专利名称：一种微小rna用于调控b7-h4基因表达的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学技术领域，具体地说，本发明涉及基因表达调控技术领域，特别涉及一种微小RNA用于调控B7-H4基因表达。
背景技术：
肿瘤一直严重威胁着人类的健康和生命，传统的治疗方法不尽如人意。免疫治疗通过提高肿瘤的免疫原性，诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的，是一种变被动为主动的生物治疗方法。由T细胞介导的细胞免疫是抗肿瘤免疫的主要形式，机体通过对肿瘤抗原的特异性识别，激活T细胞，产生相应的免疫杀伤作用。业已证实，T细胞的有效活化和功能介导需要双重信号的协同作用一是抗原 肽-MHC复合物，由T细胞抗原受体(TCR)识别；二是协同刺激信号，由抗原递呈细胞(APC)和T细胞表面的协同刺激分子配体和受体对提供。其中，B7-CD28是迄今为止公认的最基本的协同刺激信号，由表达在T细胞上的⑶28和表达在抗原递呈细胞表面的⑶80和⑶86相互作用产生Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Tmmunol2002，2 (2) : 116-126.。经过多年的研究，B7-⑶28协同刺激信号的内容得到了极大的丰富，包括数个结构和功能相似的配体和受体组成的B7-CD28家族，其中B7分子的主要成员有0)80、0)86、87-0(、87-!11、10)51^、87-!13 和87_!14等，受体包括0)28、(1'1^-4、10)5、？0-1和 BTLA 等Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH. The B7 family revisited. AnnuRev Immunol 2005, 23: 515-548.。这些协同刺激信号分子不仅提供促进T细胞生长、分化和产生细胞因子的正性信号，同时还能通过提供负性信号来限制、终止和/或减弱T细胞应答。T细胞的活化正是这种正性信号和负性信号相互平衡的结果Carreno BM, CollinsM. The B7 family of ligands and its receptors: new pathways for costimulationand inhibition of immune responses. Annu Rev Tmmunol 2002, 20: 29-53.。其中，负性信号主要是由B7家族的新成员B7-H1、B7-H3和B7-H4提供。如果这些负性协同刺激分子表达异常或功能障碍，就将导致疾病发生发展，如恶性肿瘤和自身免疫性疾病等。(B7S1、B7x、VTCNl)是2003年被发现的协同刺激信号B7-CD28家族中的最新成员Sica GL, et al. B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulatesT cell immunity. Immunity 2003，18 (6) : 849-61.,主要通过抑制 T 细胞增殖、细胞因子的分泌和细胞周期的进程等方式来负性调控T细胞的免疫应答，同时它还可以促进人体正常上皮细胞向恶性转化，防止恶变表皮细胞发生失巢凋亡，从而有利于肿瘤的发生和生长。目前，B7-H4已被发现在结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、肺癌和骨髓瘤等多种恶性肿瘤组织中存在高表达，且与患者预后及临床病理参数密切相关Zou W，Chen L.Inhibitory B7-family molecules in the tumour microenvironment. Nat Rev Tmmunol2008，8(6) : 467-77。在肿瘤组织中B7-H4主要表达在肿瘤细胞和肿瘤浸润性巨噬细胞。高表达B7-H4的前列腺癌更容易转移、复发，患者死亡率也更高Zang X，et al. B7-H3 andB7x are highly expressed in human prostate cancer and associated with diseasespread and poor outcome. Proc Natl Acad Sci USA 2007, 104 (49) : 19458-19463.，而高表达B7-H4的胃癌、卵巢癌和肾癌患者预后更差Jiang J, et al. Tumor expressionof B7—H4 predicts poor survival of patients suffering from gastric cancer.Cancer Tmmunol Immunother 2010, 59(11): 1707-1714·。目前对B7-H4在肿瘤组织中表达的调控机制尚不明确。有研究发现，肿瘤微环境中的某些细胞因子和炎症介质对B7-H4的表达存在调节作用。IL-6和IL-IO能诱导B7-H4在单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和骨髓DC细胞上表达。DC细胞分化因子GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4能降低IL-6和IL-IO对B7-H4表达的诱导作用Kryczek I, Zou L, Rodriguez P, et al. B7-H4 expression identifies anovel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. J ExpMed, 2006，203(4) :871-881.。与B7-H1不同，IFN-γ对B7-H4表达的影响却很小。在人卵巢癌中，肿瘤相关Treg细胞诱导巨噬细胞产生大量IL-6和IL-10，进而刺激Β7-Η4以自分泌和/或旁分泌方式在APC上表达。然而，IL-4、IL-6、IL-IO和GM-CSF都不能诱导Β7-Η4在肿瘤细胞上表达Kryczek I, Wei S，Zhu G, et al. Relationship between B7-H4, regulatory T cells, and patient outcome in human ovarian carcinoma. Cancer Res,2007， 67 (18):8900-8905.。广泛表达于淋巴样及非淋巴样组织，但其蛋白质在各种组织中不表达或低表达，在树突状细胞、单核/巨噬细胞、B细胞和T细胞表面诱导性表达Choi IH, et al.Genomic organization and expression analysis of B7—H4, an immune inhibitorymolecule of the B7 family. J Tmmunol 2003，171 (9) :4650-4654.。正常人类组织不表达或极低表达B7-H4，但在多种肿瘤组织中发现B7-H4高表达。由此提示，这种负性协同刺激分子蛋白在正常组织中的表达受到转录后调控，而这种调控机制在肿瘤中存在异常。因此，调控B7-H4表达有望成为一种新的抗肿瘤治疗途径，具有潜在应用价值He C，et al.The inhibitory role of b7_h4 in antitumor immunity: association with cancerprogression and survival. Clin Dev Tmmunol 2011:695834.。是近年来发现于真核细胞中的一类长约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，可通过与靶mRNA的3’ -UTR互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用。越来越多的研究证实，miRNA在肿瘤组织中表达异常，与肿瘤发生发展及患者治疗反应密切相关；如hsa-miR-21在结直肠癌组织中表达上调，与结直肠癌 M分期及患者预后密切相关SchetterAJ, Leung SY, Sohn JJ, et al. MicroRNA expression profiles associated withprognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 2008, 299(4):425-36.。最近，这种在肿瘤组织中表达异常的miRNA有的已被证实具有显著的抗肿瘤活性[Thorsen SB, et al. The Therapeutic Potential of MicroRNAs in Cancer. CancerJ 2012, 18(3) :275-84.，如miR-145和miR_33a能抑制HCT-116结直肠癌细胞移植瘤的生长Ibrahim AF, et al. MicroRNA replacement therapy for miR-145 and miR_33a isefficacious in a model of colon carcinoma. Cancer Res 2011,71:5214-5224.。另夕卜，miR-122由于能调控丙型肝炎病毒RNA的丰度，其互补序列用于治疗丙型肝炎病毒感染患者已经进入 II 期临床试验Janssen HL, ReesinkHW, Zeuzem S，et al. A randomized,double-blind, placebo (plb) controlled safety and anti-viral proof of conceptstudy of miravirsen (MIR), an oligonucleotide targeting miR-122, in treatmentnaBve patients with genotype I (gtl) chronic HCV infection. Hepatology.2011:1430A.，显示出miRNA作为一种极其重要的基因表达调控因子和作用靶标，具有潜在的治疗作用和实际应用价值。虽然本领域中已知某些微小RNA与肿瘤具有一定的相关性，但本领域中已知的miRNA种类繁多，功能各异，要从中筛选出与肿瘤相关且可作为发病、治疗方案的选择及预后的特定miRNA存在较大难度。目前，本领域中尚无miR-143和B7-H4基因相关性的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种微小RNA对B7-H4基因表达的调控，特别是miR-143用于调控B7-H4基因表达。
本发明的目的是通过以下方式实现的一种微小RNA用于调控B7-H4基因表达，其特征在于，所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体5， -UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3，。优选地，所述微小RNA能与B7-H4基因3’ -UTR结合，抑制B7-H4基因表达。优选地，所述微小RNA为miR-143。优选地，所述微小RNA通过化学合成得到。优选地，所述微小RNA来自生物体样本，包括组织、细胞和外周血。本发明微小RNA的获取来源可以是来自化学合成和/或存在该基因序列的细胞、组织，组织可以选自外周血、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。在本文中，术语“样本”指的是潜在可能含有微小RNAmiR-143的离体循环血样品，优选是来自人的样品。尽管用抽提出血总RNA的纯化样品也能够在本发明中使用，但是，本发明的样品优选是未经提纯的、含有血总RNA的裂解液体样品。本领域技术人员知晓将固体的有核血细胞裂解或抽提、纯化并保持其中miRNA成分不被降解的细胞分子生物学技术。本发明的样品可以是经过处理的样品，如稀释处理、血细胞裂解处理以及PCR扩增等，也可以是未经处理的样品。经过处理的样品可以进一步纯化，以富集miRNA。在本文中，术语“miR-143”指的是指的是包含序列“UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC”或其同源序列的微小RNA。本领域中已知各种来源的miR-143，例如人、黑猩猩、马、鸡等，这些同源序列均包含在本发明的术语“miR-143”中。本发明的术语中还包含上述天然存在的miR-143序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物化学修饰，且仍然具有生物学活性的衍生RNA。本发明人采用实时荧光定量PCR技术测定了 6例结直肠癌组织和正常组织中miRNA的表达；统计分析发现，hsa-miR-143在结直肠癌组织中的表达显著低于正常组织，结果如图I所示。本发明人采用生物信息学软件miRanda预测发现，hsa-miR-143可能与B7-H4基因3’-UTR结合，结果如图2所示。随后，本发明人采用体外生物学功能实验证实，hsa-miR-143可与B7-H4基因3’ -UTR结合，从而抑制B7-H4分子表达；可通过调控B7-H4信号通路和/或miR-143表达及功能以发挥抗肿瘤作用。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
图I为结直肠癌组织中和正常组织miR-143表达量测定结果；
图2为miRanda软件预测结果；
图3 B7-H4基因3’ -UTR的PCR扩增结果；
图4 B7-H4/3’ -UTR/pGEM-T重组载体酶切验证结果；图5 B7-H4/3’ -UTR/pGEM-T重组载体测序验证结果；
图6 B7-H4/3’ -UTR/ pGL-3重组载体酶切验证结果；
图7 B7-H4/3’ -UTR/ pGL-3重组载体测序验证结果；
图8 hsa-miR-143对B7-H4/3’ -UTR/pGL-3重组载体表达活性的抑制作用。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。一、试剂与材料 I、试剂
胎牛血清(Hyclone，美国)；完全培养基每升RPMI1640 (Hyclone，美国)中，添加胎牛血清100ml、L-谷氨酰胺O. 15g、2-巯基乙醇10.0 ml (5X l(T3mol/L);脂质体2000(Invitrogen,美国);青霉素、链霉素(上海生工生物技术有限公司);TRIzol (Invitrogen,美国);琼脂糖(LP0028A，Oxoid Ltd,英国);凝胶电泳加样液和溴化乙锭(EtBr)(上海生工生物技术有限公司);胶回收DNA试剂盒和质粒抽提试剂盒(Axygen,美国);鹿糖、Triton-100、MgCl2*6H20、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、盐酸、EDTA、NaCl、苯酚、氯仿、异戊醇、十二烷基磺酸钠(SDS)和无水乙醇等实验所用试剂均为分析纯或优级纯；双荧光素酶检测试剂盒(Promega,美国Xhsa-miR-HS及其实时突光定量试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司);TaqDNA聚合酶、M-MuLV反转录酶、油a I限制性内切酶(MBI，美国)；T4 DNA连接酶(Takar a，日本)；PCR 引物(Invitrogen, PAGE 级)。pGEM-T、pGL-3> pRL-TK 载体(Promega,美国)。2、组织样本
收集6例结直肠癌患者的新鲜手术组织样本，包括癌组织和远端正常肠组织(离癌边沿5cm)。所有患者经HE染色、病理诊断确认为结直肠癌；术前未接受化疗或放疗。3、细胞株
中国仓鼠卵巢细胞株CHO (ATCC，美国);大肠杆菌TPlO (Novagen，美国)。细胞株经检测，无支原体污染。4、仪器
CO2培养箱、低温高速离心机、常速离心机(Thermo,德国)；倒置显微镜(Olympus,日本)；微弱发光测量仪(BPCL-K，中科院生物物理研究所)；PCR仪(S1000，Bio-Rad，美国)；电泳仪(Bio-Rad,美国)；微量定量分光光度计(Alpha Innotech,美国)；凝胶成像系统(GeneGenius, SYNGENE,英国)。
二、实验方法
I、细胞培养
采用含10% FCS的RPMI 1640培养基进行培养，培养液中含有100kU/L青霉素、IOOmg/L链霉素，培养条件为37° C、5% CO2、饱和湿度。CHO细胞株贴壁生长，传代时用O. 25%胰酶消化。间隔2-3天更换新鲜培养基。2、实时荧光定量分析hsa-miR-143表达量
采用Trizol试剂按照使用说明书从6对结直肠癌和正常组织样本中提取总RNA。实时荧光定量PCR试剂盒测定RNA样本中hsa-miR-143的表达量；以U6 RNA为内对照。取5μΜRT引物工作液lPL，加入79μ RNsae-free水，配置成62. 5nM RT引物工作液。50μ RT反应体系，加入2μ RNA样品，引物工作液各4μ ，加RNsae-free水至19μ 。以上体系混匀后，瞬时离心，70° C放置lOmin，冰育2min，再加入以下试剂进行RT反应1XRT buffer，WL dNTP (10mM),40U RNase inhibitor, 200U RT 酶，加 RNsae-free 水至 50μ 。RT 反应程序42° C 60min，70° C lOmin。RT反应结束后立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却，后续所有步骤都在冰上进行。接着进行qRT-PCR反应定量测定hsa-miR-143表达量，20μ 反应体系10μ SYBR Green Μ χ,2μ RT反应产物，Bulge-Loop miR-143正向引物和反向引物(5μΜ)各2μ ，加RNsae-free水至20μ 。反应程序95° C预变性20sec ;接着进行40个循环(95。C 变性 10sec;60。C 退火 20sec;70。C 延伸 5sec)。3、miRNA作用靶位点的预测
采用生物信息学软件miRanda (www. microRNA. org)预测可能与B7-H4基因3’-UTR结合的miRNA。4、构建含B7-H4基因3’ -UTR片段的荧光素酶表达载体
采用Trizol试剂按照使用说明书从MDA-MB-435细胞中提取总RNA，以Oligo (dT)为逆转录引物，用M-MuLV反转录酶将RNA反转录为cDNA。μ L PCR反应体系中含有2 μ L cDNA模板，I. 25U Taq DNA聚合酶，I X缓冲液，O. 2mmol/L dNTPs，O. 4Mmol/L正向引物5’- GGC TAG TCT AGA ACT CAG CTG GGG TGA TTT CG-3’和反向引物5’- GGC TAG TCT AGA TGT AAT ACA GTC ACC GTG GC-3’(下划线碱基为内切酶油<31识别序列)。热循环条件为94° C预变性5min ;然后以94° C变性20sec，60° C退火30sec，72° C延伸lmin，扩增35个循环；最后72° C延伸7min使反应完全。反应完成后，取反应产物3PL在I. 5%琼脂糖凝胶上进行电泳(I X TAE电泳缓冲液，电压200V，恒压电泳5min)，凝胶成像系统拍摄电泳图谱。扩增成功的产物采用Sanger’ s测序法测定DNA序列(Invitrogen);另取30μ 反应产物在2. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳(I XTAE电泳缓冲液，电压100V，恒压电泳lOmin)，然后采用胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，并用微量紫外分光光度计测定其浓度。参考产品说明书，将纯化的B7-H4基因3’ -UTR片段克隆到pGEM_T载体；热转化大肠杆菌TPlO感受态细胞，进行蓝白斑筛选。挑取白斑摇菌，抽提质粒；PCR扩增及酶切鉴定后再进行测序验证。将测序正确的重组子用油al酶切后，回收3’ -UTR片段。用PGL-3和pRL-TK载体质粒转化常规制备的大肠杆菌TPlO感受态细胞，进行大量扩增；试剂盒抽提法大量制备PGL-3和pRL-TK质粒，电泳检测质粒的纯度和含量。用限制性内切酶对提取的PGL-3质粒进行酶切，试剂盒直接回收大片段的酶切产物。参考产品说明书，将酶切回收纯化后的B7-H4基因3 ’ -UTR片段按适当比例与pGL_3载体的Xba I酶切片段进行连接反应，16° C酶连过夜。取10 μ L连接产物直接转化100 μ L大肠杆菌TPlO感受态细胞。经过含有氨苄青霉素的LB平板固体培养基中选择培养。从转化子的平板上随机挑取10个菌落，经过含氨苄青霉素的LB液体培养基扩增培养；经PCR扩增、酶切和测序鉴定后，用试剂盒抽提质粒备用。5、细胞转染
首先，将培养于含有10% FCS、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640完全培养基中细胞株，按I X IO4个细胞/孔的量在24孔板中接种指数生长期的细胞，培养过夜，直到细胞80%汇片。然后，将一定量的hsa-miR-143、B7-H4/3 ' _UTR/pGL3重组质粒和内参质粒 pRL-TK稀释至50 μ L不含血清和抗生素的0pti-MEM I培养基中，用移液枪混合均匀；然后将I μ L脂质体2000悬液加入50 μ L不含血清和抗生素的Opti-MEMsI培养基中，在室温孵育5min ;最后将两者混合在一起，充分混匀，静置20min，使hsa-miR-143、重组质粒和内参质粒与脂质体充分结合。将只加脂质体的孔作为阴性对照。最后，吸去接种到24孔板中的培养液，用不含血清和抗生素的0pti-MEM I培养基洗一次，在每个孔中加入100 μ L上述混合物，培养3h ;吸弃培养板中的转染培养液，向各孔加入100 μ L有血清无抗生素的Opti-MEMsI培养基，继续培养24h后进行检测。6、双荧光素酶报告系统基因活性测定
将转染有PGL-3和pRL-TK的CHO细胞经过24h培养后收集，吸弃培养基，用PBS洗I次。加入裂解液20 μ L/孔，室温摇动15 min0按照双荧光素酶检测试剂盒的操作说明书，取100 μ L突光素酶分析缓冲液II于I. 5ml离心管中，设定化学发光仪延迟2sec,发光仪测读IOsec ;将全部细胞裂解液加入到离心管中，用移液枪轻轻抽吸2-3次混匀(不要旋涡振动)；将离心管放入化学发光仪中测读萤火虫荧光素酶发光值Fl ;将离心管移出发光仪，力口AlOOuL Stop&Glo试剂，快速旋涡混匀后，将离心管重放回发光仪中测读海肾荧光素酶发光值F2。应用SPSS. 10统计软件的卡方检验分析受试组与空白对照组的F1/F2比值差异，以判断hsa-miR-143的调控作用。三、结果
I.hsa-miR-143在结直肠癌组织中的表达显著低于正常组织采用实时荧光定量PCR技术测定了 6例结直肠癌组织和正常组织中miRNA的表达；统计分析发现，hsa-miR-143在结直肠癌组织中的表达显著低于正常组织，结果如图I所示。与B7-H4 基因 3’ -UTR 结合
我们采用生物信息学软件miRanda预测发现，hsa-miR-143可能与B7-H4基因3’ -UTR结合，结果如图2所示。构建B7-H4/3’ -UTR/pGL-3荧光素酶表达载体
PCR扩增得到长度为700bp的B7-H4基因3’ -UTR序列(图3)，切胶纯化回收后，将片段插入pGEM-T载体，转化感受态大肠杆菌。随机挑克隆扩增后提取质粒DNA。经过油al酶切鉴定，证实酶切后得到的基因片段与预期大小758bp相符(图4)。测序结果表明，插入PGEM-T载体的B7-H4基因3’ -UTR片段序列正确，如图5所示。抽提pGEM_T载体，酶切获得B7-H4基因3’ -UTR片段；将其插入pGL_3载体，然后转化感受态大肠杆菌。酶切后得到的基因片段与预期大小758bp相符(图6);测序结果证实插入序列正确(图7)。2、hsa-miR-143抑制重组荧光素酶表达活性
将200ng重组B7-H4/3’-UTR/pGL-3荧光素酶表达载体、20ng内参质粒pRL_TK与IOpmol hsa-miR-143共同转染CHO细胞后，采用荧光素酶活性检测试剂盒检测转染培养后CHO细胞中荧光素酶的活性。结果显示，在CHO细胞中加入hsa-miR-143后，荧光素酶的活性比值(pGL-3/pRL-TK)显著低于不加hsa-miR-143的细胞(图8)。由此表明，hsa-miR-143通过与B7-H4基因3’ -UTR上靶序列结合，抑制了荧光素酶的表达。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种微小RNA用于调控B7-H4基因表达,其特征在于,所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体5’ -UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3’。
2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA能与B7-H4基因3’_UTR结合，抑制B7-H4基因表达。
3.根据权利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA为miR-143。
4.根据权利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA通过化学合成而得。
5.根据权利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA来自生物体样本，包括组织、细胞和外周血。
全文摘要
本发明公开了一种微小RNA用于调控B7-H4基因表达，所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体:5’-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3’。所述微小RNA为miR-143。本发明人采用体外生物学功能实验证实，hsa-miR-143可与B7-H4基因3’-UTR结合，从而抑制B7-H4分子表达；可通过调控B7-H4信号通路和/或miR-143表达及功能以发挥抗肿瘤作用。
文档编号C12N15/113GK102776192SQ20121025261
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月20日 优先权日2012年7月20日
发明者张学光, 朱健洁, 汪维鹏 申请人:苏州大学