微小rna用于调控b7-h3基因表达的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种微小RNA用于调控B7-H3基因表达，所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体:5’-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3’。所述微小RNA为miR-378。本发明人采用体外生物学功能实验证实，hsa-miR-378可与B7-H3基因3’-UTR结合，从而调控B7-H3分子表达；可通过调控B7-H3信号通路和/或miR-378表达及功能以发挥抗肿瘤作用。
【专利说明】微小RNA用于调控B7-H3基因表达
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和医学【技术领域】，具体地说，本发明涉及基因表达调控【技术领域】，特别涉及一种微小RNA用于调控B7-H3基因表达。
【背景技术】
[0002]肿瘤一直严重威胁着人类的健康和生命，传统的治疗方法不尽如人意。免疫治疗通过提高肿瘤的免疫原性，诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的，是一种变被动为主动的生物治疗方法。由T细胞介导的细胞免疫是抗肿瘤免疫的主要形式，机体通过对肿瘤抗原的特异性识别，激活T细胞，产生相应的免疫杀伤作用。
[0003]业已证实，T细胞的有效活化和功能介导需要双重信号的协同作用:一是抗原肽-MHC复合物，由T细胞抗原受体(TCR)识别；二是协同刺激信号，由抗原递呈细胞(APC)和T细胞表面的协同刺激分子配体和受体对提供。其中，B7-CD28是迄今为止公认的最基本的协同刺激信号，由表达在T细胞上的⑶28和表达在抗原递呈细胞表面的⑶80和⑶86相互作用产生【Sharpe AH, Freeman GJ.The B7-CD28 superfamily.Nat Rev Tmmunol2002，2 (2): 116-126.】。经过多年的研究，B7-⑶28协同刺激信号的内容得到了极大的丰富，包括数个结构和功能相似的配体和受体组成的B7-CD28家族，其中B7分子的主要成员有 CD80、CD86、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3 和 B7-H4 等，受体包括 CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和 BTLA 等【Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH.The B7 family revisited.AnnuRev Immunol 2005, 23: 515-548.】。这些协同刺激信号分子不仅提供促进T细胞生长、分化和产生细胞因子的正性信号，同时还能通过提供负性信号来限制、终止和/或减弱T细胞应答。T细胞的活化正是这种正性信号和负性信号相互平衡的结果【Carreno BM, CollinsM.The B7 family of ligands and its receptors: new pathways for costimulationand inhibition of immune responses.Annu Rev Tmmunol 2002, 20: 29-53.】。其中，负性信号主要是由B7家族的新 成员B7-H1、B7-H3和B7-H4提供。如果这些负性协同刺激分子表达异常或功能障碍，就将导致疾病发生发展，如恶性肿瘤和自身免疫性疾病等。
[0004]B7-H3 (CD276)是近年来新发现的B7家族新成员，是Chapvol等人2001年在树突状细胞cDNA文库中首次发现【Chapoval Al, Ni J, Lau JS, et al.B7-H3: acostimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production.NatImmunol 2001,2(3):269-74.】。B7-H3 mRNA广泛表达于多种人正常组织，包括淋巴样组织和非淋巴样组织；但其蛋白表达范围较小，在静息的T细胞、B细胞和NK细胞中尚未检测到B7-H3分子的表达，但在各类刺激下如IFN- Y刺激，可以诱导该类细胞表达B7-H3分子。研究发现，B7-H3异常高表达于结直肠癌【Ingebrigtsen VA, Boye K, Tekle C，et al.B7—H3 expression in colorectal cancer: Nuclear localization strongly predictspoor outcome in colon cancer.1nt J Cancer, in press.】和前列腺癌【Zang X,Thompson RH, Al-Ahmadie HA, et al.B7-H3 and B7x are highly expressed in humanprostate cancer and associated with disease spread and poor outcome.Proc NatlAcad Sci U S A 2007, 104(49): 19458-63.】等多种肿瘤组织。B7-H3在肠癌的表达水平与T细胞的浸润数量成负相关，而与浸润的肿瘤相关巨噬细胞成正相关，同时体外实验表明肿瘤B7-H3分子可诱导单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞的分化，促进其表达细胞因子IL-10，表明肠癌B7-H3分子可能通过诱导肿瘤巨噬细胞的分化和浸润，进而抑制T细胞的浸润和功能发挥，从而参与肿瘤的免疫逃逸【Sun J, Chen LJ, Zhang GB, et al.Clinicalsignificance and regulation of the costimulatory molecule B7—H3 in humancolorectal carcinoma.Cancer Immunol Immunother 2010，59 (8): 1163-71.】。因此，调控B7-H3表达将成为一种新的抗肿瘤治疗途径，具有潜在应用价值【Loos M, HedderichDM, Friess H，et al.B7_h3 and its role in anti tumor immunity.Clin Dev Immunol2010;2010:683875.】。
[0005]miRNA是近年来发现于真核细胞中的一类长约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，可通过与靶mRNA的3’ -UTR互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用。越来越多的研究证实，miRNA在肿瘤组织中表达异常，与肿瘤发生发展及患者治疗反应密切相关；如hsa-miR-21在结直肠癌组织中表达上调，与结直肠癌分期及患者预后密切相关【Schetter AJ, Leung SY, Sohn JJ, et al.MicroRNA expression profiles associatedwith prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma.JAMA 2008,299(4): 425-36.】。研究还发现，hsa_miR-29在神经母细胞瘤、肉瘤和脑瘤等多种实体瘤组织中表达明显低于正常组织，并能抑制B7-H3基因在这些癌组织中的表达【Xu H, CheungIY, Guo HF, et al.MicroRNA miR-29 modulates expression of immunoinhibitorymolecule B7-H3: potential implications for immune based therapy of humansolid tumors.Cancer Res 2009，69 (15): 6275-81.】。最近，这种在肿瘤组织中表达异常的miRNA有的已被证实具有显著的抗肿瘤活性【Thorsen SB, et al.The TherapeuticPotential of MicroRNAs in Cancer.Cancer J 2012，18 (3):275-84.】，如 miR-145 和miR_33a能抑制HCT-116结直肠癌细胞移植瘤的生长【Ibrahim AF, et al.MicroRNAreplacement therapy for miR-145 and miR_33a is efficacious in a model of coloncarcinoma.Cancer Res 2011,71:5214-5224.】。另外，miR-122 由于能调控丙型肝炎病毒RNA的丰度，其互补序列用于治疗丙型肝炎病毒感染患者已经进入II期临床试验【JanssenHL, ReesinkHff, Zeuzem S， et al.A randomized, double-blind, placebo (plb)controlled safety and ant1-viral proof of concept study of miravirsen (MIR), anoligonucleotide targeting miR-122, in treatment naBve patients with genotype I(gtl) chronic HCV infection.Hepatology.2011:1430A.】,显不出 miRNA作为一种极其重要的基因表达调控因子和作用靶标，具有潜在的治疗作用和实际应用价值。
[0006]虽然本领域中已知某些微小RNA与肿瘤具有一定的相关性，但本领域中已知的miRNA种类繁多，功能各异，要从中筛选出与肿瘤相关且可作为发病、治疗方案的选择及预后的特定miRNA存在较大难度。目前，本领域中尚无miR-378和B7-H3基因相关性的报道。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题在于提供一种微小RNA对B7-H3基因表达的调控，特别是miR-378用于调控B7-H3基因表达。
[0008]本发明的目的是通过以下方式实现的:一种微小RNA用于调控B7-H3基因表达，其特征在于，所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体:5， -ACUGGACUUGGA⑶CAGAAGG-3，。
[0009]优选地，所述微小RNA能与B7-H3基因3’ -UTR结合，调控B7-H3基因表达。
[0010]优选地，所述微小RNA为miR-378。
[0011 ] 优选地，所述微小RNA通过化学合成得到。
[0012]优选地，所述微小RNA来自生物体样本，包括组织、细胞和外周血。
[0013]
本发明微小RNA的获取来源可以是来自化学合成和/或存在该基因序列的细胞、组织，组织可以选自外周血、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。
[0014]在本文中，术语“样本”指的是潜在可能含有微小RNAmiR-378的离体循环血样品，优选是来自人的样品。尽管用抽提出血总RNA的纯化样品也能够在本发明中使用，但是，本发明的样品优选是未经提纯的、含有血总RNA的裂解液体样品。本领域技术人员知晓将固体的有核血细胞裂解或 抽提、纯化并保持其中miRNA成分不被降解的细胞分子生物学技术。本发明的样品可以是经过处理的样品，如稀释处理、血细胞裂解处理以及PCR扩增等，也可以是未经处理的样品。经过处理的样品可以进一步纯化，以富集miRNA。
[0015]在本文中，术语“miR-378”指的是指的是包含序列“ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG”或其同源序列的微小RNA。本领域中已知各种来源的miR-378，例如人、黑猩猩、马、鸡等，这些同源序列均包含在本发明的术语“miR-378”中。本发明的术语中还包含上述天然存在的miR-378序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物化学修饰，且仍然具有生物学活性的衍生RNA。
[0016]本发明人采用实时荧光定量PCR技术测定了 6例结直肠癌组织和正常组织中miRNA的表达；统计分析发现，hsa-miR-378在结直肠癌组织中的表达显著低于正常组织，结果如图1所示。本发明人采用生物信息学软件miRanda预测发现，hsa-miR-378可能与B7-H3基因3’-UTR结合，结果如图2所示。随后，本发明人采用体外生物学功能实验证实，hsa-miR-378可与B7-H3基因3’ -UTR结合，从而调控B7-H3分子表达，可通过调控B7-H3信号通路和/或miR-378表达及功能以发挥抗肿瘤作用。
[0017]
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
图1为结直肠癌组织中和正常组织miR-378表达量测定结果；
图2为miRanda软件预测结果；
图3 B7-H3基因3’ -UTR的PCR扩增结果；
图4 B7-H3/3’ -UTR/pGEM-T重组载体酶切验证结果；
图5 B7-H3/3’ -UTR/pGEM-T重组载体测序验证结果；
图6 B7-H3/3’ -UTR/ pGL-3重组载体酶切验证结果；图7 B7-H3/3’ -UTR/ pGL-3重组载体测序验证结果；
图8 hsa-miR-378对B7-H3/3’ -UTR/pGL-3重组载体表达活性的抑制作用。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0021]一、试剂与材料。 1、试剂
胎牛血清(Hyclone，美国)；完全培养基:每升RPMI1640 (Hyclone，美国)中，添加胎牛血清100ml、L-谷氨酰胺0.15g、2-巯基乙醇10.0 ml (5X l(T3mol/L);脂质体2000(Invitrogen,美国);青霉素、链霉素(上海生工生物技术有限公司);TRIzol (Invitrogen,美国);琼脂糖(LP0028A，Oxoid Ltd,英国);凝胶电泳加样液和溴化乙锭(EtBr)(上海生工生物技术有限公司);胶回收DNA试剂盒和质粒抽提试剂盒(Axygen,美国);鹿糖、Triton-100、MgCl2*6H20、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、盐酸、EDTA、NaCl、苯酚、氯仿、异戊醇、十二烷基磺酸钠(SDS)和无水乙醇等实验所用试剂均为分析纯或优级纯；双荧光素酶检测试剂盒(Promega，美国Xhsa-miR-378及其实时荧光定量试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司);TaqDNA聚合酶、M-MuLV反转录酶、油a I限制性内切酶(MBI，美国)；T4 DNA连接酶(Takar a，日本)；PCR 引物(Invitrogen, PAGE 级)。pGEM-T、pGL-3> pRL-TK 载体(Promega,美国)。
[0022]2、组织样本
收集6例结直肠癌患者的新鲜手术组织样本，包括癌组织和远端正常肠组织(离癌边沿5cm)。所有患者经HE染色、病理诊断确认为结直肠癌；术前未接受化疗或放疗。
[0023]3、细胞株
中国仓鼠卵巢细胞株CHO (ATCC，美国);大肠杆菌TPlO (Novagen，美国)。细胞株经检测，无支原体污染。
[0024]4、仪器
CO2培养箱、低温高速离心机、常速离心机(Thermo,德国)；倒置显微镜(Olympus,日本)；微弱发光测量仪(BPCL-K，中科院生物物理研究所)；PCR仪(S1000，Bio-Rad，美国)；电泳仪(Bio-Rad,美国)；微量定量分光光度计(Alpha Innotech,美国)；凝胶成像系统(GeneGenius, SYNGENE,英国)。
[0025]二、实验方法 1、细胞培养
采用含10% FCS的RPMI 1640培养基进行培养，培养液中含有100kU/L青霉素、IOOmg/L链霉素，培养条件为37° C、5% CO2、饱和湿度。CHO细胞株贴壁生长，传代时用0.25%胰酶消化。间隔2-3天更换新鲜培养基。
[0026]2、实时荧光定量分析hsa-miR-378表达量
采用Trizol试剂按照使用说明书从6对结直肠癌和正常组织样本中提取总RNA。实时荧光定量PCR试剂盒测定RNA样本中hsa-miR-378的表达量；以U6 RNA为内对照。取5μΜRT引物工作液lPL，加入79μ? RNsae-free水，配置成62.5nM RT引物工作液。50μ? RT反应体系，加入2μ? RNA样品，引物工作液各4μ?，加RNsae-free水至19μ?。以上体系混匀后，瞬时离心，70° C放置lOmin，冰育2min，再加入以下试剂进行RT反应:1XRT buffer，WLdNTP (10mM),40U RNase inhibitor, 200U RT 酶，加 RNsae-free 水至 50μ?。RT 反应程序:42° C 60min，70° C lOmin。RT反应结束后立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却，后续所有步骤都在冰上进行。接着进行qRT-PCR反应定量测定hsa-miR-378表达量，20μ?反应体系:10μ? SYBR Green Μ?χ,2μ? RT反应产物，Bulge-Loop? miR-378正向引物和反向引物(5μΜ)各2μ?，加RNsae- free水至20μ?。反应程序:95° C预变性20sec ;接着进行40个循环(95。C 变性 10sec;60。C 退火 20sec;70。C 延伸 5sec)。
[0027]3、miRNA作用靶位点的预测
采用生物信息学软件miRanda (www.microRNA.0rg)预测可能与B7-H3基因3’-UTR结合的miRNA。
[0028]4、构建含B7-H3基因3’ -UTR片段的荧光素酶表达载体
采用Trizol试剂按照使用说明书从MDA-MB-435细胞中提取总RNA，以Oligo (dT)为逆转录引物，用M-MuLV反转录酶将RNA反转录为cDNA。
[0029]25 μ L PCR反应体系中含有2 μ L cDNA模板，1.25U Taq DNA聚合酶，I X缓冲液，
0.2 mmol/L dNTPs，0.4Mmol/L正向引物5’- GGC TAG TCT AGA TGT CTG TCT CAT TGC ACTGC-3’ 和反向引物 5’ - GGC TAG TCT AGA GAC TAT GCA TCG TGT CTT TG-3’(下划线碱基为内切酶油al识别序列)。热循环条件为:94° C预变性5min;然后以94° C变性20sec，60° C退火30sec，72° C延伸lmin，扩增35个循环；最后72° C延伸7min使反应完全。反应完成后，取反应产物3PL在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳(I XTAE电泳缓冲液，电压200V，恒压电泳5min)，凝胶成像系统拍摄电泳图谱。扩增成功的产物采用Sanger’s测序法测定DNA序列(Invitrogen);另取30μ?反应产物在2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳(I X TAE电泳缓冲液，电压100V，恒压电泳lOmin)，然后采用胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，并用微量紫外分光光度计测定其浓度。
[0030]参考产品说明书，将纯化的B7-H3基因3’ -UTR片段克隆到pGEM_T载体；热转化大肠杆菌TPlO感受态细胞，进行蓝白斑筛选。挑取白斑摇菌，抽提质粒；PCR扩增及酶切鉴定后再进行测序验证。将测序正确的重组子用油al酶切后，回收3’ -UTR片段。
[0031]用PGL-3和pRL-TK载体质粒转化常规制备的大肠杆菌TPlO感受态细胞，进行大量扩增；试剂盒抽提法大量制备PGL-3和pRL-TK质粒，电泳检测质粒的纯度和含量。用限制性内切酶对提取的PGL-3质粒进行酶切，试剂盒直接回收大片段的酶切产物。参考产品说明书，将酶切回收纯化后的B7-H3基因3 ’ -UTR片段按适当比例与pGL_3载体的Xba I酶切片段进行连接反应，16° C酶连过夜。取10 μ L连接产物直接转化100 μ L大肠杆菌TPlO感受态细胞。经过含有氨苄青霉素的LB平板固体培养基中选择培养。从转化子的平板上随机挑取10个菌落，经过含氨苄青霉素的LB液体培养基扩增培养；经PCR扩增、酶切和测序鉴定后，用试剂盒抽提质粒备用。
[0032]5、细胞转染
首先，将培养于含有10% FCS、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640完全培养基中细胞株，按I X IO4个细胞/孔的量在24孔板中接种指数生长期的细胞，培养过夜，直到细胞80%汇片。[0033]然后，将一定量的hsa-miR-378、B7-H3/3 ' _UTR/pGL3重组质粒和内参质粒pRL-TK稀释至50 μ L不含血清和抗生素的0pt1-MEM?I培养基中，用移液枪混合均匀；然后将I μ L脂质体2000悬液加入50 μ L不含血清和抗生素的Opt1-MEMsI培养基中，在室温孵育5min ;最后将两者混合在一起，充分混匀，静置20min，使hsa-miR-378、重组质粒和内参质粒与脂质体充分结合。将只加脂质体的孔作为阴性对照。
[0034]最后，吸去接种到24孔板中的培养液，用不含血清和抗生素的0pt1-MEM?I培养基洗一次，在每个孔中加入100 μ L上述混合物，培养3h ;吸弃培养板中的转染培养液，向各孔加入100 μ L有血清无抗生素的Opt1-MEMsI培养基，继续培养24h后进行检测。
[0035]6、双荧光素酶报告系统基因活性测定
将转染有PGL-3和pRL-TK的CHO细胞经过24h培养后收集，吸弃培养基，用PBS洗I次。加入裂解液20 μ L/孔，室温摇动15 min0按照双荧光素酶检测试剂盒的操作说明书，取100 μ L突光素酶分析缓冲液II于1.5ml离心管中，设定化学发光仪延迟2sec,发光仪测读IOsec ;将全部细胞裂解液加入到离心管中，用移液枪轻轻抽吸2-3次混匀(不要旋涡振动)；将离心管放入化学发光仪中测读萤火虫荧光素酶发光值Fl ;将离心管移出发光仪，加AlOOuL Stop&Glo试剂，快速旋涡混匀后，将离心管重放回发光仪中测读海肾荧光素酶发光值F2。应用SPSS.10统计软件的卡方检验分析受试组与空白对照组的F1/F2比值差异，以判断hsa-miR-378的调控作用。
[0036]三、结果
1.hsa-miR-378在结直肠癌组织中的表达显著低于正常组织采用实时荧光定量PCR技术测定了 6例结直肠癌组织和正常组织中miRNA的表达；统计分析发现，hsa-miR-378在结直肠癌组织中的表达显著低于正常组织，结果如图1所示。
[0037]2.hsa-miR-378 与 B7-H3 基因 3’ -UTR 结合
我们采用生物信息学软件miRanda预测发现，hsa-miR-378可能与B7-H3基因3’ -UTR结合，结果如图2所示。
[0038]3.构建B7-H3/3’ -UTR/pGL-3荧光素酶表达载体
PCR扩增得到长度为640bp的B7-H3基因3’ -UTR序列(图3)，切胶纯化回收后，将片段插入pGEM-T载体，转化感受态大肠杆菌。随机挑克隆扩增后提取质粒DNA。经过油al酶切鉴定，证实酶切后得到的基因片段与预期大小628bp相符(图4)。测序结果表明，插入PGEM-T载体的B7-H3基因3’ -UTR片段序列正确，如图5所示。抽提pGEM_T载体，酶切获得B7-H3基因3’ -UTR片段；将其插入pGL_3载体，然后转化感受态大肠杆菌。酶切后得到的基因片段与预期大小628bp相符(图6);测序结果证实插入序列正确(图7)。
[0039]4、hsa-miR-378抑制重组荧光素酶表达活性
将200ng重组B7-H3/3’-UTR/pGL-3荧光素酶表达载体、20ng内参质粒pRL_TK与IOpmol hsa-miR-378共同转染CHO细胞后，采用荧光素酶活性检测试剂盒检测转染培养后CHO细胞中荧光素酶的活性。结果显示，在CHO细胞中加入hsa-miR-378后，荧光素酶的活性比值(pGL-3/pRL-TK)显著低于不加hsa-miR-378的细胞(图8)。由此表明，hsa-miR-378通过与B7-H3基因3’ -UTR上靶序列结合，抑制了荧光素酶的表达。
[0040]上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内 容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 微小RNA用于调控B7-H3基因表达，其特征在于，所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体:5’ -ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3’。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA能与B7-H3基因3’_UTR结合，调控B7-H3基因表达。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA为miR-378。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA通过化学合成而得。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA来自生物体样本，包括组织、细胞和外周血。
【文档编号】C12N15/113GK103571838SQ201210252622
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2012年7月20日
【发明者】汪维鹏, 朱健洁, 张学光 申请人:苏州大学