专利名称：一种禽腺病毒转移载体及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种载体，具体来说是一种禽腺病毒转移载体及其制备方法。
背景技术：
腺病毒是目前动物病毒中在形态和化学结构上发明得最为详细的病毒之一，其主要原因是腺病毒没有囊膜，衣壳结构清晰，易在电子显微镜下仔细观察，核酸和蛋白质易分离。而且近年来，部分血清型的腺病毒基因组结构、复制、转录特征已发明得相当清楚，特别是一些腺病毒载体在临床上的成功应用，使得以重组腺病毒为载体参与基因治疗与基因免疫受到普遍重视。
腺病毒作为基因转移载体被广泛应用于基因治疗及重组疫苗发明等领域，但多方面因素阻碍了人腺病毒(hAd)载体作为人和动物基因治疗载体和重组活疫苗的应用，包括人体内预存中和抗体、复制缺陷型和野生型人腺病毒间互补/重组循环污染载体、多种血清型人腺病毒可在动物细胞中复制等。开发动物腺病毒载体可能会解决上述问题。某些动物腺病毒具有转导人源细胞中的能力，并且动物腺病毒由于具有高度种属特异性，虽能进入人体细胞却不能在其中复制繁殖，缺乏与人腺病毒的同源性不会发生共复制和重组，人体内也不存在预先针对它们的免疫应答。因此，应用非人腺病毒载体，结合免疫抑制策略可能成为基因治疗可供选择的途径。对动物而言，以其自身种属的腺病毒载体作为兽用重组疫苗会比用hAd载体更为有效。因此，开发动物腺病毒载体用于基因转移，将具有广阔的应用前景。目前发明得较多的动物腺病毒有牛、猪、犬、鼠、禽类等。近几年来，利用禽腺病毒做载体已成为禽病疫苗发明的热点。禽腺病毒属主要包括过去根据群特异性抗原差异分类的I群禽腺病毒，包括传统禽腺病毒及分尚自鸡、火鸡、鹅和其它禽类的腺病毒，共12个血清型，享有一种共同的群抗原。由于I群禽腺病毒多数呈隐性感染，不引起明显临床症状， 被认为是活病毒载体的候选株。
禽腺病毒载体与其他病毒载体比较，具有许多独特的优点⑴致病性低，安全性好，在机体内复制不整合到宿主细胞染色体中，无插入致突变性，未发现其与人类肿瘤的发生有直接关系。⑵靶细胞种类较为广泛，并且能感染繁殖期、静止期和高度分化的细胞和高水平表达外源基因，并且在受体细胞中能高效复制。⑶腺病毒粒子相对稳定，就目前常用载体的血清型而言，病毒基因组重排频率低，外源基因片段插入片段在病毒连续复制几个周期后一般仍保持不变，腺病毒基因组相对易于进行重组DNA技术操作。⑷可以在肠道及呼吸道繁殖，可制成药囊经口服途径接种，应用方便。(5)能在鸡胚或细胞中有效增殖，病毒滴度高。(6)禽腺病毒基因组较大，插入大片段外源性基因的潜力大。
在较早的 发明中，对CELOV基因组的限制性片段图谱和病毒结构蛋白已有详细报告。Susanna Chiocca等完成了 I型禽腺病毒代表种鸡胚致死孤儿病毒CELOV的基因组全序列测定工作。编码主要的病毒结构蛋白的基因(III a、pentonbase、hexon、p VI和P VID以及编码52k、IOOk蛋白的基因、E2区基因、IV a2基因，均在基因组预期位置出现。
Anne-1sabelle Michou等对禽腺病毒CELOV基因组进行突变发明，结果鉴定了一系列可被缺失但需通过反式提供调节因子修复复制的病毒复制必需区和一个复制非必需区。此外，该发明还证实CELO载体可以与Ad5 —样有效转导多种哺乳动物细胞，有望替代基于Ad5载体用于哺乳动物转基因发明。同时由于禽腺病毒与牛、羊、犬等其他动物腺病毒一样，对人源细胞天然存在复制缺陷，即使在人腺病毒存在的情况下，也不能在人源细胞内大量复制存在，因此有较高的生物安全性。
DY Logunov等探讨了利用禽腺病毒CELOV载体作为转基因工具的可能性。他们构建了一系列重组CELO病毒并证实即使在体内已有针对Ad5的免疫反应的情况下它们也能很好的将基因转入各种器官内。产生的CEL0-p53载体修复了 p53抑制肿瘤活性的功能，它们既能在体外人的肿瘤细胞中也能在移植裸鼠体内的异种移植物中发挥抗肿瘤活性，在裸鼠身上甚至伴随抑制肿瘤生长的作用。
非人源腺病毒载体在基因治疗方面具有较好的免疫学特性，但常常不能有效转导人源细胞。Stevenson等探索了用非基因性的聚合体包装CEL0V，并用碱性成纤维生长因子 (bFGF-pc-CEL01uc)重建革巴向，实现了有效的革巴向性改造。Claire Barra等为开发辅助病毒依赖型CELOV载体用作禽源疫苗，初步鉴定了 CELOV的顺式作用元件。结果表明基因组左末端nt200-250和nt250_300的区域对病毒包装分别起着很重要和必需的作用。
综上所述，许多抗原基因已成功克隆到禽腺病毒载体并有效表达，动物实验也证实重组禽腺病毒能诱导较高水平的抗体，攻毒保护效果良好，并具有很好的安全性，因此， 禽腺病毒可作为基因工程重组疫苗载体的良好候选者。但以往对于禽腺病毒的研究多仅限于代表株CEL0V，其它血清型的毒株作为重组疫苗载体的潜力还有待于发掘。本研究在前人研究的基础上，参照CELOV基因组对FAV-1 AV208株的复制非必需区及其侧翼序列进行了研究，并发明了一种新的重组禽腺病毒转移载体。
腺病毒载体活疫苗是近年来的发明热点，目前常用的腺病毒载体构建方法主要有体外直接连接或体内同源重组两种方法。
1.体外直接连接法
通过在体外直接连接病毒基因组和经限制性内切酶处理的包含目的基因的基因组小片段，然后将连接产物转染相应的细胞系，可以构建腺病毒载体。如Clontech的 Adeno-X腺病毒包装系统。这种构建方法需要进行低效率的大片段连接，而且腺病毒基因组与穿梭载体通常缺乏合适的单一酶切位点需要人工引入，因此对克隆经验要求较高。
2.体内同源重组法
⑴真核细胞内同源重组法
将包含有大部分腺病毒基因组序列(通常缺失El区)的病毒DNA两端ITR相连成环状，并插入细菌质粒的复制原片段可构建成腺病毒基因组大质粒。该环状腺病毒DNA具有复制起点及抗性，能以质粒DNA形式在细菌内复制，并且由于细菌质粒的插入其总基因组长度超过包装限度，在细胞内将不会被包装成病毒 粒子。另一个质粒是穿梭载体，含有腺病毒左侧的ITR、包装信号等顺式作用元件以及目的基因表达盒和腺病毒基因组的左端一段序列(通常缺失El区)。将腺病毒基因组大质粒与穿梭质粒共转染表达El区基因产物的包装细胞系(如293细胞)，通过同源重组可形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。该方法的缺点是重组效率低，筛选周期较长，这些都限制了腺病毒载体技术的广泛使用。虽说如此，但因被证明相当有用，此方法仍是构建腺病毒载体的常用方法。目前应用于临床的腺病毒载体大都是以这种方法构建的。因此，若是构建重组腺病毒的最终目标是成功地应用于临床还是以这种方法为佳。
(2)利用重组酶系统的位点特异性重组
位点特异性重组(site-specific recombination)是发生在两条DNA链特异性位点上的重组，重组的发生需要一段同源序列即特异性位点(又称附着点attachmentsite)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶只能催化特异性位点间的重组，具有高度保守性，又称保守重组。这种位点特异性重组构建方法包括了在293细胞内或细菌内进行重组两种。Microbix的AdMax腺病毒包装系统是在293细胞内进行重组,该方法的工作原理又回到了真核细胞内双质粒共转染，只是在转染时利用了重组酶系统。
另一种是在细菌内进行位点特异性重组。将腺病毒全长DNA序列克隆入柯斯质粒中，获得具有细菌中复制必需元件的环状腺病毒基因组，转化大肠杆菌，在细菌中扩增柯斯质粒，然后将外源基因片段插入到带适当抗性基因的真核表达质粒中，将柯斯质粒与真核表达质粒利用Cre/loxP重组酶系统在大肠杆菌内发生同源重组，用这种方法可缺失任何区段的腺病毒DNA。但Cre重组酶为美国杜邦公司专利产品，国际上仅有为数不多的几家实验室享有使用这种重组酶的特权，因此以该酶为基础构建的腺病毒载体现在还难以推广。 另外，载体的结构和包装效率不稳定，使其大规模生产受到限制。
⑶细菌内同源重组法
这种方法的基本策略是将携带有外源基因的腺病毒穿梭质粒与包含全部(或右侧大部分)腺病毒基因组DNA的骨架质粒共转化RecA+细菌，在细菌RecA重组酶的作用下经同源重组获得重组腺病毒基因组质粒。这种方法目前已被许多实验室采用制备重组腺病毒，但同样存在重组率低的问题，还可能存在假阳性(非特异性重组)，要反复鉴定。并且由于在大肠杆菌中腺病毒序列的遗传选择压力较小，发生突变导致腺病毒活力下降的可能性就大大高于前面提到的真核细胞内重组的方法。
发明内容
针对现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种禽腺病毒转移载体及其制备方法，本发明一步引入完整的外源基因表达盒和添加适当的酶切位点，对复制非必需区做了较大程度的缺失，以便于容纳更大片段的外源基因，极大的减少了工作量，提高了重组的效率。
本发明一种禽腺病毒转移载体，由一个载体构成，在所述的载体中插入有 FAV-1AV208株非必需区的左侧翼序列nt39294_40064和右侧翼序列nt43045 — 43747。
进一步的，所述的载体为TOC18质粒，所述的FAV-1 AV208株非必需区的左侧翼序列nt39294-40064插入在PUC18质粒的EcoR I和Spe I酶切位点之间，所述的FAV-1AV208 株非必需区的右侧翼序列nt43045 — 43747插入在I3UClS质粒的Spe I和Hind III酶切位点之间。
进一步的，在 所述的FAV-1 AV208株非必需区的左侧翼序列nt39294_40064和右侧翼序列nt43045 — 43747之间插入有基因片段，所述的基因片段是一个含有hCMV、MCS、 eGFP、SV40早期转录polyA信号在内的1603bp的序列片段。
进一步的，所述的基因片段通过Spe I酶切位点分别和所述的FAV-1 AV208株非必需区的左侧翼序列nt39294-40064和FAV-1 AV208株非必需区的右侧翼序列nt43045 — 43747连接。
进一步的，所述载体的基因序列如SEQ ID N0:11所不。
本发明还提供了一种宿主细胞，含有上述的禽腺病毒转移载体。
本发明还提供了上述的禽腺病毒转移载体的制备方法，包括一个从感染 FAV-1AV208株禽腺病毒的LMH细胞中获得禽腺病毒基因组的步骤；还包括一个PCR扩增禽腺病毒复制非必需区的步骤，在一个PCR扩增禽腺病毒复制非必需区的步骤中，选取 FAV-1AV208株nt39294-40064及nt43045-43747的序列片段作为欲缺失复制非必需区的左侧翼序列片段和左右侧翼序列片段，采用引物SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6扩增左侧翼序列片段，采用引物SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8扩增右侧翼序列片段；还包括一个中间载体的构建及鉴定的过程，依次将欲缺失复制非必需区的左侧翼序列片段、右侧翼序列片段克隆至pUC18质粒，构建携带左右同源重组臂的中间载体pUC-L-R ;还包括一个eGFP基因表达盒的PCR扩增、克隆的步骤，在一个eGFP基因表达盒的PCR扩增、克隆的步骤，设计引物 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10，扩增包括 hCMV、MCS、eGFP、SV40 早期转录 polyA 信号在内的基因表达盒，基因表达盒与PMD18-T载体连接并转化大肠杆菌感受态，提取质粒后测序， 命名为pMD-eGFP载体；还包括一个表达eGFP蛋白的转移载体pUC_LR_GFP的构建步骤，将 pMD-eGFP载体与pUC-L-R载体同时进行Spe I酶切后连接，并转化大肠杆菌感受态，得到转移载体 pUC-LR-eGFP。
进一步的，在一个PCR扩增禽腺病毒复制非必需区的步骤中，通过PCR扩增得到的左、右同源重组臂分别经EcoR I /Spe I和Spe I /HindIII双酶切后，与经EcoR I /HindIII 双酶切处理的PUC18质粒相连接，这样同源重组臂之间通过共有的Spe I位点相连接，缺失了两者之间的2980bp欲缺失的复制非必需序列。
进一步的，还包括一个对转移载体pUC-LR-eGFP进行鉴定及测序的步骤，在一个对转移载体pUC-LR-eGFP的鉴定及测序的过程中，先后利用菌落PCR和酶切的方法对EGFP 表达盒的连接方向进行筛选鉴定和确认鉴定，得到阳性克隆后测序，测序结果返回后，利用生物学软件DNASTAR对转移载体的核苷酸序列进行比对。
本发明还提供了一种重组病毒，通过同源重组，在所述的FAV-1 AV208株中用包含含有hCMV、MCS、eGFP、SV40早期转录polyA信号在内的表达盒替代了复制非必需区 2980bp的序列片段。
常用的多种重组腺病毒系统各有优缺点，尤其在载体构建的操作复杂性和包装效率上存在差异，很难有一种方法完全通用于各种重组腺病毒的构建。本发明选择了新的亲本毒株、改进了载体构建方法，并且在构建载体的过程中对FAV-1的复制非必需区做了最大限度的缺失，以便于容纳更大的外源基因，期望将FAV-1构建成更适合禽类疫苗研制的基因转移载体。
本发明构建了 FAV-1 AV208株通用转移载体pUC_LR_GFP，作为与亲本病毒同源重组的材料。除了将非必需区的侧翼序列克隆入载体外，还插入了带hCMV IE启动子、多克隆位点，增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)、SV40早期转录Poly A信号的完整表达盒。不仅可 以利用绿色荧光蛋白直接标记表达的融合蛋白，还可以方便带有常用酶切位点的外源基因插入表达，为获得表达绿色荧光蛋白的重组禽腺病毒奠定了基础。
在禽腺病毒载体的发明中，常用FAV-1代表种CELOV作为病毒活载体疫苗研制的候选株。现已完成CELOV全基因组的序列测定和转录图谱，并确定了 CELOV基因组的数个复制非必需区，可用于外源基因插入。本发明选用FAV-1构建重组禽腺病毒载体。由于 FAV-1未完成全基因组测序，在探索FAV-1 AV208株的复制非必需区时，参考GenBank中 CELOV的基因组序列和前人对CELOV复制非必需区的发明。在重组病毒的构建中，外源基因的插入位点必需是病毒复制的非必需区，可以尽量保证重组病毒与野生病毒有相似的生长特性。现已确定的CELOV数个复制非必需区中，在CELOV右末端区域(nt40065-43684) 是目前已鉴定的最大复制非必需区，覆盖了 0RF9、0RF10、ORFll等三个读码框，且上下链的前后基因读码框的核苷酸序列没有重叠。利用这一区域构建CELOV基因转移载体，成功表达了许多外源蛋白。在选定了复制非必需区后，针对CELOV基因组设计特异性引物，用PCR 可扩增出FAV-1基因组中包括欲缺失的复制非必需区及侧翼序列在内的目的基因组大片段。获得该基因组大片段的序列信息后，利用相同的方法可以扩增出同源重组臂。通过这种方法，可以方便的获得欲缺失的复制非必需区两侧的同源重组臂。构建用于重组的转移载体时，同源重组臂应达到一定长度，理论上重组臂越长重组几率越高。根据前人的发明结果，同源重组臂长度在100bp-1000bp长度就可发生同源重组。本发明设计的左右两端的同源重组臂分别为771bp和703bp，保证了较高的同源重组效率。本发明选用的构建转移载体的骨架质粒PUC18全长仅2686bp，骨架质粒越小，将越容易转染。
本发明在外源基因表达盒的设计中，不仅插入了报告基因方便重组病毒的筛选， 还引入了多克隆位点(MCS)将转移载体构建成通用型载体，方便外源基因的插入。GFP是一种天然荧光蛋白质，性质稳定，灵敏度高，而且作为融合蛋白指示外源基因表达时并不影响目的蛋白的性质，对细胞也没有毒性作用。转移载体和重组病毒带有绿色荧光蛋白基因后， 可在显微镜下直接观察转染和感染的效率。尽管做了较大程度的缺失，重组腺病毒的包装容量仍是有限的。而源自质粒pEGFP-Nl的包括EGFP基因、CMV启动子、MCS和polyA信号在内的各种表达元件加起来才1603bp，可一并克隆至转移载体。本发明中引入的MCS在用于重组病毒的外源基因插入时有四个酶切位点不可用，两个为同源重组臂与骨架载体的两末端接头EcoR I和Hind III，两个为同源重组臂上左臂上的Kpn I和右臂上的Nhe I位点。 因为只有在EGFP表达框和缺失复制非必需区的腺病毒基因组上均不存在而在MCS上存在的酶切位点才能成为单一酶切位点，用于外源基因插入。在非必需区的缺失策略上，本发明在两同源重组臂靠近缺失区域的一端引入了相同的酶切位点，同源重组臂之间可通过共有的酶切位点相连接缺失掉中间的复制非必需区。
LMH作为一种肝癌细胞系，可以很好的转染病毒基因组与质粒。本发明得出最佳 MOI值为0. 01时，FAV1-AV208株在LMH细胞系上增殖仍能得到较高滴度。无论是I型禽腺病毒在LMH细胞系上较高的繁殖适应性，还是病毒对该细胞系的最佳感染复数数值偏低，都表明 LMH细胞系作为肝上皮细胞，可能表达较高水平的禽腺病毒受体。禽腺病毒载体作为基因免疫的转移工具将具有广阔的前景。
在真核细胞内同源重组存在着重组几率低的缺点，因为外源基因的降解和其它一些因素强烈地减少了重组病毒的产生。必需通过优化各种与重组有关的实验条件来提高重组机率。重组是在病毒基因组复制时与周围大量存在的携带同源重组臂的转移质粒发生的，所以保证亲本病毒在细胞系上的旺盛复制和转染进足够量的质粒无疑将提高重组病毒获得的概率。本发明确定了亲本病毒对该细胞系的最佳Μ0Ι。转染条件包括转染用质粒纯度和浓度、转染试剂的选择、细胞的转染时机、转染时细胞的密度、转染试剂体积与质粒DNA 质量比(P/N比)等。OMEGA公司提供的去内毒素的质粒提取试剂盒，保证了转染用质粒理想的纯度和浓度。良好的细胞状态是成功转染的基础。最适合的转染时机是对数生长期的细胞，此时细胞生长旺盛，感染病毒后基因组复制也最频繁。细胞密度也是转染时需要严格控制的因素，细胞适当密集虽然有助于病毒的增殖，但可能导致转染效率降低，因为质粒转染是在细胞表面完成的，故最好选择均匀生长的单层细胞。不同的转染试剂对转染时的最适细胞密度要求也不同。本发明选用的脂质体转染试剂，由于具有轻微的细胞毒性，故转染时要求90%的细胞密度。P/N比是影响转染效率的重要因素。在一定剂量范围内转染效率与 P/N比成反比关系，超过一定量后脂质体毒性增加，转染效率下降。因此需要根据转染试剂说明书推荐的比例进行预实验，确定转染的最佳P/N比。
pUC-LR-eGFP转移质粒因不能在真核细胞内复制且随细胞传代丢失，故在转染 LMH细胞时属于瞬时转染。该质粒DNA不整合到LMH细胞的染色体中，在转染后的细胞中存在多个拷贝数，能产生高水平表达，但仅能持续数天。而重组腺病毒却能源源不断地在细胞上繁殖和表达绿色荧光蛋白，因此经过传代筛选后，在显微镜下仍呈现绿色荧光的细胞簇即被重组病毒感染的细胞。本发明中，挑取呈现荧光簇的细胞培养物在LMH细胞上传代第3 次后，荧光镜下仍能观察到细胞走向的特异性荧光簇或散在荧光，说明重组病毒构建成功。
本发明成功构建了复制非必需区缺失的重组禽腺病毒AV208株转移载体并获得了纯化的含有EGFP报告基因的重组rFAV1-eGFP，对其克隆纯化方法进行了优化，经鉴定该重组病毒生物学特性稳定，证明所构建的通用转移载体具有广泛的应用价值，为进一步开展禽腺病毒活载体疫苗研制等相关基础发明提供了技术平台。
在以往的发明中，一般需要通过多步PCR进行序列突变、酶切、连接用以缺失复制非必需区，所有中间载体和转移载体的获得也需要复杂的克隆过程。本发明通过一步引入完整的外源基因表达盒和人为地添加适当的酶切位点，改进了载体构建方法，极大的减少了工作量。而且本发明对复制非必需区做了较大程度的缺失，以便于容纳更大片段的外源基因。本发明通过选择新的亲本毒株和改进载体构建方法，期望将pUC-LR-eGFP构建成更适合禽类疫苗研制的基因转移载体。
图1显示了 LMH细胞形态呈典型恶性上皮细胞特征，其中AX100 ;BX400。
图2显示了 FAV1-AV208在LMH细胞系上的病变，其中AX100 ;BX400。
图3显示了 FAV1-AV208株在LMH细胞培养物中生长曲线。
图4显示了病毒浓度与形成蚀斑数关系。
图5显示了转移质粒pUC-LR-eGFP的构建示意图。
图6显示了 4111bp片段扩增结果，其中M为IOKb DNA Maker，I为扩增产物，2为阴性对照。
图7显示了 442bp片段扩增结果 ，其中M为IOObp DNA Maker, I为阴性对照，2为扩增产物。
图8显示了测序结果和Blast结果。
图9显示了 703bp、771bp片段扩增结果，其中:M为150bp DNA Maker, I, 2为扩增产物。
图10显示了双酶切及PCR结果，其中1为5000bp DNA Maker，2为EcoRI+Spel双酶切，3为Spel+Hind III双酶切，4为EcoRI+Hind III双酶切，5为PCR阴性对照，6为PCR产物。
图11显示了 1603bp片段扩增结果，其中M为5000bp DNA Maker, I为阴性对照， 2为扩增产物图。
图12显示了菌落PCR结果，其中:M为5000bp DNA Maker，I为PCR阴性对照，3-11 为PCR产物。
图13显示了双酶切结果，其中M为5000bp DNA Maker, 1,3为Pstl+EcoRI双酶切2、4为未酶切阳性质粒克隆。
图14显示了测序结果和Blast结果。
图15显示了质粒pUC-LR-eGFP与脂质体不同转染比例下48h时EGFP的瞬时表达， 其中A表示4ug质粒/IOul脂质体，B表示4ug质粒/8ul脂质体，C表示3ug质粒/8ul脂质体，D表示3ug质粒/6ul脂质体，E表示2ug质粒/6ul脂质体，F表示2ug质粒/4ul脂质体。
图16显示了质粒pUC-LR-eGFP与脂质体不同转染比例下48h后eGFP的瞬时表达。
图17显示了质粒pUC-LR-eGFP与脂质体转染后72h后可见LMH细胞的病变。
图18显示了细胞培养物在LMH上传代时的荧光，A表示第一代rFAV1-eGFP病毒在 LMH上的荧光，B表示第二代rFAV1-eGFP病毒在LMH上的荧光，C表示第三代rFAV1-eGFP 病毒在LMH上的荧光，D表示第一代转移质粒转染对照在LMH上的荧光。
图19显示了荧光显微镜下观察到的rFAV1-eGFP在LMH细胞上形成的蚀斑 (100X)。
图20显示了重组病毒的PCR鉴定结果。
图21显示了 rFAV-1-eGFP与AV208在LMH细胞的生长曲线。
图22显示了 rFAV-1-eGFP和AV208在LMH细胞上形成的细胞病变(100X)，其中 A为正常LMH细胞；B为rFAV-1-eGFP在LMH细胞上形成的细胞病变；C为AV208在LMH细胞上形成的细胞病变。
图23是转移质粒pUC18-LR_eGFP的示意图。
图24是载体pEGFP-Nl的图谱。
图25是载体pEGFP-Nl的部分序列图。
具体实施例方式
实施例1I型禽腺病毒AV208株
I材料与方法
1.1 材料
I型禽腺病毒AV208株，购自中国兽医药品监察所，在鸡胚肾细胞(CEK)上的 TCID50为105. 5/0. 5mL。鸡肝癌细胞系(LMH)来自复旦大学医学分子病毒学教育部重点实验室。DMEM/F12培养液、胎牛血清、抗生素、胰蛋白酶均购自GIBCO公司。低熔点琼脂糖购自PR0MEGA公司。
1. 2LMH细胞的培养及形态学观察
LMH细胞用含10%胎牛血清、100U/mL青链霉素的DMEM/F12培养液培养，观察细胞形态。为摸索该细胞系培养条件，将LMH细胞以1:3、1:4、1:5、1:6比例传代，以血清浓度为2%、4%、6%、8%、10%的培养液，分别于37° C、5%C02下培养。
1. 3病毒不同接毒剂量对LMH细胞感染试验
将LMH细胞以I X IO VmL密度接种96孔细胞板，约24h培养基颜色变为橙红色， 细胞开始进入对数期。按1.3中病毒接种细胞方法，取FAV1-AV208种毒以维持液连续 10倍梯度(I(T1-KTn)稀释后接种96孔板，最后一列不接毒作为正常细胞对照(平行做2 块96孔板)，按Reed-Meunch方法计算种毒对LMH细胞的TCID50。
将LMH细胞以3X 105/mL密度接种6孔细胞板，约36h培养基颜色变为橙红色， 细胞开始进入对数期。消化一孔待感染的细胞，稀释混匀后进行细胞计数。FAV1-AV208 种毒以1:100、1:1000、1:5000、1:10000、1:50000及1:100000比例稀释后各接种6孔板上 3个复孔，观察各稀释度接毒孔病变情况，摸索病毒对LMH细胞最适感染剂量。
1. 4FAV1-AV208接种LMH细胞病变观察
取生长成致密单层的LMH细胞，弃去细胞生长液，以2%血清浓度的维持液稀释种毒液，以最适感染剂量接种细胞。37° C吸附2h，弃病毒吸附液，重新加入维持液，37° C 继续培养，每天于倒置相差显微镜下观察CPE变化，待85%以上LMH细胞出现CPE后收毒。
1.5FAV1-AV208在LMH细胞上的生长曲线
按1. 4中病毒接种6孔板细胞方法，种毒以1:1000稀释度接种6孔板各孔(平行做2块6孔板)，在接毒后12、24、36、48、60、72h收细胞培养物各一孔，冻融3次，取病毒悬液按Reed-Meunch法计算不同收毒时间病毒的TCID5tl,并绘制病毒在细胞上的生长曲线。
1. 6病毒接种物浓度与蚀斑形成数量的关系
将病毒滴度为105_5TCID5tlA).1mL的种毒液以维持液连续10倍稀释，接种于6孔板上长成单层的LMH细胞上(平行做2块6孔板)，按蚀斑制备方法，37° C吸附2h，弃掉病毒吸附液，覆盖预热的第一层营养琼脂(终浓度为1%低熔点琼脂糖、2. 5%胎牛血清的I XDMEM/F12)，72h后铺第二层营养琼脂(终浓度为1%低熔点琼脂糖、2. 5%胎牛血清、O.01%中性红的I XDMEM/F12)，第5天后每天检查蚀斑形态及数目，直至数目不变为止， 计算各剂量病毒悬液所含的平均蚀斑形成单位。
2 结果
2.1LMH细胞的基 本特性
在倒置相差显微镜下观察LMH细胞形态。LMH是贴壁细胞系，呈典型上皮细胞特征，该细胞系保持了鸡肝细胞分化的大量表型特征。镜下观察在生长密度较小时细胞形态为树突样，单个生长时甚至可呈梭形、三角形，细胞间突起连接清晰可见；生长密度较大时细胞呈扁圆铺路石样结构，排列紧密，接触性抑制丧失，易长成双层，如图1所示。
将LMH细胞以1:3或1:4传代时，细胞接种密度偏大，生长速度过快，培养2天细胞即已长向双层；此比例下细胞传代过于频繁，导致细胞分裂状态、形态不一，不利于实验后续操作。而将LMH细胞以1:5或1:6传代时，细胞约3d长满单层，状态良好，此传代比例较合适。采取1:5比例传代，以10%血清浓度培养的细胞在第3天已长满单层；8% 和6%血清浓度下细胞在第4天长满单层，但细胞生长时疏密有间，即细胞稍密处生长较快，细胞稍稀处生长较慢；而4%和2%血清浓度下细胞在第5天仍未长满单层，细胞扎堆生长明显，细胞较密处已长成两层，细胞较稀处仍有空隙，且2%浓度下细胞间空隙比4% 大。故该细胞系的最适培养条件为以10%血清的培养基以1:5传代比例培养，3d即可长满单层。血清浓度低于4%时，细胞生长缓慢，细胞维持液可采取2%血清浓度的培养液。
2. 2病毒不同接毒剂量对LMH细胞感染试验
FAV1-AV208种毒对LMH细胞的TCID50为IO5.5/0.1mL0 1:100稀释度的病毒剂量在接种后48-60h，90%以上的细胞出现明显CPE;以1:1000稀释度的病毒剂量在接种后 72h，CPE较明显;而1:5000稀释度的接毒剂量在接毒后84h-96h病变明显;1:10000和 I 50000稀释度的病毒剂量5天内出现轻微CPE;而1:100000稀释度在5天内未出现CPE。 故将种毒以1:1000稀释接种LMH细胞，约72h出现CPE，为较合适的病毒感染剂量。6孔板单孔细胞计数结果为1. 2X IO6个，则FAV1-AV208感染LMH细胞系的最佳感染复数为 O. 01。
2. 3FAV1-AV208接种LMH细胞病变观察
FAV1-AV208以1:1000稀释度接种LMH细胞，72h即产生明显的细胞病变(CPE)， 病变特征为细胞变大变圆，集聚成不规则的葡萄串状，集聚之外的细胞间隙增大，相差显微高倍镜(X400)下可见细胞内出现类似包涵体的颗粒物，最终致细胞崩解，如图2所示。
2.4FAV1-AV208在LMH细胞上的生长曲线
细胞接毒后12、24、36、48、60、72h收取的细胞毒液，按Reed-Meunch方法测得相应毒价分别为 102 7、103_5、104、104_3、104_5、107_5TCID5Q/0. lmL。生长曲线见图 3。由图 3 可知，AV208毒株在接种后12-24h内病毒滴度未见明显增高，表现出存在潜伏期，36h病毒滴度出现增高达到104TC ID5Q/0· ImL,到72h病毒滴度增高至107 5TCID5(l/0· lmL。
2. 5病毒接种物浓度与蚀斑形成数量的关系
FAV1-AV208种毒液用维持液作10倍比稀释，每稀释度度各接种3孔细胞单层， 感染第7天开始逐渐出现肉眼可见的小空白蚀斑，至第10天蚀斑已充分发育，显微镜下细胞病变严重，蚀斑数目维持不变。病毒滴度为IO5 5TCID5tlA).1mL的种毒蚀斑形成单位为 105-7PFU/mL,这也与文献报道的TCID5tl法测得的病毒滴度对数值比标准空斑法高O. 7相一致。各稀释度蚀斑计数(见表1)，并绘制成病毒接种物浓度与蚀斑形成数量关系图。由图 4可知，病毒浓度与蚀斑形成数量呈线性相关(y=_32x+228)。
表I病毒液各稀释度蚀斑计数
权利要求
1.一种禽腺病毒转移载体，由一个载体构成，其特征在于在所述的载体中插入有FAV1-AV208株基因组非必需区的左侧翼序列nt39294-40064和右侧翼序列nt43045 — 43747。
2.如权利要求1所述的一种禽腺病毒转移载体，其特征在于所述的载体为PUC18质粒，所述的FAV1-AV208株基因组非必需区的左侧翼序列nt39294_40064插入在PUC18质粒的EcoR I和Spe I酶切位点之间，所述的FAV1-AV208株基因组非必需区的右侧翼序列 nt43045 — 43747插入在I3UClS质粒的Spe I和Hind III酶切位点之间。
3.如权利要求2所述的一种禽腺病毒转移载体，其特征在于在所述的FAV1-AV208株基因组非必需区的左侧翼序列nt39294-40064和右侧翼序列nt43045 — 43747之间插入有一个eGFP基因表达盒，所述的eGFP基因表达盒是一个含有hCMV、MCS、eGFP、SV40早期转录PolyA信号的序列片段。
4.如权利要求3所述的一种禽腺病毒转移载体，其特征在于所述的基因表达盒通过Spe I酶切位点分别和所述的FAV1-AV208株基因组非必需区的左侧翼序列 nt39294-40064和FAV1-AV208株基因组非必需区的右侧翼序列nt43045 — 43747连接。
5.如权利要求4所述的一种禽腺病毒转移载体，其特征在于所述载体的基因序列如 SEQ ID NO 11 所示。
6.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的禽腺病毒转移载体。
7.权利要求1所述的一种禽腺病毒转移载体的制备方法，其特征在于包括一个从感染FAV-1 AV208株的LMH细胞中获得禽腺病毒基因组的步骤；还包括一个PCR扩增禽腺病毒复制非必需区的步骤，在一个PCR扩增禽腺病毒复制非必需区的步骤中，选取FAV1-AV208株基因组nt39294-40064及nt43045_43747的序列片段作为欲缺失复制非必需区的左侧翼序列片段和左右侧翼序列片段，采用引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6扩增左侧翼序列片段，采用引物SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8扩增右侧翼序列片段；还包括一个中间载体的构建及鉴定的过程，依次将欲缺失复制非必需区的左侧翼序列片段、右侧翼序列片段克隆至PUC18质粒，构建携带左右同源重组臂的中间载体pUC-L-R ;还包括一个eGFP 基因表达盒的PCR扩增、克隆的步骤，在一个eGFP基因表达盒的PCR扩增、克隆的步骤，设计引物 SEQ ID NO :9 和 SEQ ID NO : 10，扩增包括 hCMV、MCS、eGFP、SV40 早期转录 polyA 信号在内的基因表达盒，基因表达盒与PMD18-T载体连接并转化大肠杆菌感受态，提取质粒后测序，命名为pMD-eGFP载体；还包括一个表达eGFP蛋白的转移载体pUC- LR- GFP的构建步骤，将pMD-eGFP载体与pUC_L_R载体同时进行Spe I酶切后连接，并转化大肠杆菌感受态，得到转移载体pUC-LR-eGFP。
8.如权利要求7所述的一种禽腺病毒转移载体的制备方法,其特征在于在一个 PCR扩增禽腺病毒复制非必需区的步骤中，通过PCR扩增得到的左、右同源重组臂分别经 EcoR I / Spe I 和 Spe I / Hind III 双酶切后，与经EcoR I / Hind III双酶切处理的pUC18 质粒相连接，同源重组臂之间通过共有的Spe I位点相连接，缺失了两者之间的2980bp欲缺失的复制非必需序列。
9.如权利要求7所述的一种禽腺病毒转移载体的制备方法,其特征在于还包括一个对转移载体pUC-LR-eGFP进行鉴定及测序的步骤，在一个对转移载体pUC-LR-eGFP的鉴定及测序的过程中，先后利用菌落PCR和酶切的方法对EGFP表达盒的连接方向进行筛选鉴定和确认鉴定，得到阳性克隆后测序，测序结果返回后，利用生物学软件DNASTAR对转移载体的核苷酸序列进行比对。
10.—种重组病毒，由一个FAV1-AV208株构成，其特征在于在所述的FAV1-AV208株中用权利要求3所述的包括hCMV、MCS、eGFP、SV40早期转录polyA信号在内的基因表达盒替代了 FAV1-AV208株基因组非必需区2980bp的序列片段。
全文摘要
本发明一种禽腺病毒转移载体，由PUC18作为骨架质粒，在PUC18载体中插入有FAVI-AV208株基因组非必需区的左右侧翼序列用以同源重组，缺失了二者之间2980bp的复制非必需区，在左右侧翼序列之间插入有一个包括hCMV、MCS、eGFP、SV40早期转录polyA信号在内的基因表达盒。本发明还提供了上述禽腺病毒转移载体的制备方法，并成功制备了重组病毒。本发明通过一步引入完整的外源基因表达盒和添加适当的酶切位点，改进了载体构建方法，极大的减少了工作量，而且对复制非必需区做了较大程度的缺失，可以容纳更大片段的外源基因。
文档编号C12N15/66GK103060376SQ20121053253
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者周洁, 赵莉, 朱妍, 高诚, 胡建华 申请人:上海实验动物研究中心, 周洁