至 20μ L，37°C，反应 2h ；回收 pBI121-nos_GUS 的小片段和PCAMBIA3301的大片段连接，得到载体pGSB ；2. CHAS (GenBank :ΑΥ310901· 1)内含子序列替换载体pGSB中的GUS序列1)选用‘南农32，作为材料，取幼嫩叶片，按照TaKaRa公司提供的基因组DNA提取 试剂盒说明书要求，提取大豆叶片基因组DNA。根据NCBI上公布的(GenBank :AY310901. 1) 的序列信息为模板，设计引物F1、F2，以基因组DNA为模板，获得含酶切位点的CHAS片段，上游引物Fl -CCTTAATTAAGTGTAAGAATTTCTTATGTTACA-3、下游引物F2 -CGAGCTCACCTGCAAATTGACCAA-3、扩增体系模板DNA 1. 0μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5· O μ L，Fl、F2 引物各 1· O μ L(20 μ mol · Ι71)， dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · I71)， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 2μ L, Ckffl2O 37. 8μ L ；扩增程序94°C预变性4min，94°C变性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 Imin 30s， 72°C延伸10min，30个循环；PCR 扩增产物连入 pMD19-T simple vector 中，测序验证，得 pMD-CHAS ；2)质粒pMD-CHAS和质粒pGSB分别Sac I/Pac I双酶切，双酶切反应2·OyL NEBuffer 1,0. 2μ 1 BSA，质粒≤ 1 μ g，Sac I 和 Pac I 各 0. 5 μ L，补水至 20 μ L ；37°C,反应 2h ；回收pMD-CHAS的小片段和pGSB的大片段，连接得到载体pGSBI ；3. Gly m Bd 28K RNAi植物载体的构建DGly m Bd 28K干扰片段的获得选用‘南农32’(审定品种，审定编号国审豆2008025，市场购买)作为材料，取幼 嫩荚果，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2 μ g总RNA 合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。根据NCBI上公布的大豆过敏蛋白基因Glym Bd 28K 的序列信息(GenBank :AB046874. 1)设计特异引物，进行常规聚合酶链式(PCR)反应，分别 扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列SEQ ID N0. 13和反义序列SEQ ID N0. 14，扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列引物上游引物Rl 5~ -CGAGCTCAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3、下游引物R2 -TTGGCGCGCCCATCATTTTCTTCAGCTGT-3、扩增Gly m Bd 28K干扰片段的反义序列引物上游引物R3 5~ -GCTCTAGACATCATTTTCTTCAGCTGTTG-3~下游引物R4 -CCTTAATTAAAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3、Gly m Bd 28K 正义序列的扩增体系模板 cDNA ( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0μ L，R1、R2 引物各 1. 0μ L(20ymol ‘ L-1), dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Γ1)，PrimeSTAR HSDNA Polymerase 0. 2 μ L, ddH20 37. 8 μ L ；扩增程序采用二温法94 V预变性4min，94 V变性30s，70 V退火45s，72 V延伸 IOmin, 30个循环；Gly m Bd 28K 反义序列的扩增体系模板 cDNA ( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0μ L，R3、R4 引物各 1. 0μ L(20ymol ‘ L-1), dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Γ1)，PrimeSTAR HSDNA Polymerase 0. 2 μ L, ddH20 37. 8 μ L ；
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扩增程序采用二温法94°C预变性4min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 45s，72°C延伸 IOmin, 30 个循环；P°C R扩增产物分别连入PMD19-T simple vector中，测序验证，得PMD-28S和 PMD-28A ；2) Gly m Bd 28K干扰载体的构建①载体pGSBI-28A的获得pMD-28A 与 pGSBI 分别 Pac I/Xbal 双酶切，双酶切反应2. 0 μ L NEBuffer 4， 0. 2μ LBSA，质粒彡 1 μ g，Xba I 和 Pac I 各 0. 5 μ L，补水至 20 μ L，37 °C 反应 2h。回收 PMD-28A的小片段与pGSBI的大片段，连接得到含反义片段的载体pGSBI_28A ；②Gly m Bd 28K干扰载体pYZ的获得pMD-28S 与 pGSBI_28A 分别 Sac I/Asc I 双酶切，双酶切反应2. 0 μ L NEBufier 4，0.2yL BSA，质粒彡 lyg，Sac I 和 Asc I 各 0· 5 μ L，补水至 20 μ L，37°C反应 2h。回收 PMD-28S的小片段与pGSBI-28A的大片段，连接得到同时含Gly m Bd 28K正义和反义片段 的干扰载体pYZ。双酶切(Xba I/Asc I)验证，构建成功。综上所述，本发明构建的Gly m Bd 28K RNAi载体pYZ为大豆中首次报道，导入大 豆及其它过敏作物中，消除过敏蛋白质对过敏人群的危害，可进行植物品质改良。国内外研 究表明利用RNAi技术，能快速有效地关闭相应基因。
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权利要求
大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体，其构建方法为1)pBI121的nos序列的改造设计引物P1、P2，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Asc I位点的nos终止子片段，上游引物P15` AGGCGCGCCGATCGTTCAAACATTTGGCA 3`下游引物P25` GGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC 3`PCR扩增产物连入pMD19 T simple vector中，测序验证；设计引物P3，与下游引物P2，以含Asc I位点的nos终止子片段为模板，扩增得到含Sac I和Asc I两个酶切位点的nos片段，上游引物P35` CGAGCTCGGCGCGCCGATCGTTCA 3`PCR扩增产物连入pMD19 T simple vector中，测序验证，得PMD nos；质粒pMD nos和质粒pBI121分别EcoR I/Sac I双酶切，回收pMD nos中的小段和pBI121的大片段后连接，得到中间载体pBI121 nos；2)pBI121的GUS序列的改造设计引物P4、P5，以pBI121质粒为模板，扩增得到含Pac I位点的GUS片段，上游引物P45` CCTTAATTAAATGTTACGTCCTGTAGAA 3`下游引物P55` CGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTGC 3`PCR扩增后，连入pMD19 T simple vector中，测序验证；设计引物P6，与上游引物P4，以含Pac I位点的GUS片段为模板，扩增得到上游含Xba I和Pac I两个酶切位点的GUS片段，上游引物P65` CTCTAGATTAATTAAATGTTACGTCCTGT 3`PCR扩增产物连入pMD 19 T simple vector中，测序验证，得pMD GUS；质粒pMD GUS和质粒pBI121 nos分别Sac I/XbaI双酶切，回收pMD GUS中的小片段和pBI121 nos中的大片段后连接，得到载体pBI121 nos GUS；3)质粒pBI121 nos GUS和质粒pCAMBIA3301分别EcoR I/Hind III双酶切，回收pBI121 nos GUS的小片段和pCAMBIA3301的大片段连接，得到载体pGSB；4)将CHAS内含子序列连入载体pGSB选用‘南农32’作为材料，取幼嫩叶片，按照TaKaRa公司提供的基因组DNA提取试剂盒说明书要求，提取大豆叶片基因组DNA；设计引物F1、F2，以基因组DNA为模板，获得含酶切位点的CHAS片段，上游引物F15` CCTTAATTAA GTGTAAGAATTTCTTATGTTACA 3`下游引物F25` CGAGCTCACCTGCAAATTGACCAA 3`PCR扩增产物连入pMD19 T simple vector中，测序验证，得pMD CHAS；质粒pMD CHAS和质粒pGSB分别Sac I/Pac I双酶切，回收pMD CHAS的小片段和pGSB的大片段，连接得到载体pGSBI；5)Gly m Bd 28K干扰片段的获得选用‘南农32’作为材料，取幼嫩荚果，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2μg总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。根据NCBI上公布的GenBankAB046874.1大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 28K的序列信息设计特异引物，进行常规聚合酶链式PCR反应，分别扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列SEQ IDNO.13和反义序列SEQ ID NO.14，扩增Gly m Bd 28K干扰片段的正义序列引物上游引物R15` CGAGCTCAACCAAAGTCCTTGTTTGTT 3`下游引物R25` TTGGCGCGCCCATCATTTTCTTCAGCTGT 3`扩增Gly m Bd 28K干扰片段的反义序列引物上游引物R35` GCTCTAGACATCATTTTCTTCAGCTGTTG 3`下游引物R45` CCTTAATTAAAACCAAAGTCCTTGTTTGTT 3`PCR扩增产物分别连入PMD19 T simple vector中，测序验证，得pMD 28S和pMD 28A；6)Gly m Bd 28K RNAi植物载体的构建pMD 28A与pGSBI分别Pac I/XbaI双酶切，回收pMD 28A的小片段与pGSBI的大片段连接，得到含反义片段的载体pGSBI 28A；pMD 28S与pGSBI 28A进行Sac I/Asc I双酶切，回收pMD 28S的小片段与pGSBI 28SA的大片段连接，得同时含Gly m Bd 28K正义和反义片段的RNAi植物表达载体pYZ，Xba I/Asc I双酶切验证，构建成功。
2.权利要求1所述过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体pYZ的应用。
全文摘要
本发明涉及大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。分别改造植物载体pBI121和pCAMBIA3301，并连接得到新载体pGSB。PCR扩增CHAS内含子片段，并用其替换载体pGSB中GUS序列，分别设计引物扩增Gly mBd 28K正义和反义干扰片段，并将其分别引入载体pGSBI，得到Gly m Bd 28K的RNAi植物表达载体pYZ。Gly m Bd 28K是大豆主要过敏蛋白质之一，该RNAi植物表达载体转化大豆将会对过敏蛋白质基因进行基因沉默，为确保过敏人群食用大豆安全奠定坚实基础。对提高我国大豆分子育种的技术水平具有重要理论和实践意义。
文档编号C12N15/113GK101906432SQ20101022477
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者刘思辰, 朱月林, 杨立飞, 盖钧镒 申请人:南京农业大学