专利名称：一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及菌种及其培养方法与应用，具体涉及一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用。
背景技术：
石油是关系国民经济命脉的战略性资源，经过经过一次、二次两次常规采油之后的总采收率一般只能占地下原油的30% 40%。三次采油(EOR)技术是一项能够利用物理、 化学和生物等技术提高原油采收率的重要油田开发技术。在过去数十年内，美国、加拿大和委内瑞拉等石油大国都把如何提高原油采收率作为研究工作的重点目标。随着社会经济持续快速增长，我国对油气需求量也不断增加。因此，运用三次采油技术来原油提高采收率， 是减缓我国多数油田产量递减速度、维持原油稳产的战略需要。石油: 降解菌(hydrocarbon degradation bacteria, HDB)是能将石油: 作为唯一碳源进行生物降解，并产生气体、脂肪酸及生物表面活性剂等代谢产物的一类微生物的总称，可以代谢产生鼠李糖脂等生物活性物质，起到剥离原油，提高采收率的功效。
发明内容
本发明的目的是提供一株能显著降低接触角、提高洗油效率、降低含水、增加产油量的铜绿假单胞菌及其培养方法与应用。本发明所采用的技术方案是
一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287o一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287 的培养方法，是将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287接种至专用液体培养基中，在35_37°C的温度条件下恒温通气培养；
专用液体培养基的配方为每100ml水中含酵母提取物0. 5g、蛋白胨0. 5g、葡萄糖 1. 5g、NaCl 0. 5g, ρΗ6· 8 8· 0。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC N0.M201U87 的接种比例为5 10% ；
培养过程的溶解氧为5 7mg/L ； 培养周期为48 72小时。所述的一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287在低渗透性油田三次开发中提高采收率中的应用。所述的一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287在制备提高原油采收率生物制剂中的应用。本发明具有以下优点
本发明提供的铜绿假单胞菌，可应用于低渗透性油田的三次开发，可以显著降低接触角，48小时脱油效率可达40%左右；该菌可以有效驱替出岩心内部饱和原油，使岩心驱替效
3率增加10%左右；并具有岩心渗透率微生物解堵恢复作用，渗透恢复率可达90%以上；提高洗油效率，降低含水，增加产油量，提高原油采收率；借此开发的生物制剂，用于污染治理与环保清洁，具有较高的研究、应用及市场价值；此外，该菌培养方法简单易操作，生长繁殖迅速，具有扩大化生产的可行性。
图1为铜绿假单胞菌CAWP10-15-2的生长曲线。图2为铜绿假单胞菌CAWP10-15-2电镜照片。图3为铜绿假单胞菌CAWP10-15-2附着在岩芯表面的照片。图4为铜绿假单胞菌CAWP10-15-2深入岩芯孔的照片。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行详细的说明。本发明所涉及的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2，已与 2011年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. M2011287o以下实施例用于说明本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。以下实施例中所涉及的培养基为
X 富集用液体培养基=NaNO3 1. 5g，(NH4) 2S04 1. 5g，K2HPO4 lg，MgSO4 · 7H20 0. 5g，KCl 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 0. 002g，蒸馏水 1000ml，原油 5g, pH6. 8。:2分离培养基富集用液体培养基中添加m琼脂。I血平板培养基LB固体培养基中添加5%新鲜羊血。实施例一铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287的分离筛选与纯化
(一)石油降解菌株富集与分离
将5g油泥样品加入到100ml的培养基I中，35°C、150r/min摇床培养7d。待培养液
混浊后，吸取5ml培养液重新转接入新鲜培养基1.中，与上述培养条件相同连续转接富集培养3次。采用稀释平板法进行分离，将培养液系列稀释后，取100 μ 1稀释液涂布于培养基.1:中，培养48h ；待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，分别回接于培养基① 和②中，在两种培养基中均能生长的即为石油降解菌。(二)表面活性剂产生菌的筛选由于表面活性剂具有降低表面张力的作用，可使红细胞破裂并释放血红素出现溶血圈，因此采用血平板法筛选。挑取活化好的菌株一环，点接于培养基f上，35°C培养3d后若有溶血圈出现，证明该菌能产生表面活性剂。(三)纯化挑取单菌落，转移到培养基I中，35°C，120r/min振荡培养，至菌浓度
达到107-108CFU/ml，取100 μ 1涂布于LB固体培养基上，检测纯度，直至获得纯种铜绿假单胞菌CAWP 10-15-2菌株。实施例二铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287的培养方法
(一)培养基的配方优化
1、碳源优化考察了铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287对葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、酵母浸膏等几种碳源的利用情况， 具体方法为采取单因素分析试验，固定氮源成分为蛋白胨5g/L，改变碳源成分为葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、酵母浸膏等(均为15g/L)，接种铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M201U87，!35°C，120r/min 振荡培养 48h，测定 OD600， 确定细菌生长情况，试验结果显示，葡萄糖为适宜的碳源。2、氮源优化考察了铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)CAWP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287对蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、(NH4) 2S04几种氮源的利用情况， 具体方法为采取单因素分析试验，固定碳源成分为葡萄糖(15g/L)，改变氮源成分为蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、(NH4)2SO4 (含量均为5g/L)，接种铜绿假单胞菌菌株 (Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC Ν0· M2011287，35°C，120r/min 振荡培养 48h，测定0D·，确定细菌生长情况，试验结果显示，蛋白胨为适宜的氮源。3、发酵培养基组分的正交试验通过正交试验确定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287发酵培养基各组分的最佳添加量，被考察因子与水平数如下表1所示
表1发酵培养基组分察因子与水平数列表
权利要求
1.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CAWP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287o
2.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287 的培养方法，是将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287接种至专用液体培养基中，在35_37°C的温度条件下恒温通气培养；专用液体培养基的配方为每IOOml水中含酵母提取物0. 5g、蛋白胨0. 5g、葡萄糖 1. 5g、NaCl 0. 5g, ρΗ6· 8 8· 0。
3.根据权利要求2所述的一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287的培养方法，其特征在于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M201U87 的接种比例为5 10% ；培养过程的溶解氧为5 7mg/L ；培养周期为48 72小时。
4.权利要求1所述的一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287在低渗透性油田三次开发中提高采收率中的应用。
5.权利要求1所述的一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) CAffP 10-15-2 CCTCC NO. M2011287在制备提高原油采收率生物制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及涉及一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用。石油烃降解菌是能将石油烃作为唯一碳源进行生物降解，并产生气体、脂肪酸及生物表面活性剂等代谢产物的一类微生物的总称，可以代谢产生鼠李糖脂等生物活性物质，起到剥离原油，提高采收率的功效。本发明提供的铜绿假单胞菌在恒温通气条件下通过液体培养基培养，液体培养基配方为每100ml水中含有酵母提取物0.5g、蛋白胨0.5g、葡萄糖1.5g和氯化钠0.5g，pH6.8-8.0，可应用于低渗透性油田三次开发。本发明提供的菌种可提高采油脱油效率，菌培养方法简单易操作，生长繁殖迅速，具有扩大化生产的可行性。
文档编号C12R1/385GK102409016SQ201110419259
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者孙卫, 孙叶芳, 薛姝雯, 陈富林 申请人:西北大学, 西安瑞捷生物科技有限公司