专利名称：多血清型口蹄疫病毒3C基因特异性siRNA筛选与应用的制作方法
技术领域：
本发明属ロ蹄疫生物防治技术领域，具体涉及针对多血清型(O型、A型和Asia I型)ロ蹄疫病毒3C基因保守区分析，及可靶向特异性抑制三种血清型ロ蹄疫病毒3C基因表达的siRNA筛选及验证。
背景技术：
ロ蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由 ロ 蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus, FMDV)引起的一种致偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病，国际兽医局(OIE)将其列为A类传染病之首，该病宿主广泛，其中对猪、牛等家养偶蹄动物危害最为严重。FMD在世界范围内多次发生大流行，屡次重创世界畜牧经济，因此素有“政治经济病”之称。世界各国在预FMD流行中投入了大量人力、物力，建立了包括动物捕杀，疫苗接种及流 行病学监测等预防手段在内一套严密的防控体系，但目前仍无法有效控制FMD的发生与流行，其根本原因在于FMDV血清型、血清亚型众多(七种血清型及65种以上的血清亚型)，各血清型/亚型间交叉免疫原性差，无法提供有效的保护力。另外FMDV属于小RNA病毒，其基因组突变率高，病毒流行株更迭迅速，可快速摆脱疫苗株抗体的抑制。因此研制出具有广谱、高效抗FMDV作用的新型抗病毒制剂，以扭转FMD防控的不利局面具有重要的理论意义与实际价值。上世纪末发现的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术通过特异性地与目标基因mRNA形成ニ聚体，可加速成熟mRNA的降解，有效抑制目标基因的翻译，导致目标基因的表达沉默，从而抑制目标基因功能。目前RNA干扰技术已经发展成为高效、特异性阻断细胞内目标基因表达来研究基因功能的有效工具。采用RNAi技术在治疗癌症及烈性病毒性传染病，诸如HBV、HCV、HIV、SARS和流感等方面的研究成果丰硕，且效果明显。RNAi技术有望生产出有效治疗疾病的特异性药物，应用前景光明。应用RNAi技术用于抑制FMDV复制增殖等研究亦有相关报道，均能取得良好的抑毒效果。但距离应用临床FMD防治还存在较大差距，其原因主要在于FMDV的多血清型/亚型之间基因组的高变性。由于RNAi技术中起到降解mRNA作用的siRNA需要与靶序列精确结合，存在过多的突变位点会减低mRNA的降解效率，某血清型ロ蹄疫特定分离株特性性siRNA，由于其他分离株在靶序列位置存在基因多态性的原因，该siRNA对其他与目标分离株靶序列比较多态性差异加大的分离株并不能获得良好的抑制效果，这严重限制了 siRNA作用的ロ蹄疫病毒谱系范围。研究表明FMDV基因组存在高突变性，但高突变位点主要集中于编码FMDV抗原表位等结构蛋白基因，而非结构蛋白相对较为保守，同时考虑到非结构蛋白在病毒核酸复制、病毒蛋白裂解等过程的关键性作用，抑制非结构蛋白则更能高效地抑制病毒増殖。设计靶位于多血清型/亚型ロ蹄疫病毒非结构蛋白基因共同高度保守区的siRNA更容易实现RNAi的病毒谱系的广泛性和高效性，有利于加快RNAi技术在临床的应用。ロ蹄疫病毒非结构蛋白基因3C编码病毒的ー种蛋白酶，能単独发挥作用，具有催化病毒聚合蛋白裂解和宿主蛋白裂解的作用。3C可以催化聚蛋白的次级裂解，在P1、P2和P3内发挥裂解作用。3C蛋白的表达下降，将有效抑制FMDV病毒衣壳蛋白的裂解，降低病毒粒子的包装及释放效率，从而抑制FMDV的复制。研究表明不同血清型FMDV分离株3C基因高度保守，同源性在78%以上，为针对不同血清型FMDV分离株3C基因保守区设计特异性siRNA,达到抑制多血清型FMDV复制目的奠定基础。我国处于欧亚大陆东端，陆路与十几个国家接壤，周边国家ロ蹄疫地理分布极为复杂，使得我国面临ロ蹄疫的严重威胁。目前在国内发现及造成较大危害的ロ蹄疫主要为O型、A型和Asia I型ロ蹄疫。我国幅员辽阔，自然气候条件多祥，各省地口蹄疫病毒流行株差异较大，使得FMD的防控形势异常严唆。
发明内容
本发明目的是利用RNAi技术，针对多血清型(O型、A型和AsiaI型)ロ蹄疫病毒3C基因高保守区设计合成siRNA，提供能够广谱、高效抑制多血清型ロ蹄疫病毒3C基因表达的siRNA，为ロ蹄疫病毒防治提供新的策略。针对危害我国ロ蹄疫血清型及亚型众多的问题，本发明提出针对多种血清型ロ蹄疫病毒基因组保守区设计siRNA，以达到广谱抗毒的效果，因此本发明首先下载Genbank数据库中所有具有全基因序列的A型、O型和Asia I型FMDV分离株全基因组序列，采用Clusta X软件进行同源比对分析，找出三种血清型所有ロ蹄疫病毒分离株基因组中共同的高保守区段，比对分析结果发现各血清型分离株基因组中3C基因部分序列高度保守，同源性在98%以上。以此区域作为靶点设计出siRNAl-3C、siRNA2-3C和siRNA3_3C三条siRNA。具体靶位及A型、O型和Asia I型分离株3C基因部分序列比对位置见图I。由于很难找到不同血清型分离株病毒基因组中序列完全相同的区域，同时该区域片段长度及序列特征又必须符合siRNA的设计原则，所以本发明也将对siRNA靶位核苷酸突变对siRNA抑制效率的影响进行检测。为避免病毒増殖抑制研究中涉毒实验的生物安全性问题，本发明中所采用的筛选方法为EGFP作为报告分子筛选有效siRNA的体外筛选方法。具体方法是委托生物公司化学合成參考毒株基因组3C基因部分基因片段，随后构建EGFP-3C基因融合表达载体，通过真核表达载体与siRNA共转染HEK293T细胞，最后检测EGFP荧光及EGFP-3C基因mRNA验证siRNA对3C基因的抑制效率。该方法可以有效避免因ロ蹄疫病毒活毒细胞培养所帯来的散毒等危险。EGFP-3C融合表达载体酶切鉴定见图2、图3、图4。本发明中将pEGFP-3C真核表达载体与各候选siRNA共转染HEK293T细胞，转染后24h、48h和72h观察添加不同siRNA细胞EGFP发光强度，其中以pEGFP_3C表达载体作为空白对照，以添加EGFP基因的阳性siRNA作为阳性对照，以随机合成的siRNA作为阴性对照。绿色荧光蛋白观察结果见图5、图6、图7。由图5、图6、图7可以看出三种血清型3C基因EGFP-3C融合蛋白空白对照绿色荧光蛋白表达较高，添加EGFP阳性siRNA对照组，绿色荧光则几乎全部消失，而添加随机siRNA的阴性对照组则似乎绿色荧光有略微增强的趋势。检测添加不同siRNA的三种血清型EGFP-3C融合蛋白表达情況，结果显示所有siRNA对三种血清型3C基因均有明显的抑制效果，其中尤以siRNAl-3C和siRNA3_3C抑制效果最为明显。siRNAl-3C和siRNA3-3C可对三种血清型3C基因在检测时间内具有良好的抑制效果，siRNA2-3C可有效抑制O和A型ロ蹄疫3C基因表达，对Asia I型3C基因在48h内有较为明显的抑制效果，但72h则失去抑制作用。本发明中采用Real-time RT-PCR方法对添加不同siRNA组pEGFP_3C融合基因的mRNA降解进行验证，Real-time RT-PCR检测结果见图8、图9、图10。结果显示，添加不同siRNA后siRNAl-3C和siRNA3_3C对三种血清型ロ蹄疫病毒pEGFP_3C融合基因的mRNA均具有良好的抑制效果，PEGFP-3C融合基因的mRNA表达水平均在对照组20%以下，有些时间点甚至达到10%以下(图8、图9、图10)，说明siRNA具有非常强的mRNA降解能力。对应siRNAl-3C和siRNA3-3C对三种血清型均具有良好的抑制效率，siRNA2_3C则主要表现为对O型和A型表现出高的抑制效率，而对Asia I则只在48h内表现出良好的抑制效率。Real-timeRT-PCR检测结果与荧光蛋白检测结果相同，表现为48h内pEGFP_3C基因的mRNA的表达量较低，而72h则表现为EGFP荧光强度及EGFP-3C基因mRNA含量的显著提升。对照不同血清型ロ蹄疫病毒siRNA靶序列核苷酸差异，提示不同的碱基突变对siRNA抑制效率的影响较为明显。本发明同时也证明，靶序列的某些位置和某些碱基突变对siRNA抑制效率的影响较小，扩大了 siRNA病毒抑制谱系。 本发明的ー组能特异性抑制O型、A型和Asia I型ロ蹄疫病毒3C基因表达的siRNA可在抗多血清型ロ蹄疫病毒药物及抗多血清型ロ蹄疫病毒转基因动物中应用。本发明中siRNA制备方法为化学合成方法，采用此方法可以快速筛选出高效抑制多血清型ロ蹄疫病毒的siRNA序列，筛选完成后可以用质粒载体体内表达的方法合成目标siRNA,也可以通过体外转录的方法制备目标基因siRNA，降低siRNA的合成成本；亦可以应用转基因方法，培育能特异性表达本发明siRNA序列的具有多血清型ロ蹄疫抗性的猪、牛或羊等转基因家畜抗病新品种。
图I为本发明所选取的O型、A型和Asia I型ロ蹄疫病毒3C基因保守区不同siRNA靶位位置及靶位序列比对结果示意图其中O型ロ蹄疫病毒分离株为HKN/2002(基因序列号为AY317098) ;A型ロ蹄疫病毒分离株是A/VN/ll/2009(基因序列号为GQ406250) ；Asia I型ロ蹄疫病毒分离株是Asial/HNK/CHA/05(基因序列号为 EF149010)；图2为用于表达O型ロ蹄疫病毒3C基因的重组真核表达载体pEGFP-3C酶切鉴定电泳3为用于表达A型ロ蹄疫病毒3C基因的重组真核表达载体pEGFP-3C酶切鉴定电泳4为用于表达Asia I型ロ蹄疫病毒3C基因的重组真核表达载体pEGFP_3C酶切鉴定电泳5为荧光显微镜检测不同靶位siRNA对O型ロ蹄疫病毒3C基因融合EGFP-3C蛋白表达抑制灭光照片其中图O为PEGFP-Q-3C空白对照荧光照片；图0+P为pEGFP-Q-3C与EGFP阳性siRNA共转染；图0+N为pEGFP-Cl-3C与阴性siRNA共转染荧光照片。24h、48h和72h代表不同靶siRNA与pEGFP-Cl-3C共转染后不同的检测时间点；图6为荧光显微镜检测不同靶位siRNA对A型ロ蹄疫病毒3C基因融合EGFP-3C蛋白表达抑制灭光照片其中图A为PEGFP-C1-3C空白对照荧光照片；图A+P为pEGFP_Cl_3C与EGFP阳性siRNA共转染荧光照片；图A+N为pEGFP-Cl-3C与阴性siRNA共转染荧光照片。24h、48h和72h代表不同靶siRNA与pEGFP-Cl-3C共转染后不同的检测时间点；图7为荧光显微镜检测不同靶位siRNA对Asia I型ロ蹄疫病毒3C基因融合EGFP-3C蛋白表达抑制荧光照片其中图Asia I为pEGFP_Cl_3C空白对照荧光照片；图Asia I+P为pEGFP_Cl_3C与EGFP阳性siRNA共转染荧光照片；图Asia I+N为pEGFP_Cl_3C与阴性siRNA共转染荧光照片。24h、48h和72h代表不同靶siRNA与pEGFP_Cl_3C共转染后不同的检测时间点；图8为采用实时定量RT-PCR法评价不同siRNA对O型ロ蹄疫病毒EGFP-3C融合 蛋白表达的抑制效率对比9为采用实时定量RT-PCR法评价不同siRNA对A型ロ蹄疫病毒EGFP-3C融合蛋白表达的抑制效率对比10为采用实时定量RT-PCR法评价不同siRNA对Asia I型ロ蹄疫病毒EGFP-3C融合蛋白表达的抑制效率图对比图
具体实施例方式实施例I抗多血清型ロ蹄疫病毒3C基因的siRNA设计与合成从Genbank数据库中下载全部A型、O型和Asia I型3C基因序列数据，采用Clustal X软件对全部基因序列进行比对分析，选择三种血清型ロ蹄疫病毒3C基因高度保守区域设计siRNA，具体序列參见序列表。将设计好的siRNA委托上海吉玛生物工程公司进行5’端修饰合成。实施例2不同血清型ロ蹄疫病毒3C基因合成及pEGFP-3C真核表达载体构建參照A型、O型和Asia I型ロ蹄疫病毒3C基因组保守区序列，委托生物公司人工合成O型ロ蹄疫病毒分离株HKN/2002 (基因序列号为AY317098)，A型ロ蹄疫病毒分离株A/VN/ll/2009(基因序列号为GQ406250)及Asia I型ロ蹄疫病毒分离株Asia 1/HNK/CHA/05 (基因序列号为EF149010) 3C基因长度为300bp的基因片段(具体核苷酸序列见图I)，合成片段两侧分别添加Bgl II及Sal I酶切位点，将基因合成片段克隆至pMD 18T载体中长期保存。PEGFP-3C表达载体构建程序为首先采用Bgl II和Sal I酶分别对pEGFP-Cl空载体质粒和PMD 18T-3C阳性质粒进行双酶切，胶回收纯化pEGFP-Cl粘性末端线性片段和3C基因片段，最后用T4DNA连接酶连胶回收纯化目的片段并转化入DH5 α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有50 μ L/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，置于37°C培养箱过夜培养。阳性克隆经酶切和测序方法鉴定所构建的PEGFP-3C表达载体序列正确且读码框无错误(图2，图3，图4)。实施例3 siRNA和pEGFP_3C共转染HEK293T细胞将鉴定好的pEGFP-3C菌落接种于含有50 μ L/mL卡那霉素的100ml LB液体培养基的大培养瓶中，37°C,220rpm/min摇床培养过夜,离心回收菌体进行无内毒素质粒提取(按说明书操作)，质粒经琼脂糖凝胶电泳检测质粒完整性，紫外分光光度计测定其浓度后，置于-20°C冰箱以备转染用。
按常规方法，用不含有双抗的DMEM完全培养液稀释HEK293T细胞至O. 5 X IO5个/mL，24孔细胞培养板中每孔接种O. 5mL，待细胞单层生长至70% -80 %后，每孔按优化好的质粒DNA Lipofectamine 2000 = O. 5 μ g : 2 μ L的比例配制转染试剂，同时添加终浓度为IOpmol/ μ L的siRNA进行转染(具体操作按Invitrogen公司Lipofectamine 2000转染试剂siRNA与质粒共转染说明书进行)，转染后4h更换培养液为完全培养液。设置不添加任何siRNA的pEGFP-3C载组为空白对照组，设置添加EGFP特异性siRNA作为阳性对照组，设置添加随机siRNA作为阴性对照组。实施例4荧光显微镜初步观察siRNA对3C基因表达的干扰效果分别于细胞转染后24h、48h和72h随机选取转染细胞视野，采用Nikon荧光倒置显微镜观察绿色荧光的发光情况并进行拍照(实验结果见图5，图6，图7)，通过不同血清型3C基因融合表达质粒分别与三种siRNA添加组与照空白对照组、阳性对照组及阴性对照组绿色荧光强度比较，初步推断不同siRNA对三种血清型3C基因的表达抑制效果。
实施例5实时定量RT-PCR法验证siRNA对ロ蹄疫病毒3C基因表达的干扰效果各转染组绿色荧光蛋白显微镜检测后，去掉细胞培养液，用无菌PBS缓冲液清洗细胞两次，收集转染细胞，采用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取细胞总RNA,以oligod(T)为反转录引物，采用M-MLV Reverse Transcriptase反转录酶(Promega公司)合成一链cDNA。荧光定量PCR检测采用罗氏Light Cycle 480II荧光定量PCR仪，SYBR Green I染料法进行，以相对定量分析方法检测不同siRNA对EGFP-3C基因的抑制效率，其中上游检测引物为共用，定位于EGFP基因。Forword :5，-ACGTCTATATCATGGCCGACA-3’O 型 3C 基因下游检测引物5 ’ -GCTTAGTGTTGCCCATGACCA-3 ’A 型 3C 基因下游检测引物5 ’ -ATGGCTACTGTCTTCCCATCGAG-3 ’Asia I 型 3C 基因下游检测引物为5’ -ACAGGCTTGGTGTTACCCAT-3’内參基因为人类β-actin，上游引物为5’ -AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’下游引物为5’ -GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ’。荧光定量PCR的检测程序为两步法扩增，具体条件为95°C预变性3min，94°C 10s,62°C 30s，共计40个循环，其中在62°C收集荧光信号检测CT值。同时对各引物扩增效率进行检测，数据处理采用Light Cycle 480II自带软件，将各引物扩增效率带入2Λ 法计算各组EGFP-3C融合基因的相对表达量，采用Excel进行数据作图，验证mRNA水平不同siRNA分别对三种血清型FMDV 3C基因的抑制效率。
权利要求
1.一组能特异性抑制O型、A型和Asia I型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA，其特征在于以口蹄疫基因组3C基因为干扰靶点，其序列分别为siRNAl-3C、siRNA2-3C、siRNA3-3C以及A型和Asia I型口蹄疫病毒基因组中对应的靶序列。
2.根据权利要求I所述的一组能特异性抑制O型、A型和AsiaI型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA，其设计与筛选方法包括下列步骤 1)比对分析所有O型、A型和AsiaI型口蹄疫病毒分离株3C基因核苷酸序列，找出三种血清型3C基因序列的保守区，在此区域内设计siRNA ； 2)人工合成O型、A型和AsiaI型三株口蹄疫病毒3C基因部分片段； 3)构建用于表达EGFP-3C融合基因的真核表达载体； 4)将真核表达载体与siRNA共转染HEK293T细胞； 5)荧光显微镜观察检测EGFP荧光及实时定量RT-PCR法检测EGFP-3C基因mRNA表达，综合验证siRNA对3C基因的抑制效率。
3.一种如权利要求I所述一组能特异性抑制O型、A型和Asia I型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA在抗多血清型口蹄疫病毒药物及抗多血清型口蹄疫病毒转基因动物中的应用。
全文摘要
多血清型口蹄疫病毒3C基因特异性siRNA筛选与应用属口蹄疫生物防治技术领域，目标是提供的一组能特异性抑制O型、A型和Asia I型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA，其序列为siRNA1-3C、siRNA2-3C、siRNA3-3C以及A型和Asia I型口蹄疫病毒基因组中对应的序列；设计与筛选方法是人工合成参考毒株3C基因部分片段、构建表达EGFP-3C融合基因的真核表达载体、真核表达载体与siRNA共转染HEK293T细胞、荧光显微镜观察检测EGFP荧光及实时定量RT-PCR检测EGFP-3C基因mRNA表达来筛选和验证siRNA对3C基因表达的抑制效果。本发明可快速筛选出抑制多血清型口蹄疫病毒的广谱高效siRNA，也可通过质粒载体表达或通过体外转录的方法制备目标siRNA；本发明可应用于抗多血清型口蹄疫病毒治疗药物制备和抗口蹄疫转基因动物培育。
文档编号C12Q1/68GK102732519SQ201210154168
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者于永生, 刘晓辉, 吕礼良, 张立春, 曹阳, 朴庆林, 王晓阳, 赵玉民, 金海国, 闫晓刚 申请人:吉林省农业科学院