专利名称：猪圆环病毒Ⅱ型毒种的制备和保存方法
技术领域：
本发明属于兽医生物技术领域，涉及一种猪圆环病毒Ii型毒种的制备和保存方 法。
背景技术：
猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是圆环病毒(PCV)两种基因型中的一种，小颗粒、无包膜、环状单股DNA病毒，属环状病毒科，临床感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。近年来，人们一直在致力于PCV2引起的PMWS的疫苗、诊断试剂和治疗方法的开发应用研究，但这些研究的前提是获取足量的PCV2病毒。现今生产中多采用如下方法制备和保存毒种猪圆环病毒II型(PCV2)毒种接种37°C培养24-48h形成单层的PK15细胞，加入含体积比1-5%新生牛血清的MEM营养液，于37°C培养72-96h，冻融裂解细胞，使之释放病毒，收获细胞培养物，用IFA方法检验，于-80°C冰箱中保存。该制备方法和保存方式存在一些缺陷，主要表现(1)病毒滴度较低PCV2在细胞中的生长滴度较低，病毒含量都低于IO5 tlTCID5ci/ mL，一般仅为103_°TCID5(l/mL左右，病毒的含量不能满足疫苗和诊断抗原等的制备，而病毒的含量是PCV2制剂大规模制备应用的关键。因此，高质量的毒种成为PCV2生产中急待解决的棘手问题；(2)生产工艺繁琐当前所使用的毒种制备方法，需要重复的接种、冻融收获，工艺很繁琐；(3)增加成本由于工艺很繁琐，涉及更多的设备及物耗，造成成本的增加。
发明内容
针对当前猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2，PCV2)毒种的制备和保存方面存在的不足，本发明提供一种病毒滴度高、免疫原性好、工艺简洁、经济实用的猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2)毒种的制备和保存方法。本发明的方法能持续稳定产出高滴度的PCV2，病毒的滴度可达到106_ °6_ 5TCID5ciAil，显著高于现有技术水平。本发明方法得到的病毒滴度稳定，简化了病毒浓缩等工艺，减少设备购置，可有效降低成本， 利于PCV2疫苗等制剂的生产和相关诊断试剂的制备。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2)毒种的制备和保存方法，其特征在于步骤如下(1)接种用细胞的制备PK15(猪肾细胞系)细胞按常规条件培养24小时后，80-90%细胞融合时作为接种用细胞；(2)病毒的接种培养取接种用细胞，弃去生长培养基，以毒种接种用细胞为1-10% (ν/ν)或病毒滴度为103_°-106_°TCID5(1/mL的比例接入猪圆环病毒II型毒种，37°C吸附1小时后加入维持液进行培养；24小时后用300mM的D-氨基葡萄糖于37°C处理20分钟，经无菌pH7. 4的PBS两次洗涤后加入维持液进行培养； (3)传代取培养后的细胞，弃去维持液，经无菌pH7. 4的PBS两次洗涤后，加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6X 106/mL，定量分装细胞瓶中，37°C培养48-96小时；(4)连续传代重复步骤(3)，传代3-6次，得含毒种PK15细胞；(5)保存含毒种PK15细胞置于液氮内进行保存。其中，上述步骤(1)至(4)为本发明猪圆环病毒II型毒种的制备方法；步骤(5) 为本发明猪圆环病毒II型毒种的保存方法。进一步，本发明的猪圆环病毒II型毒种的制备和保存方法，在步骤(2)病毒的接种培养中，以毒种接种用细胞为5% (ν/ν)的比例接入猪圆环病毒II型毒种。进一步，本发明的猪圆环病毒II型毒种的制备和保存方法，传代培养72h，连续传代5次。其中，保存中取含毒种PK15细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液，将细胞分散成3-6 X IO7-VmL,定量分装种毒保存瓶中，放入液氮中保存。本发明的猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2)毒种的制备和保存方法适用于猪圆环病毒II型各毒株，但本发明的发明及实施过程中，申请人用的为保藏号为CGMCC No 3064的猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2)(见申请人的申请号为200910084906. 5的发明专利申请)，所用的毒株由福州大北农生物技术有限公司分离和鉴定，为当前中国流行毒株。该毒株已于2009年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 3064，分类命名为猪圆环病毒 II 型 Porcinecircovirus type 2。本发明方法制备和保存的猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2)工艺简洁、经济实用、能持续稳定产出高滴度的PCV2，病毒的滴度可达到106_°6_5TCID5(l/ml，显著高于现有技术水平。本发明方法得到的病毒滴度稳定、免疫原性好，简化了病毒浓缩等工艺，减少设备购置，可有效降低成本，利于PCV2疫苗等制剂的生产和相关诊断试剂的制备。
具体实施例方式实施例1猪圆环病毒II型毒种的制备及其保存(1)接种用细胞的制备PK15细胞按常规条件培养24h后80_90%细胞融合时作为接种用细胞；(2)病毒的接种培养取接种用细胞，弃去生长培养基，以5% (ν/ν)的比例接入猪圆环病毒II型毒种， 37°C吸附Ih后加入维持液进行培养。24h后用300mM的D-氨基葡萄糖于37°C处理20min， 经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入维持液于37°C培养72h。(3)传代
取培养7 的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6X 106/mL，定量分装细胞瓶中，37°C培养72h。重复以上传代步骤5次。(4)种毒的保存取传代5次的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6X107_7ml，定量分装种毒保存瓶中，放入液氮中保存。(5)病毒含量测定取病毒液用无血清培养基做10倍系列稀释，选取10-5、10-6、10_73个稀释度，分别接种96孔细胞板，每个稀释度接种5孔，37°C吸附Ih后加入维持液进行培养。24h后用 300mM的D-氨基葡萄糖于37°C处理20min，经无菌PBS(pH7. 4)两次洗涤后加入维持液培养 48h，同时设不接种病毒的细胞为空白对照。运用间接免疫荧光法(IFA)测定每个稀释度含有荧光的孔数，最后按Reed-Muench计算TCID5(1。每毫升病毒含量为106 5TCID5。。实施例2猪圆环病毒II型毒种的制备及其保存(1)接种用细胞的制备PK15细胞按常规条件培养24h后80-90%细胞融合时作为接种用细胞；(2)病毒的接种培养取接种用细胞，弃去生长培养基，以10% (ν/ν)的比例接入猪圆环病毒II型毒种， 37°C吸附Ih后加入维持液进行培养。24h后用300mM的D-氨基葡萄糖于37°C处理20min， 经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入维持液于37°C培养48h。(3)传代取培养7 的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6X 106/mL，定量分装细胞瓶中，37°C培养48h。重复以上传代步骤5次。(4)种毒的保存取传代5次的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6 X IO7-Vml，定量分装种毒保存瓶中，放入液氮中保存。(5)病毒含量测定，同实施例1每毫升病毒含量为106_°TCID50。实施例3猪圆环病毒II型毒种的制备及其保存(1)接种用细胞的制备PK15细胞按常规条件培养24h后80-90%细胞融合时作为接种用细胞；(2)病毒的接种培养取接种用细胞，弃去生长培养基，以(ν/ν)的比例接入猪圆环病毒II型毒种， 37°C吸附Ih后加入维持液进行培养。24h后用300mM的D-氨基葡萄糖于37°C处理20min， 经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入维持液于37°C培养72h。(3)传代取培养7 的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6X106/mL，定量分装细胞瓶中，37°C培养72h。重复以上传代步骤6次。(4)种毒的保存取传代5次的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液，将细胞分散成3-6 X IO7-Vml，定量分装种毒保存瓶中，放入液氮中保存。
(5)病毒含量测定，同实施例1每毫升病毒含量为106_°TCID50。实施例4猪圆环病毒II型毒种的制备及其保存(1)接种用细胞的制备PK15细胞按常规条件培养24h后80_90%细胞融合时作为接种用细胞；(2)病毒的接种培养取接种用细胞，弃去生长培养基，以 % (ν/ν)的比例接入猪圆环病毒II型毒种， 37°C吸附Ih后加入维持液进行培养。24h后用300mM的D-氨基葡萄糖于37°C处理20min， 经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入维持液于37°C培养72h。(3)传代取培养72h的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6X 106/mL，定量分装细胞瓶中，37°C培养72h。重复以上传代步骤3次。(4)种毒的保存取传代5次的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6 X IO7-Vml，定量分装种毒保存瓶中，放入液氮中保存。(5)病毒含量测定，同实施例1每毫升病毒含量为106_°TCID50。实施例5猪圆环病毒II型毒种的制备及其保存(1)接种用细胞的制备PK15细胞按常规条件培养24h后80_90%细胞融合时作为接种用细胞；(2)病毒的接种培养取接种用细胞，弃去生长培养基，以5% (ν/ν)的比例接入猪圆环病毒II型毒种， 37°C吸附Ih后加入维持液进行培养。24h后用300mM的D-氨基葡萄糖于37°C处理20min， 经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入维持液于37°C培养96h。(3)传代取培养72h的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6X 106/mL，定量分装细胞瓶中，37°C培养96h。重复以上传代步骤4次。(4)种毒的保存取传代5次的细胞，弃去维持液，经无菌PBS (pH7. 4)两次洗涤后加入细胞分散液， 将细胞分散成3-6 X IO7-Vml，定量分装种毒保存瓶中，放入液氮中保存。(5)病毒含量测定，同实施例1每毫升病毒含量为IO6 3TCID50t5实施例6猪圆环病毒II型毒种的制备及保存方法与现有技术方法的对比
权利要求
1.一种猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type幻毒种的制备和保存方法，其特征在于步骤如下(1)接种用细胞的制备PK15细胞按常规条件培养M小时后，80-90%细胞融合时作为接种用细胞；(2)病毒的接种培养取接种用细胞，弃去生长培养基，以毒种接种用细胞为1-10% (ν/ν)或病毒滴度为 IO3 0-IO6-°TCID50/mL的比例接入猪圆环病毒II型毒种，37°C吸附1小时后加入维持液进行培养；对小时后用300mM的D-氨基葡萄糖于37°C处理20分钟，经无菌pH7. 4的PBS两次洗涤后加入维持液进行培养；(3)传代取培养后的细胞，弃去维持液，经无菌PH7. 4的PBS两次洗涤后，加入细胞分散液，将细胞分散成3-6X 106/mL，定量分装细胞瓶中，37°C培养48-96小时；(4)连续传代重复步骤( ，传代3-6次，得含毒种H(15细胞；(5)保存含毒种H(15细胞置于液氮内进行保存。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒II型(Porcinecircovirus type 2)毒种的制备和保存方法，其特征在于病毒的接种培养中，以毒种接种用细胞为5% (ν/ν)的比例接入猪圆环病毒II型毒种。
3.如权利要求1所述的猪圆环病毒II型(Porcinecircovirus type 2)毒种的制备和保存方法，其特征在于传代培养72h，连续传代5次。
全文摘要
本发明属于兽医生物技术领域，涉及一种猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)毒种的制备及其保存方法。本发明包括如下步骤(1)接种用细胞的制备；(2)病毒的接种培养；(3)传代；(4)连续传代；(5)保存。本发明方法毒种制备工艺简单、稳定、易操作，批间差异小和质量易控。同时，本发明通过保存方式的改进，可获得高滴度病毒，提高毒种的质量，利于PCV2疫苗等制剂的生产和相关诊断试剂的制备。
文档编号C12N7/00GK102154221SQ20111000141
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者刘长辉, 王忠山, 王贵华, 赵亚荣 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司