专利名称：培养基中含腐植酸钠饲料用枯草芽孢杆菌生物制剂的生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物生物制剂，具体的说是一种培养基中含腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂的生产方法。
背景技术：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),是芽孢杆菌属的一种，单个细胞0.7 0.8X2 3微米，革兰氏阳性菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢大，椭圆到柱状，0.6
0.9X1.0 1.5微米，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙，污白色或微黄色，在液体培养时，常形成皱醭。枯草芽孢杆菌具有繁殖速度快、耐高温、耐酸碱、耐挤压、稳定性能好、应用范围广等特点，在现代分子遗传学的科研探索中常作为模式菌株，在现实的生产实践中广泛应用于食品工业、饲料工业、水产养殖、环境保护和保健医药等诸多方面；因此，愈来愈受到科技工作者和企业界人士的重视。枯草芽孢杆菌菌体及其分泌物中含有丰富的蛋白质、氨基酸、有机酸、维生素、不饱和脂肪酸、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和肽类抗生素等生物活性物质。因此，在畜禽养殖和水产养殖中均有较高的应用价值 。在以往研究中，科技工作者对枯草芽孢杆菌的分类学地位、生理生化特征、发酵条件及其调控等方面均有深入研究。近年来，对枯草芽孢杆菌应用研究也取得很大的进展。但对饲料用高浓度枯草芽孢杆菌发酵技术报道的并不多，对培养基含腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂的研制与生产未并见报道。本发明采用枯草芽孢杆菌菌株，经一级固体种子培养，液体二级种子发酵培养，采用含有腐植酸钠的固体培养基进行有氧发酵，再经调整培养条件出芽孢处理，干燥、粉碎，生产出培养基含腐植酸钠、饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂产品。此工艺设计和生产尚属国内和国际首创。腐植酸钠是大分子有机物质，主要是羟基、酚羟基、甲氧基、醌基等。综合各项报道，腐植酸应用在畜禽饲料中可对肠道炎性物和有毒物质进行吸附，对肠粘膜起保护作用；可抑制和杀灭肠道致病菌，提高饲料的利用率，并有止血止痛作用；可吸附粪便中的氨气、硫化氢，减轻粪便的臭味；腐植酸钠资源广泛、价格低廉、无药物残留，没有任何配伍禁忌，利于环保。但腐植酸的活性基团常被杂质所封闭，几乎不能发挥作用，通过发酵处理可以大大提高其生物学活性。将腐植酸钠作为芽孢菌制剂培养基使用，必将提升制剂生物效能。本发明产品功能是:1.利用芽孢菌产酶能力强的特点，提高饲料利用率；2.芽孢菌进入胃肠后，经过复苏增殖，可消耗肠道氧，有利于乳酸、双歧等厌氧益生菌发挥作用；
3.腐植酸钠经微生物发酵后，生物活性增强，对芽孢菌作用具有增效性；4.芽孢菌进入后肠后甚至排除体外后还能发挥作用，可显著改善养殖环境。培养基中含腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂产品无毒、无害、无任何副作用，是一种绿色的微生物制剂添加剂，具有广阔的市场前景。目如,在畜禽养殖和水广养殖中，提闻蛋白质利用率，减少抗生素使用是急需解决的问题。而本发明恰恰非常有助于解决上述两个问题或难题。产品已在广东、湖北、江苏、河北、山东、北京、沈阳、大连等地区广泛应用，取得了很好的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明目的在于提供一种培养基中含腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂的生产方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:以枯草芽孢杆菌为菌株，经一级固体种子培养，二级液体种子发酵，生产出枯草芽孢杆菌种子液。以葡萄糖、腐植酸钠、豆柏、玉米、麦麸等为主要培养基，将种子液接种于培养基上进行三级固体有氧发酵，之后调整培养条件进行出芽孢处理，再经干燥，粉碎，生产出含枯草芽孢杆菌(Cfu) ^ 200亿个/g，pH值
5.6 6.6，水分< 10%，粒度彡100目，色泽呈现特有的浅灰色或灰黑色、保质期18个月的生物制剂产品。一种培养基中含腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂的生产方法，包括如下步骤:I)单菌落种子纯化与优选:将枯草芽孢杆菌斜面菌种，在盛有细菌培养基的培养皿上涂布，经培养，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子；2) 一级固体种子培养:将步骤I)中得到的单菌落种子接种到200ml茄形瓶，经培养，得到一级固体种子；3)液体发酵培养二级种子:将步骤2)中得到的茄形瓶种子接种到发酵罐液体培养基中，一个茄形瓶与液体培养基的接种比例为I瓶:200公斤。经培养得到二级液体种子。得到的发酵液体种子标准为:颜色正常，无异味，芽孢占总菌数20%以上，pH 6.0
6.5,菌体大小为0.7 0.8 X 2 3 μ m,芽抱0.6 0.9 X 1.0 1.5 μ m,含枯草芽抱杆菌(cfu) > 200 亿个/ml。4)三级固体发酵料有氧发酵:将步骤3)中得到的二级液体种子接种到固体发酵料中，经通风供氧，发酵培养，得到经培养的固体发酵料。5)出芽孢处理:将步骤4)中得到的固体发酵料进行出芽胞处理，即停止通风供氧，将其摊开、翻倒，降低温度和湿度，促使固体发酵料中含有的枯草芽孢杆菌形成芽孢。6)干燥与粉碎处理:对步骤5)得到的形成了芽胞的固体发酵料进行烘干处理，通过粉碎，生产出含枯草芽孢杆菌(cfu) > 200亿个/g的含发酵腐植酸钠的饲料用高浓度枯早牙抱杆囷生物制剂广品。上述枯草芽孢杆菌培养过程中，步骤I)和2)所采用的枯草芽孢杆菌固体种子培养基的重量组成为:葡萄糖0.8 1.2%、蛋白胨0.8 1.2%、牛肉膏0.3 0.6%、氯化钠
0.03 0.07%、硫酸镁0.03 0.07%、磷酸氢二钾0.05 0.15%、余量为纯净水、pH6.8
7.2、琼脂 1.5 2.2% ;灭菌条件:0.08MPa、115°C、18min ； 培养温度:28 °C 32 °C，时间为48 72h。上述枯草芽孢杆菌培养过程中，步骤3)所采用的枯草芽孢杆菌种子发酵培养基的重量组成为:葡萄糖0.5 1.5 %、蛋白胨0.2 0.8 %、酵母粉0.2 0.8 %、玉米面
1.0 3.0%、豆柏1.0 3.0%、硫酸铵0.1 0.3%、氯化钠0.03 0.07%、硫酸镁0.03 0.07%、磷酸氢二钾0.05 0.15%、余量为纯净水、pH6.8 7.2 ;灭菌条件:0.lMPa、121°C、20min ;发酵培养条件:罐压0.01 0.1OMpa,通气量0.5 1.0V/V.min、转速100-200rpm、温度 28。。 34°C、时间为 48 72h ；上述步骤4)所述固体发酵料有氧发酵过程中，固体发酵料中各种原料重量比例为:葡萄糖I 3份、腐植酸钠10 40份、豆柏10 20份、玉米面10 20份、麸皮50 70份；液体二级种子与固体发酵料混合的重量比例分别为:①30: 100、②40: 100、③50: 100;发酵培养条件:通气量0.5 1.0V/V*min、发酵温度50°C 60°C、发酵时间48 64h。步骤5)所述出芽孢处理中:需对经培养的固体发酵料，停止通风供氧，将其摊开、翻倒。出芽孢处理条件:温度20°C 30°C、含水量20 30%、时间24 48h ；步骤6)将步骤5)所述含有芽胞的固体发酵料进行干燥处理与粉碎，干燥处理条件为:采用干燥炉进行干燥，干燥炉内温度60°C 80°C、干燥炉出口温度38°C 42°C、时间8 IOmin ；
粉碎处理条件为:在无菌洁净条件下进行，粉碎后粒度80 120目、含水量8 15%、含枯草芽孢杆菌(cfu) 200 220亿个/g。较佳方案如下: 所采用的枯草芽孢杆菌种子培养基的重量组成为:葡萄糖1.0 %、蛋白胨1.0 %、牛肉膏0.5.%、氯化钠0.05%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.1 %、余量为纯净水、pH7.0、琼月旨2.0%。灭菌条件:0.08MPa> 115°C > 18min ；培养温度:30°C，时间为48h。所采用的枯草芽孢杆菌二级种子发酵培养基的重量组成为:葡萄糖1.0%、蛋白胨0.5 %、酵母粉0.5%、玉米面2.0 %、豆柏2.0 %、硫酸铵0.2kg %、氯化钠0.05 %、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.10%、余量为纯净水、pH7.0。灭菌条件:0.1MPa、121°C、20min ;发酵培养条件:罐压0.05Mpa、通气量0.5V/V.min、转速lOOrpm、培养温度30°C、时间为48h。所采用的固体发酵料有氧发酵过程中，固体发酵料中各种原料重量比例为:葡萄糖2份、腐植酸钠30份、豆柏10份、玉米面10、麸皮50份；液体种子与固体发酵料混合的重量比例40: 100。发酵培养条件为:通气量0.5V/V.min、发酵温度50°C、发酵时间48。所采用的固体发酵料出芽孢处理中，需对经培养的固体发酵料停止通风供氧，将其摊开、翻倒。出芽孢处理条件为:温度20°C、含水量20、时间48h ；所述含有芽胞的固体发酵料进行干燥处理与粉碎中，采用干燥炉进行干燥，干燥处理条件为:干燥炉内温度60°C、干燥炉出口温度:38°C、时间Smin ；粉碎处理条件为:在无菌洁净条件下进行，粉碎后粒度100目、含水量10%、含枯草芽孢杆菌(cfu) 200亿个/g。
用平板计数法检查，培养基中含发酵腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂产品，含枯草芽孢杆菌(cfu) ^ 200亿个/g。所述的培养基中含腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂产品，可作为水产、畜禽养殖中的优质生物饵料添加剂，也可作为海水、淡水的水质净化剂应用。本发明具有如下优点:本发明具有菌种选择适当、工艺新、菌数高、产物多、适应性广、效果可靠、有益于环境等突出的特点。1.菌种选择适当、繁殖速度快、产物多。枯草芽孢杆菌株来源非常广泛，在陆地和海洋均广泛存在，并具有自身突出的特点，I)繁殖速度快:枯草芽孢杆菌的生长代时为18分钟，在发酵过程中2个小时就能达到对数生长期，24小时就能到菌数繁殖高峰，48小时发酵达到终点，调整好碳 氮比例，菌数(cfu)可达200亿个/ml以上。2)营养丰富，能分泌和代谢大量的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等酶类产物，富含各种氨基酸、有机酸和抗菌肽。3)抗逆性强:耐高温，变成芽孢后，可以长时间耐受60°C以上的高温，忍耐80度20分钟，甚至是瞬间100°C高温，仍可存活率90%以上。耐酸碱，可适应pH 2 9的酸碱范围。在一般词料生广挤压颗粒过程中，存活率保持在90%以上。4)稳定性能好，耐长期储存，在各种应用现场条件下，存活不受太大影响。在室温、密封、避光条件下，可以保质18个月以上。2.工艺新、产品质量好。本发明以枯草芽孢杆菌为生产菌株,经一级固体种子培养，二级液体种子发酵，三级固体发酵料有氧发酵，再经调整培养条件出芽孢处理，干燥、粉碎，生产出培养基中含腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂产品，生产工艺尚属国内和国际首创。通过本项目涉及的技术措施可保证生产出培养基中含发酵腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂，并使产品的芽孢数(cfu)达到200亿个/g以上。本发明所采用的生产原材料组成简单、来源广泛，价格低廉，而且采用腐植酸钠为培养基组分，具有特殊外观特征并可强化功效。3.适应性广、应用效果可靠。本发明生产的产品可应用于全价料、浓缩料、预混料等各类饲料生产，也可在养殖场直接添加饲喂，在水产养殖和畜禽养殖中应用广泛。大量的生产实践证明:在海参养殖中应用，可以增强免疫力和抗病力，降低水体中氨氮含量，净化水质，延长附着基换倒时间5 7天，提高海参产量10.9%。在蛋禽养殖中应用，可以增强幼禽免疫力，降低死淘率1.8%，提高产蛋率2.02%。在仔猪和育肥猪养殖中应用，可以防治仔猪黄白痢，提高育肥猪增重速度，减少抗生素使用量。4.改善养殖环境、有益于生态。枯草芽孢杆菌能够广泛利用碳源和氮源，在海参的养殖中，能利用水体小分子含氮化合物、剩余的含氮饵料和海参粪便等，可促进养殖池底有机物含氮化合物的降解，可使水产养殖池水体中的氨氮、硫化氢下降，使C0D、B0D值和pH值等项指标达到正常，净化水质，提高溶解氧，改善养殖环境，提高海参产量。在畜禽养殖中应用，能减轻养殖环境中粪便的氨气味，可以明显改善养殖环境，有益于生态。5.培养基中含发酵腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂产品,营养成份全、无毒副作用，安全性好。在饲料中使用，可增强免疫力，提高成活率，促进生长发育，提升畜禽水产品品质。
具体实施方式
对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)单菌落进行纯化、并经固体一级种子培养、液体二级发酵培养、三级固体发酵料有氧发酵培养、出芽孢处理，干燥与粉碎等过程，可生产出含培养基中含发酵腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂产品。具体操作步骤如下:实施例1:I)单菌落纯化与优选:将枯草芽孢杆菌斜面菌株，在盛有细菌培养基的培养皿上涂布，经培养，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子。2) 一级固体种子培养:将步骤I)中得到的单菌落种子，挑出单菌落接种到一级固体种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形瓶，装量为50ml固体培养基，经培养，得到一级固体种子；3)单菌落纯化与一级固体种子培养基的优选在实验室条件下，进行培养因子的优选试验，试验设计为6因素3水平，试验设计和试验结果如下表1:表1.枯草芽孢杆 菌一级固体种子培养基配方试验
权利要求
1.一种培养基中含腐植酸钠饲料用枯草芽孢杆菌生物制剂的生产方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)单菌落种子纯化与优选:将枯草芽孢杆菌斜面菌种，在装有细菌培养基的培养皿上涂布，经培养，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子； 2)一级固体种子培养:将步骤I)中得到的单菌落种子，挑出单菌落接种到一级固体种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形瓶，装量为固体培养基50ml，经培养，得到一级固体种子； 3)二级液体种子发酵培养:将步骤2)中得到的一级固体种子(茄形瓶菌种)接种到二级发酵罐液体培养基中，一级固体种子与二级发酵罐液体种子培养液的接种量为:一级固体种子与I吨发酵罐(装液量70% )接种比例为I瓶:200公斤，经培养，得到二级液体种子； 4)三级固体发酵料有氧发酵:将步骤3)中得到的二级液体种子接种到固体发酵料中，二级液体种子与固体发酵料混合的重量比例为40: 100;经通风供氧，发酵培养，得到经培养的固体发酵料； 5)出芽孢处理:将步骤4)中得到的固体发酵料进行出芽胞处理，即对经培养的固体发酵料，停止通风供氧，将其 摊开、翻倒，温度降低到20°C 30°C，含水量降低到20% 30%，促使固体发酵料中含有的枯草芽孢杆菌形成芽孢； 6)干燥与粉碎处理:将步骤5)中得到的含有芽胞的固体发酵料进行干燥处理，经干燥炉烘干，微粉机粉碎，生产出培养基中含腐植酸钠的枯草芽孢杆菌(cfu) > 200亿个/g的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂产品。
2.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于:步骤I)和2)所采用的枯草芽孢杆菌固体种子培养基的重量组成为:葡萄糖0.8 1.2%、蛋白胨0.8 1.2%、牛肉膏0.3 0.6%、氯化钠0.03 0.07%、硫酸镁0.03 0.07%、磷酸氢二钾0.05 0.15%、余量为纯净水、pH6.6 7.2、琼脂1.5 2.2% ; 培养基灭菌条件:0.08MPa、115°C、18min ； 培养温度:28°C 32°C，时间为48 72h。
3.按照权利要求2所述培养方法，其特征在于:所采用的枯草芽孢杆菌固体种子培养基的重量组成为:葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5.%、氯化钠0.05%、硫酸镁0.05 %、磷酸氢二钾0.1 %、余量为纯净水、PH7.0、琼脂2.0% ; 培养基灭菌条件:0.08MPa、115°C、18min ； 培养温度:30°C，时间为48h。
4.按照权利要求1所述培养方法，其特征在于:步骤3)所采用的枯草芽孢杆菌种子发酵培养基的重量组成为:葡萄糖0.5 1.5%、蛋白胨0.2 0.8%、酵母粉0.2 0.8%、玉米面LO 3.0%、豆柏1.0 3.0%、硫酸铵0.1 0.3%、氯化钠0.03 0.07%、硫酸镁0.03 0.07%、磷酸氢二钾0.05 0.15%、余量为纯净水、pH6.6 7.2 ; 灭菌条件:0.lMPa、121°C、20min ； 发酵培养条件:罐压0.01 0.lOMpa、通气量0.5 1.0V/V.π η、转速100 200rpm、温度28°C 34°C、时间为48 72h。
5.按照权利要求4所述培养方法，其特征在于:所采用的枯草芽孢杆菌种子发酵培养基的重量组成为:葡萄糖1.0%、蛋白胨0.5 %、酵母粉0.5%、玉米面2.0 %、豆柏2.0 %、硫酸铵0.2kg%、氯化钠0.05%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.10%、余量为纯净水、pH7.0 ； 灭菌条件:0.lMPa、121°C、20min ； 发酵培养条件:罐压0.05Mpa、通气量0.5V/V.min、转速lOOrpm、培养温度30°C、时间为 48h ； 得到的发酵液体二级种子标准为:颜色正常，无异味，芽孢占总菌数20%以上，pH在6.0 6.5，菌体大小为0.7 0.8X2 3 μ m，芽孢0.6 0.9X1.0 1.5 μ m，含枯草芽孢杆菌(cfu) > 200亿个/ml。
6.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于:所述固体发酵料有氧发酵过程中，固体发酵料中各种原料重量比例为:葡萄糖I 3份、腐植酸钠10 40份、豆柏10 20份、玉米面10 20份、麸皮50 70份； 固体发酵料培养条件:通气量0.5 1.0V/V.min、发酵温度50°C 60°C、发酵时间48 64h。
7.按照权利要求6所述的培养方法，其特征在于:所述固体发酵料有氧发酵过程中，固体发酵料中各种原料重量比例为:葡萄糖2份、腐植酸钠30份、豆柏10份、玉米面10、麸皮50份； 固体发酵料培养条件:通气量0.5V/V.min、发酵温度50°C、发酵时间48。
8.按照权利要求6所述的培养方法，其特征在于:步骤5)所述出芽孢处理中:需对经培养的固体发酵料，停止通风供氧，将其摊开、翻倒；出芽孢处理条件为 温度20°C 30°C、含水量20 30%、时间24 48h ； 步骤6)将步骤5)所述含有芽胞的固体发酵料进行干燥处理与粉碎，干燥处理条件为:采用干燥炉进行干燥，干燥炉内温度60°C 80°C、干燥炉出口温度38°C 42°C、时间8 IOmin ； 粉碎处理条件为:在无菌洁净条件下进行，粉碎后粒度80 120目、含枯草芽孢杆菌(cfu) 200 220亿个/g、含水量8 15%。
9.按照权利要求8所述的培养方法，其特征在于:所述出芽孢处理中:需对经培养的固体发酵料，停止通风供氧，将其摊开、翻倒；出芽孢处理条件为:温度20°C、含水量20、时间48h ； 所述含有芽胞的固体发酵料进行干燥处理与粉碎，干燥处理条件为:采用干燥炉进行干燥，干燥炉内温度60°C、干燥炉出口温度38°C、时间8min ； 粉碎处理条件为:在无菌洁净条件下进行，粉碎后粒度100目、含水量10%、含枯草芽孢杆菌(cfu) 200亿个/g。
全文摘要
本发明涉及微生物生物制剂，具体的说是一种培养基中含腐植酸钠的饲料用高浓度枯草芽孢杆菌生物制剂的生产方法。枯草芽孢杆菌菌株经一级固体种子培养，二级液体种子发酵培养，得菌种液。菌种液接种于葡萄糖、腐植酸钠、豆粕、玉米、麦麸等为主要原料的培养基中进行三级固体有氧发酵，经调整培养条件出芽孢处理，干燥，粉碎，生产出枯草芽孢杆菌生物制剂。制剂含枯草芽孢菌(cfu)≥200亿个/g，pH值5.6～6.6，水分≤10％，粒度≥100目，色泽呈现特有的浅灰色或灰黑色、保质期18个月。本制剂在水产、畜禽养殖中作为添加剂应用，可以提高生产性能，改善养殖环境。
文档编号C12N1/20GK103184174SQ20111045574
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者潘军, 薛德林, 宋颖, 张伟强 申请人:沈阳博善英胜生物技术有限公司