包含mrsa pbp2a及其片段的蛋白、编码它们的核酸、以及组合物及它们预防和治疗mrsa感 ...的制作方法
【专利摘要】本发明公开了编码MRSA PBP2a蛋白或其包含至少245个氨基酸的片段的核酸分子。本发明公开了包含所述核酸分子的组合物。本发明公开了包括MRSA PBP2a蛋白或其包含至少245个氨基酸的片段的新型蛋白。本发明公开了诱导针对MRSA PBP2a的免疫应答的方法，以及治疗诊断有MRSA的个体的方法以及预防个体中MRSA感染的方法。
【专利说明】包含MRSA PBP2A及其片段的蛋白、编码它们的核酸、以及 组合物及它们预防和治疗MRSA感染的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及共有抗原性MRSA PBP2a蛋白及其上的片段和编码它们的核酸分子； 涉及包含此类蛋白和/或核酸分子的改进的MRSA疫苗；以及涉及使用所述疫苗诱导免疫应 答和预防MRSA感染和/或治疗感染有MRSA的个体的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (MSSA)是指所有抗生 素敏感性金黄色葡萄球菌株系。因此，MSSA是指导致大部分金黄色葡萄球菌感染并可用青 霉素类抗生素治疗的常见类型的金黄色葡萄球菌。相比之下，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)是指耐一系列青霉素抗生素（包括甲氧西林）的金黄色葡萄球菌的亚组。MRSA最 早在1961年在推出抗生素甲氧西林后不久就出现了。MSSA和MRSA均具有允许粘附到细胞 表面和免疫逃避/杀灭的毒力/致病性因素。为比较MRSA和MSSA的致病性而开展的研究 得到了一些相互矛盾的数据。然而，清楚的是，或许MRSA与MSSA之间最明显的差异是MRSA 的甲氧西林耐药性。MRSA的耐药性因在细菌表面上存在青霉素结合蛋白2a(PBP2a)而产 生。PBP2a蛋白由mecA基因编码。
[0004] 包括MRSA (耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的金黄色葡萄球菌感染在医院和其他医 疗保健机构（诸如疗养院和透析中心）中的人员中最常发生。这些医疗保健相关性葡萄球 菌感染包括手术伤口感染、尿道感染、血流感染和肺炎等。MRSA可导致皮肤感染，这些感染 可看起来像丘疹或疖子，并可能发红、肿胀、疼痛或具有脓液或其他引流。更严重的感染可 导致肺炎、血流感染或手术伤口感染。发生严重MRSA感染（即，侵入性）的人群的最近估 计数量为约94, 360名患者。大约18, 650人在住院期间因严重MRSA感染而死亡（约20% 的死亡率）。
[0005] 已报道了使用具有编码PBP2a或其片段的核酸序列的质粒开发抗MRSA的DNA疫 苗的努力°〇1^&(1& A等人，DNA vaccination by mecA sequence evokes an antibacterial immune response against methicillin-resistant Staphylococcus aureus，J Antimicrob Chemother. 1999 年 12 月；44(6) :767-74 描述了 DNA 质粒的肌内注射，该质粒 包含由N315MRSA分离株克隆的编码PBP2a蛋白的mecA基因 。Roth DM等人，Evaluation of the humoral immune response in BALB/c mice immunized with a naked DNA vaccine anti-methici11 in-resistant Staphylococcus aureus，Genet Mol Res. 2006 年 8 月 31 日；5(3) :503-12 以及Senna JP等人，Protective immune response against methicillin resistant Staphylococcus aureus in a murine model using a DNA vaccine approach. Vaccine. 2003年6月2日；21 (19-20) :2661-6报道了将肌内注射用于递送DNA质粒，该质 粒仅包含由HSP-03临床MRSA分离株克隆的mecA基因的249个碱基对片段。
[0006] 仍需要可用于预防或治疗MRSA感染的疫苗。仍需要编码MRSAPBP2a或其片段的 核苷酸序列，其在并入疫苗中时可以高水平表达，使得诱导针对表达PBP2a的MRSA金黄色 葡萄球菌的有效免疫应答，从而在受感染个体中提供治疗作用或对MRSA感染的长期防护。 发明概要
[0007] 本发明提供了核酸分子，其编码包括MRSA PBP2a蛋白或其包含至少245个氨基酸 的片段的蛋白。在一些实施方案中，该蛋白包含连接到MRSA PBP2a蛋白或其片段的信号肽。 在一些实施方案中，该信号肽为IgE信号肽。
[0008] 本发明提供了核酸分子，其包含与SEQ ID N0 :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白的核酸序列的片段。该片段编码与SEQ ID NO :2的片段98%同 源并包含至少245个氨基酸的蛋白的免疫原性片段，诸如具有至少245个氨基酸的SEQ ID NO :2的免疫原性片段。在一些实施方案中，该片段包括SEQ ID NO :1的片段，诸如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5。片段在一些实施方案中不含编码MRSA PBP2a跨膜结构域的编码序 列。片段在一些实施方案中可操作地连接到编码信号肽序列的编码序列，诸如IgE信号肽 序列SEQ ID N0:13。片段在一些实施方案中包括SEQ ID N0:9或SEQ ID N0:11。
[0009] 本发明提供了核酸分子，其包含与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白（诸如包含SEQ ID NO :2的蛋白）的核酸序列。在一些实施方 案中，本发明提供了核酸分子，其包含SEQ ID N0 :1，即MRSA PBP2a蛋白的合成编码序列。 核酸编码序列在一些实施方案中可操作地连接到编码信号肽序列的编码序列，诸如IgE信 号肽序列SEQ ID N0:13。核酸分子在一些实施方案中包含SEQ ID N0:7。
[0010] 包含如上所示的编码MRSA PBP2a蛋白或其包含至少245个氨基酸的片段的核酸 序列的核酸分子可以为质粒，将核酸分子并入病毒颗粒或其他表达载体。
[0011] 本发明提供了组合物，其包含被配制成使用电穿孔递送给个体的质粒或其他核酸 分子。
[0012] 本发明提供了组合物，其包含编码选自IL-12、IL-15和IL-28的一种或多种蛋白 的核酸分子。
[0013] 本发明提供了蛋白。本发明提供了与包含SEQ ID N0 :2的蛋白至少98%同源的 蛋白，以及包含与SEQ ID N0 :2的片段至少98%同源且含有至少245个氨基酸的蛋白的免 疫原性片段的蛋白。在一些实施方案中，蛋白包含SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6。
[0014] 本发明提供了诱导针对MRSA PBP2a的免疫应答的方法。一些方法包括以在个体 中有效诱导免疫应答的量向个体施用核酸分子，所述核酸分子编码MRSA PBP2a蛋白或其包 含至少245个氨基酸的片段。一些方法包括以在个体中有效诱导免疫应答的量向个体施用 蛋白。
[0015] 本发明提供了治疗诊断有MRSA的个体的方法。一些方法包括以治疗量向个体施 用编码MRSA PBP2a蛋白或其包含至少245个氨基酸的片段的核酸分子。一些方法包括向 个体施用治疗有效量的蛋白。
[0016] 本发明提供了预防个体中的MRSA感染的方法。一些方法包括以预防量向个体施 用编码MRSA PBP2a蛋白或其包含至少245个氨基酸的片段的核酸分子。一些方法包括向 个体施用预防有效量的蛋白。
[0017] 附图简述
[0018] 图1是示出了存在于金黄色葡萄球菌表面上的PBP2a蛋白的图解。该蛋白通过其 位于细胞膜中的"跨膜结构域"而锚定在细胞膜中，并且"N端延伸和非青霉素结合域"以 及"转肽酶结构域"均暴露在胞外间隙中的细胞外部上。图1还显示了 PBP2a蛋白的两种 形式，它们为包含在由本文所公开的核酸分子编码的蛋白中的PBP2a蛋白序列的实例。命 名为"完整"的形式包括全长PBP2a蛋白，其包含"跨膜结构域"、"N端延伸和非青霉素结合 域"以及"转肽酶结构域"。命名为"无锚定区"的形式为全长PBP2a蛋白的片段，其包含"N 端延伸和非青霉素结合域"以及"转肽酶结构域"。
[0019] 图2显示了以下抗体的滴度的比较数据：用编码"短"PBP2a蛋白片段的DNA疫苗 免疫的小鼠中的PBP2a特异性抗体，与用编码"无锚定区" PBP2a蛋白片段的DNA疫苗免疫 的小鼠中的PBP2a特异性抗体。
[0020] 图3显示了主链质粒pVaxl的示意图，该质粒具有经克隆以可操作地连接到CMV 启动子和BGH polyA位点的PBP2a编码序列的插入。
[0021] 图4显示了得自表达实验的结果，其中使用pVax(作为对照）以及编码PBP2a蛋 白的完整和无锚定区形式的构建体对蛋白表达水平进行比较。
[0022] 图5显示了在第0天、第14天和第28天初始/对照小鼠中或在第0天和第14天 用完整或无锚定区疫苗免疫的小鼠中的抗PBP2a IgG滴度的综合数据。
[0023] 图6显示了在第0天、第14天和第28天初始/对照小鼠中或在第0天和第14天 用无锚定区（中）或完整（右）疫苗免疫的小鼠中的抗PBP2a IgG滴度的各个数据。
[0024] 图7显示了得自初始/对照小鼠或用完整或无锚定区疫苗免疫的小鼠的数据的比 较，其中使用血清稀释度对应的IgG滴度数据的点到点（左）和最佳拟合（中）作图，以及 稀释度倒数对应的终点滴度（右）。
[0025] 图8显示了得自初始/对照小鼠或在第0天和第14天用完整或无锚定区疫苗免 疫的小鼠的IgGl (左）和IgG2a(右）在第0天和第28天的独立滴度。
[0026] 图9示出了从通过完整或无锚定区变体进行皮内（ID)免疫的豚鼠获取的IgG滴 度。
[0027] 优选实施方案的详述
[0028] 本发明提供了编码序列，其编码包括共有MRSA PBP2a或其免疫原性片段的蛋白。 这些编码序列能改善转录和翻译，包括具有以下一者或多者：低GC含量的先导序列以增强 转录;mRNA稳定性和密码子优化；在某种程度上消除可能的顺式作用序列基序（即，内部 TATA盒）。在一些实施方案中，编码包括共有MRSA PBP2a或其免疫原性片段的蛋白的编 码序列可操作地连接到编码信号肽（诸如IgE信号肽）的编码序列。本发明提供了连接 到编码信号肽（诸如IgE信号肽）的编码序列的包括共有MRSA PBP2a或其免疫原性片段 的蛋白。编码序列在个体细胞中的表达或蛋白的施用诱导免疫应答，该免疫应答识别MRSA PBP2a蛋白，包括金黄色葡萄球菌细胞表面上的MRSA PBP2a蛋白。
[0029] 在本发明的一些方面，针对MRSA PBP2a的免疫应答提供针对多种细菌株系的广泛 免疫应答。在一些实施方案中，蛋白包含全长MRSA PBP2a序列并且编码MRSA PBP2a蛋白 的核酸分子包含编码全长MRSA PBP2a序列的编码序列。在一些实施方案中，蛋白包含MRSA PBP2a序列的片段并且编码MRSA PBP2a蛋白的核酸分子包含编码MRSA PBP2a序列的片段 的编码序列。MRSA PBP2a蛋白序列可由衍生自多种来源、株系、亚型、亚种等的MRSA PBP2a 序列生成。在一些实施方案中，MRSA PBP2a序列是计算机生成的序列，其为多个MRSA PBP2a 序列的共有序列，其中该共有序列利用各位置最常见的氨基酸。在一些实施方案中，MRSA PBP2a以株系之间增强的交叉反应性提供免疫应答。
[0030] 1.定义。
[0031] 本文所用的术语只是为了描述特定的实施方案，并非旨在进行限制。如在说明书 和所附权利要求书中所用，单数形式"一"、"一个/种"和"该/所述"包括多个指代物，除 非上下文另有明确指出。
[0032] 关于本文中数字范围的引述，明确地包括相同精度的介于其间的每个居间数字。 例如，对于6-9的范围，除了 6和9以外还包括数字7和8,对于范围6. 0-7. 0,明确地包括 数字 6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9 和 7. 0。
[0033] a.佐剂
[0034] 如本文所用的"佐剂"可意指被添加至本文所述的DNA质粒疫苗以增强针对由所 述DNA质粒和下文所述的核酸序列编码的MRSAPBP2a的免疫应答的任何分子。
[0035] b.抗体
[0036] "抗体"可意指类别IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体或其片段或衍生物，包括 Fab、F(ab' ) 2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体 可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，所述 抗体显示足够的对所需表位或从其衍生的序列的结合特异性。
[0037] c.编码序列
[0038] 如本文所用的"编码序列"或"编码核酸"可意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核 酸（RNA或DNA分子）。编码序列还可以包含可操作地连接到调节元件的起始和终止信号， 包括能够指导个体或哺乳动物细胞（向该个体或哺乳动物施用所述核酸）中的表达的启动 子和聚腺苷酸化信号。
[0039] d.互补序列
[0040] 如本文所用的"互补序列"或"互补的"意指可进行核酸分子的核苷酸或核苷酸类 似物之间的沃森-克里克（例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对的核酸。
[0041] e.共有或共有序列
[0042] 如本文所用的"共有"或"共有序列"可意指基于多个MRSA序列的PBP2a序列的 比对分析而构建的合成核酸序列，或相应的多肽序列。SEQ ID N0 :2中所公开的PBP2a序 列基于 Genbank 登录号 CAA74376. 1、ADC36253. 1、CAH17594. UCAL22891. 1、AAF85645. 1 和 ABM66443. 1中的序列。对这些序列进行比对，并将在各个点最常见的氨基酸选择用于最终 抗原。当掺入疫苗中时，蛋白或编码蛋白的基因可用于诱导针对多种MRSA PBP2a变体的广 泛免疫。共有MRSA PBP2a可包含氨基酸序列和编码此类蛋白的核苷酸序列。
[0043] f.恒定电流
[0044] 如本文所用的"恒定电流"意指由组织或限定所述组织的细胞在被递送至所述组 织的电脉冲的持续过程中接收或经历的电流。电脉冲通过本文所述的电穿孔装置递送。该 电流在电脉冲的寿命过程中在所述组织中保持恒定的安培数，因为本文中提供的电穿孔装 置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。反馈元件可测量整个脉冲持续过程中组织（或细 胞）的电阻，并使电穿孔装置改变其电能输出（例如，升高电压），这样相同组织中的电流在 整个电脉冲过程（在微秒级上）以及脉冲之间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包 括控制器。
[0045] g.电流反馈或反馈
[0046] 如本文所用的"电流反馈"或"反馈"可互换使用并且可意指所提供的电穿孔装置 的主动反应，这包括测量电极之间的组织中的电流，并且相应地改变通过EP装置递送的能 量输出，以将电流维持在恒定水平。该恒定水平可由使用者在脉冲序列或电治疗开始之前 预先设置。反馈可通过电穿孔装置的电穿孔组件例如控制器来实现，因为其中的电路能够 连续监测电极之间的组织中的电流并将该监测到的电流（或组织内的电流）与预设电流相 比较，以及连续进行能量输出调整以将监测到的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬 时的，因为其为模拟闭环反馈。
[0047] h.分散电流（Decentralized Current)
[0048] 如本文所用的"分散电流"可意指来源于本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵 列的电流模式，其中所述模式最小化或优选地消除电穿孔相关热应激在被电穿孔的组织的 任何区域上发生。
[0049] i.电穿孔
[0050] 如在本文中可互换使用的"电穿孔"、"电透化"或"电动增强"（"EP"）可指使用跨 膜电场脉冲在生物膜中诱导极微通道（孔）；其存在使生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、 药物、离子和水能够从细胞膜的一侧通向另一侧。
[0051] j.反馈机制
[0052] 如本文所用的"反馈机制"可以指通过软件或硬件（或固件）进行的过程，该过程 (在能量脉冲递送之前、期间和/或之后）接收所需组织的阻抗并将其与预设值（优选电 流）进行比较，然后调整递送的能量脉冲以达到预设值。反馈机制可通过模拟闭环电路来 实现。
[0053] k.片段
[0054] "片段"可意指能够在哺乳动物中引起针对PBP2a的免疫应答的PBP2a的多肽片 段。片段可包括SEQ ID N0:2的片段。片段可包括SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:2的其他片 段，诸如SEQ ID NO :4。在一些实施方案中，片段包括SEQ ID NO :6。在一些实施方案中，片 段包括 SEQ ID N0:4。SEQ ID N0:12 包含 SEQ ID N0:6。SEQ ID N0:10 包含 SEQ ID N0: 4。片段还指与SEQ ID NO :2的同源性为98%或更高的多肽片段。片段还指与SEQ ID NO : 2的同源性为99%或更高的多肽片段。片段可包括与SEQ ID NO :6的同源性为98%或更高 的多肽片段或与SEQ ID N0 :2的同源性为98%或更高的其他多肽片段，诸如与SEQ ID N0: 4的同源性为98%或更高的多肽片段。在一些实施方案中，片段包括与SEQ ID NO :6的同 源性为98%或更高的多肽片段。在一些实施方案中，片段包括与SEQ ID NO :4的同源性为 98%或更高的多肽片段。片段可包括与SEQ ID NO :6的同源性为99%或更高的多肽片段 或与SEQ ID N0 :2的同源性为99%或更高的其他多肽片段，诸如与SEQ ID N0 :4的同源性 为99%或更高的多肽片段。在一些实施方案中，片段包括与SEQ ID N0 :6的同源性为99% 或更高的多肽片段。在一些实施方案中，片段包括与SEQ ID N0 :4的同源性为99%或更高 的多肽片段。
[0055] 其片段的长度可以为245个或更多个、250个或更多个、260个或更多个、275个或 更多个、290个或更多个、320个或更多个、350个或更多个、380个或更多个、410个或更多 个、440个或更多个、470个或更多个、500个或更多个、540个或更多个、560个或更多个、580 个或更多个、640个或更多个或660个或更多个氨基酸。多肽片段的长度可短于250个、短 于255个、短于267个、短于283、短于305个、短于335个、短于365个、短于395个、短于 435个、短于455个、短于485个、短于520个、短于550个、短于570个、短于600个、短于 650或短于665个氨基酸。片段优选地不含跨膜结构域。片段优选地包含对应于分子C端 部分的催化或转肽酶结构域的全部或一部分。片段优选地包含N端延伸和非青霉素结合域 /二聚体区域的全部或一部分。片段优选地包含对应于分子C端部分的催化或转肽酶结构 域的全部或一部分，另外还包含N端延伸和非青霉素结合域/二聚体区域的全部或一部分。
[0056] 片段还可以包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。信号肽 可连接到667个氨基酸的PBP2a序列￠68个氨基酸减去N端Met)或其更小的片段。信号 肽可连接到与667个氨基酸的PBP2a序列￠68个氨基酸减去N端Met)或与较小的多肽片 段（与667个氨基酸的PBP2a序列98%同源）98%同源的多肽。信号肽可连接到与667个 氨基酸的PBP2a序列￠68个氨基酸减去N端Met)或与较小的多肽片段（与667个氨基酸 的PBP2a序列99%同源）99%同源的多肽。在计算具有SEQ ID N0 :2或其片段的多肽的同 源性时，不将任何信号肽包括在此计算中。信号肽的序列不用于确定同源性。因此，例如， 虽然SEQ ID N0:12包含可操作地连接到信号肽的SEQ ID N0:6,但是SEQ ID N0:12包含 SEQ ID NO :2的片段，即SEQ ID NO :12包含与SEQ ID NO :2的片段100%同源的多肽，尽 管信号肽不存在于SEQ ID NO :6中。因此，包含与SEQ ID NO :2的片段至少98%同源的多 肽片段的蛋白旨在表示这样的蛋白，所述多肽片段与至少245个氨基酸的SEQ ID N0 :2的 片段至少98%同源并可操作地连接到（例如）信号肽。
[0057] "片段"还可以意指编码如上所示的PBP2a片段的核酸片段，包括编码SEQ ID N0 : 2的片段以及与SEQ ID NO :2的同源性为98%或更高的多肽片段的核酸片段。片段可意指 编码包含SEQ ID N0 :2的片段的蛋白的核酸片段。片段可意指编码包含SEQ ID N0 :2的 片段（包括SEQ ID N0:6或其他SEQ ID N0:2片段，诸如SEQ ID N0:4)的蛋白的核酸片 段。在一些实施方案中，片段是编码包含SEQ ID N0:6的蛋白（诸如SEQ ID N0:12)的核 酸片段。在一些实施方案中，片段是编码包含SEQ ID NO :4的蛋白（诸如SEQ ID NO :10) 的核酸片段。"片段"还指编码与SEQ ID NO :2的同源性为98%或更高的多肽片段的核酸 片段。片段还指编码与SEQ ID N0 :2的同源性为99%或更高的多肽片段的核酸片段。片 段可包括编码与SEQ ID N0 :6的同源性为98%或更高的多肽片段或与SEQ ID N0 :2的同 源性为98%或更高的其他多肽片段（诸如与SEQ ID N0 :4的同源性为98%或更高的多肽 片段）的核酸片段。在一些实施方案中，片段包括编码与SEQ ID N0 :6的同源性为98%或 更高的多肽片段的核酸片段。在一些实施方案中，片段包括编码与SEQ ID N0 :4的同源性 为98%或更高的多肽片段的核酸片段。片段可包括编码与SEQ ID N0 :6的同源性为99% 或更高的多肽片段或与SEQ ID N0 :2的同源性为99%或更高的其他多肽片段（诸如与SEQ ID N0 :4的同源性为99%或更高的多肽片段）的核酸片段。在一些实施方案中，片段包括 编码与SEQ ID N0 :6的同源性为99%或更高的多肽片段的核酸片段。在一些实施方案中， 片段包括编码与SEQ ID N0 :4的同源性为99%或更高的多肽片段的核酸片段。如本文所 用的"片段"可意指编码能够在哺乳动物中引起抗PBP2a免疫应答的多肽的核酸的一部分。
[0058] 编码如上所示的PBP2a片段的核酸片段（包括编码SEQ ID N0 :2的片段以及与 SEQ ID N0 :2的同源性为98%或更高的多肽片段的核酸片段）与SEQ ID N0 :1的片段的同 源性为98%或更高。核酸片段与SEQ ID NO :1的片段的同源性优选地为99%或更高。核 酸片段优选地为SEQ ID NO :1的片段。核酸分子片段因此与SEQ ID NO :1的片段的同源性 为98%或更高并编码与SEQ ID NO :2的片段的同源性为98%或更高的蛋白。核酸分子片 段因此优选地与SEQ ID NO :1的片段的同源性为99%或更高。核酸分子片段优选地编码 与SEQ ID NO :2的片段的同源性为99%或更高的蛋白。核酸分子片段因此与SEQ ID NO :1 的片段的同源性为99%或更高并编码与SEQ ID NO :2的片段的同源性为99%或更高的蛋 白。核酸分子片段优选地编码与SEQ ID NO :2的片段的同源性为99%或更高的蛋白。核 酸分子片段优选地编码SEQ ID NO :2的片段。核酸分子片段优选地编码包含SEQ ID NO :6 的SEQ ID NO :2的片段。核酸分子片段可编码包含SEQ ID NO :6的SEQ ID NO :2的片段。 核酸分子片段可编码包含SEQ ID NO :4的SEQ ID NO :2的片段。核酸分子片段可编码SEQ ID NO :5。核酸分子可包含SEQ ID NO :3。
[0059] 核酸分子片段可编码如下长度的PBP2a的片段：245个或更多个、250个或更多个、 260个或更多个、275个或更多个、290个或更多个、320个或更多个、350个或更多个、380个 或更多个、410个或更多个、440个或更多个、470个或更多个、500个或更多个、540个或更多 个、560个或更多个、580个或更多个、640个或更多个或660个或更多个氨基酸。其片段可 包含 SEQ ID N0:5,诸如 SEQ ID N0:9。其片段可包含 SEQ ID N0:7,诸如 SEQ ID N0:11。 编码SEQ ID NO :2的片段或与SEQ ID NO :2的片段至少98%同源的多肽片段的SEQ ID NO :1的片段或与SEQ ID NO :1的片段至少98%同源的核苷酸序列片段可编码如下长度的 PBP2a的片段：245更或多更多个、250个或更多个、260个或更多个、275个或更多个、290个 或更多个、320个或更多个、350个或更多个、380个或更多个、410个或更多个、440个或更 多个、470个或更多个、500个或更多个、540个或更多个、560个或更多个、580个或更多个、 640个或更多个或660个或更多个。编码SEQ ID N0 :2的片段或与SEQ ID N0 :2的片段至 少98%同源的多肽片段的SEQ ID N0 :1的片段或与SEQ ID N0 :1的片段至少98%同源的 核苷酸序列片段的长度短于250个、短于255个、短于267个、短于283、短于305个、短于 335个、短于365个、短于395个、短于435个、短于455个、短于485个、短于520个、短于 550个、短于570个、短于600个、短于650或短于665个氨基酸。编码SEQ ID N0 :2的片 段或与SEQ ID N0 :2的片段至少98%同源的多肽片段的SEQ ID N0 :1的片段或与SEQ ID NO :1的片段至少98%同源的核苷酸序列片段的长度可以为735个或更多个、750个或更多 个、780个或更多个、825个或更多个、870个或更多个、960个或更多个、1050个或更多个、 1140个或更多个、1230个或更多个、1320个或更多个、1410个或更多个、1500个或更多个、 1620个或更多个、1680个或更多个、1740个或更多个、1920个或更多个或1980个或更多个 核苷酸。编码SEQ ID N0 :2的片段或与SEQ ID N0 :2的片段至少98%同源的多肽片段的 SEQ ID N0 :1的片段或与SEQ ID N0 :1的片段至少98%同源的核苷酸序列片段的长度可以 短于750个、短于765个、短于800个、短于850、短于915个、短于1000个、短于1100个、短 于1200个、短于1300个、短于1350个、短于1550个、短于1600个、短于1650个、短于1700 个、短于1800个、短于1950或短于1995个核苷酸。片段优选地不编码跨膜结构域。片段 优选地编码对应于蛋白C端部分的催化或转肽酶结构域的全部或一部分。片段优选地编码 对应于蛋白C端部分的催化或转肽酶结构域的全部或一部分，另外还编码N端延伸和非青 霉素结合域/二聚体区域的全部或一部分。
[0060] DNA片段可包含编码信号肽诸如免疫球蛋白信号肽（例如IgE或IgG信号肽）的 编码序列。编码信号肽的编码序列可连接到编码667个氨基酸的PBP2a序列￠68个氨基 酸减去N端Met)或其更小片段的编码序列。编码信号肽的编码序列可连接到编码如下多 肽的编码序列，该多肽与667个氨基酸的PBP2a序列￠68个氨基酸减去N端Met)或与更 小的多肽片段至少98%同源，所述更小的多肽片段与667个氨基酸的PBP2a序列至少98% 同源。编码信号肽的编码序列可连接到编码如下多肽的编码序列，该多肽与667个氨基酸 的PBP2a序列￠68个氨基酸减去N端Met)或与更小的多肽片段至少99%同源，所述更小 的多肽片段与667个氨基酸的PBP2a序列至少99%同源。编码序列与SEQ ID N0 :1的片 段至少98%同源，优选地与SEQ ID N0 :1的片段至少99%或更高同源。编码序列优选地 与SEQ ID N0 :1的片段100%同源，S卩，它们为SEQ ID N0 :1的片段。如上文针对肽序列对 SEQ ID N0 :2或其片段的同源性的计算进行描述时所述，计算编码序列的同源性程度不在 此计算中包括编码信号肽的编码序列。信号肽的序列不用于确定编码序列和SEQ ID N0 :1 的片段之间的同源性程度。因此，例如，虽然SEQ ID NO :11包含可操作地连接到信号肽的 SEQ ID N0 :5,但是 SEQ ID N0 :11 包含 SEQ ID N0 :1 的片段，即 SEQ ID N0 :11 包含与 SEQ ID N0 :1的片段100%同源的核苷酸序列，尽管事实上编码信号肽的SEQ ID N0 :11中的编 码序列不包括在SEQ ID N0 :1中。因此，包含与SEQ ID N0 :1的片段至少98%同源的核酸 序列片段的核酸分子旨在表示以下核酸分子：其包含与SEQ ID N0 :1的片段至少98%同源 的核酸序列的片段并编码与SEQ ID N0 :2的片段至少98%同源的至少245个氨基酸并可 操作地连接到例如信号肽的编码序列。
[0061] 1.同一
[0062] 如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下使用的"同一"或"同一性"可意 指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可如下计算百分比：最佳地对齐两个 序列，在指定的区域上比较两个序列，测定两个序列中在其上存在相同残基的位置的数目 以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中位置的总数，然后将结果乘以 100以得到序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同的长度或比对产生一个或多个 交错末端以及指定的比较区域只包括单个序列的情况下，将单个序列的残基包括在计算的 分母而非分子中。当比较DNA与RNA时，胸腺嘧啶（T)与尿嘧啶（U)可被认为是等同的。可 通过人工或使用计算机序列算法例如BLAST或BLAST2. 0来计算同一性。
[0063] m.阻抗
[0064] 如本文所用的"阻抗"在论述反馈机制时可以使用，并可根据欧姆定律转变成电流 值，从而使得能够与预设电流进行比较。
[0065] η·免疫应答
[0066] 如本文所用的"免疫反应"可意指宿主免疫系统例如哺乳动物的免疫系统响应于 MRSA PBP2a蛋白的引入（通过所提供的DNA质粒疫苗）而激活。免疫应答可以为细胞或体 液应答或两者的形式。
[0067] 〇·核酸
[0068] 如本文所用的"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"可意指共价连接在一起的至少 两个核苷酸。单链的描述也确定了互补链的序列。因此，核酸还包括所描述的单链的互补 链。核酸的许多变体可用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还包括基本上同一的核 酸及其互补序列。单链提供了可与靶序列在严格杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还包 括在严格杂交条件下杂交的探针。
[0069] 核酸可以是单链或双链的，或可包含双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA (基 因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以 及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟 嘌呤的碱基的组合。核酸可利用化学合成法或通过重组方法获得。
[0070] ρ·可操作地连接
[0071] 如本文所用的"可操作地连接"可意指基因的表达处于与其在空间上连接的启动 子的控制下。启动子可被置于处于其控制下的基因的5'(上游）或3'(下游）。启动子 与基因之间的距离可以与启动子所源自的基因中启动子与其控制的基因之间的距离大致 相同。如本领域中所已知，该距离的变化可被容许而不丧失启动子功能。
[0072] q.启动子
[0073] 如本文所用的"启动子"可意指能够在细胞中赋予核酸的表达、激活或增强所述表 达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强 所述核酸的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或 抑制子元件，所述元件可位于远离转录起始位点多达数千个碱基对。启动子可来源于包括 病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。相对于表达发生所处的细胞、组织或器官，或相 对于表达发生所处的发育阶段，或响应于外部刺激例如生理应激、病原体、金属离子或诱导 齐U，启动子可组成型地或差异地调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7 启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、 SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和 CMV IE启动子。
[0074] r.信号肽
[0075] "信号肽"是指短肽序列，通常短于50个氨基酸，其指导所并入的蛋白的运输。信 号肽通常在N端连接到蛋白并且编码信号肽的编码序列通常包含起始密码子，该密码子编 码由起始密码子编码的N端甲硫氨酸。信号肽靶向蛋白以在细胞内运输并牵涉在分泌途径 中，在其中信号肽在蛋白上的存在靶向蛋白以通过分泌途径运输，使得蛋白由细胞分泌或 以其他方式靶向，从而由细胞分泌进胞外环境。在一些实施方案中，信号肽为免疫球蛋白信 号肽，诸如IgG或IgE信号肽。向蛋白的编码序列添加信号肽的编码序列通常是指插入信 号肽的编码序列，包括起始密码子取代蛋白编码序列的起始密码子。也就是说，向蛋白的编 码序列添加信号肽的编码序列涉及移除蛋白的编码序列的起始密码子并插入包含起始密 码子的信号肽的编码序列。因此，在单个肽加上因而编码的蛋白中，在原始蛋白序列的氨基 酸序列的第1位的甲硫氨酸被在第1位具有甲硫氨酸的信号肽的氨基酸序列替代。
[0076] s.严格杂交条件
[0077] 如本文所用的"严格杂交条件"可意指第一核酸序列（例如探针）将与第二核酸 序列（例如靶）例如在核酸的复杂混合物中杂交所处的条件。严格条件是序列依赖性的并 且在不同的环境中是不同的。严格条件可被选择为比限定离子强度pH下特定序列的热解 链温度（T m)低约5-10°C。Tm可以是（在限定的离子强度、pH和核酸浓度下）50%的与靶互 补的探针与靶序列平衡杂交时所处的温度（当靶序列过量存在时，在T m下，50%的探针被 平衡地占据）。严格条件可以是这样的条件，其中在pH7. 0至8. 3下盐浓度低于约1. 0M钠 离子，例如约0.01-1. 0M的钠离子浓度（或其他盐）并且温度为至少约30°C (对于短探针， 例如约10-50个核苷酸）和至少约60°C (对于长探针，例如大于约50个核苷酸）。严格条 件还可通过加入去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以为 背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括下列条件：在42°C下于50%甲酰胺、 5x SSC和1%SDS中温育，或在65°C下于5x SSC、1%SDS中温育，和在65°C下于0.2x SSC 和0. 1% SDS中洗涤。
[0078] t.基本上互补的
[0079] 如本文所用的"基本上互补的"可意指第一序列与第二序列的互补序列在8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域范围内具有至少60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性，或两个序列在严格杂交条件下杂 交。
[0080] u.基本上同一的
[0081] 如本文所用的"基本上同一的"可意指第一序列与第二序列在8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域范围内具有至少60 %、65%、70 %、75%、80%、 85%、90(%、95(%、97(%、98 (%或99(%的同一性，或就核酸而言，如果第一序列与第二序列的 互补序列基本上互补，则第一序列与第二序列基本上同一。
[0082] V.变体
[0083] 如本文相对于核酸所用的"变体"可意指：⑴参照核酸序列的部分或片段；（ii) 参照核苷酸序列或其部分的互补序列；（iii)与参照核酸或其互补序列基本上同一的核 酸；或（iv)在严格条件下与参照核酸、其互补序列或与其基本上同一的序列杂交的核酸。 [0084] 相对于肽或多肽的"变体"在氨基酸序列上的差异在于氨基酸的插入、缺失或保守 置换但保持至少一种生物活性。变体还可以意指其氨基酸序列与参考蛋白的氨基酸序列 基本上同一的蛋白，其保持至少一种生物活性。氨基酸的保守置换，即用具有相似性质（例 如，亲水性、带电荷区域的程度和分布）的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域被认为通常涉 及微小的变化。这些微小的变化可部分地通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来鉴定，如本领 域中所理解的。Kyte等人，J. Mol. Biol. 157 :105-132 (1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于 其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被置换 并且仍然保留蛋白功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被置换。氨基酸 的亲水性还可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白的置换。在肽的背景下对氨基酸的亲水 性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这一有用的指标已报道与抗原性和免疫原 性相关。美国专利4, 554, 101，以引用整体并入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的置换可 产生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本领域中所理解。可利用亲水性值在彼此±2内 的氨基酸进行置换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观 察一致，应理解与生物功能相容的氨基酸置换依赖于氨基酸的相似性，尤其是那些氨基酸 的侧链的相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所揭示。
[0085] w.或体
[0086] 本文所用的"载体"可意指包含复制起始位点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌 体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主复 制的染色体外载体，或整合进宿主基因组的载体。
[0087] 2.PBP2a 蛋白
[0088] 在Genbank中公开了若干氨基酸序列PBP2a蛋白，例如具有登录号NP_370565. 1、 ZP_06791480. 1、BAG06200. 1、AAX14397. 1、YP_184944. 1、BAK53145. 1、ADC53332. 1、 ΒΑΕ75884. 1、ΖΡ_07362739. 1、ADC53314. 1、CAL22891. 1、CBI47957. 1、CAH17594. 1、 CAA74376. 1、ADC36253. 1、ADV68980. 1、ADV68968. 1、AAF85645. 1 和 ΑΒΜ66443. 1 的那些蛋 白。MRSA PBP2a蛋白。各种报道的序列略有不同，但是蛋白的长度通常为667个氨基酸，虽 然一些差异确实存在于不同的株系和分离株之中。如本文所用，为了方便起见，PBP2a蛋白 是指668个氨基酸的蛋白，包括由起始密码子编码的N端甲硫氨酸。本文所示的不同结构域 的编号涉及氨基酸序列SEQ ID N0 :2,其为基于Genbank登录号CAA74376. UADC36253. 1、 CAH17594. 1、CAL22891. 1、AAF85645. 1和ABM66443. 1中的序列的称为共有序列的全长 PBP2a序列。
[0089] 全长PBP2a蛋白是具有图1所示的三个结构域的细胞表面蛋白。图1的左侧显示 了通过细胞膜内的"跨膜结构域"锚定在细胞膜中的PBP2a蛋白以及均暴露于在胞外间隙 中的细胞外部上的"N端延伸和非青霉素结合域"和"转肽酶结构域"。图1的右侧显示了 由本文的构建体编码的蛋白的"完整"和"无锚定区"形式。"完整"包含"跨膜结构域"、"N 端延伸和非青霉素结合域"以及"转肽酶结构域"，而"无锚定区"包含"N端延伸和非青霉 素结合域"以及"转肽酶结构域"。位于蛋白N端并将蛋白锚定在细胞膜的跨膜结构域对应 于第1-23位氨基酸。第27-326位氨基酸被称为非青霉素结合域并包含称为N端延伸的第 27-138位氨基酸。第327-668位氨基酸被称为转肽酶或催化结构域。第24-140位氨基酸 也被称为MecA_N区或"NTF2样N端转肽酶结构域"。第136-667位氨基酸也称为FtsI区 并包含也称为PBP二聚体区或"青霉素结合蛋白二聚化结构域"的第147-310位氨基酸和 也称为转肽酶区或"转肽酶结构域"的第345-658位氨基酸。
[0090] 本文提供能够在哺乳动物中引起针对MRSA PBP2a的免疫应答的共有MRSA PBP2a 蛋白。在一些实施方案中，MRSA PBP2a蛋白可以为选自以下的一种或多种蛋白：MRSA PBP2a 全长序列（SEQ ID NO :2)，或包含至少245个氨基酸的SEQ ID NO :2所示MRSA PBP2a全长 序列的片段。另外，MRSA PBP2a蛋白可与SEQ ID NO :298%同源，或者其为与SEQ ID NO: 2的片段98%同源的蛋白片段。SEQ ID NO :2公开了 668个氨基酸的共有序列中的667个 氨基酸。由起始密码子编码的N端甲硫氨酸未在SEQ ID N0 :2中示出。然而，在一些实施 方案中，据设想，将不包含信号肽。因此，将提供具有起始密码子的SEQ ID N0 :1中的编码 序列，并且多肽序列将因而包含具有N端甲硫氨酸的SEQ ID N0 :2。因此，出于本公开的目 的，打算公开包含具有起始密码子（ATG)的SEQ ID N0 :1的核酸分子，也打算公开包含具 有N端甲硫氨酸的SEQ ID N0 :2的多肽。也打算在本文描述在核苷酸序列和氨基酸序列 中具有起始密码子（ATG)和N端甲硫氨酸的片段及其同源变体。因此，例如，打算公开还包 含起始密码子（ATG)的SEQ ID N0 :1的片段，诸如SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :5,或与SEQ ID N0:1至少98%同源的核酸序列的片段。同样，打算公开还包含N端甲硫氨酸的SEQ ID NO :2的片段，诸如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :6,或与SEQ ID NO :2至少8%同源的片段。 同样，打算公开还包含N端甲硫氨酸的SEQ ID NO :2的片段，诸如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :6,或与SEQ ID NO :2至少98%同源的片段。
[0091] 在一些实施方案中，抗原可包含信号肽序列。在一些实施方案中，抗原可包含如 SEQ ID N0:13所示的IgE信号肽序列。在一些实施方案中，抗原可包含"完整"SEQ ID N0: 8,其由在其N端连接IgE信号肽序列（SEQ ID N0:13)的MRSA PBP2a全长（SEQ ID N0.2) 构成。
[0092] SEQ ID NO :2所示的MRSA PBP2a全长序列的片段包含至少245个氨基酸。在一 些实施方案中，本文所示的片段可包含信号肽序列。在一些实施方案中，本文所示的片段 可包含如SEQ ID N0 :13所示的IgE信号肽序列。在一些实施方案中，抗原可包含"无锚定 区"SEQ ID N0:10,其由在其N端连接IgE信号肽序列（SEQ ID N0:13)的具有SEQ ID N0. 4 的MRSA PBP2a片段构成。在一些实施方案中，抗原可包含"短" SEQ ID NO :12,其由在其N 端连接IgE信号肽序列（SEQ ID NO :13)的具有SEQ ID NO :6的MRSA PBP2a片段构成。
[0093] 在一些实施方案中，片段不含MRSA PBP2a跨膜结构域（第1-23位氨基酸）。在 一些实施方案中，片段包含MRSA PBP2a转肽酶结构域（第327-668位氨基酸）的全部或一 些或此区域的至少245个氨基酸。在一些实施方案中，片段包含MRSA PBP2a转肽酶结构域 (包含第345-658位氨基酸）的全部或一些或此区域的至少245个氨基酸。在一些实施方 案中，片段包含全长序列的大部分C端区域的至少245个氨基酸的序列。在一些实施方案 中，片段包含全长序列的275个氨基酸的大部分C端区域（第393-668位氨基酸）的至少 245个氨基酸的序列（S卩，从第393-638位氨基酸横跨到第423-668位氨基酸以及其间的所 有片段）。在一些实施方案中，片段包含MRSA PBP2a转肽酶结构域（第327-668位氨基酸） 的全部或一些或此区域的至少300个氨基酸。在一些实施方案中，片段包含MRSA PBP2a转 肽酶结构域（包含第345-658位氨基酸）的全部或一些或此区域的至少300个氨基酸。在 一些实施方案中，片段包含全长序列的大部分C端区域的至少340个氨基酸的序列。在一 些实施方案中，片段包含全长序列的400个氨基酸的大部分C端区域（第268-668位氨基 酸）的至少340个氨基酸的序列（即，从第268-608位氨基酸横跨到第328-668位氨基酸 以及其间的所有片段）。在一些实施方案中，本文所不的片段可包含信号肽序列。在一些实 施方案中，本文所示的片段可包含如SEQ ID N0:13所示的IgE信号肽序列。
[0094] 在一些实施方案中，片段包含MRSA PBP2a转肽酶结构域（第327-668位氨基酸） 的全部或一些以及非青霉素结合域（第27-326位氨基酸）的全部或一些。在一些实施方 案中，片段包含至少400个氨基酸序列，其包含MRSA PBP2a转肽酶结构域的全部或一些以 及非青霉素结合域的全部或一些，并在一些实施方案中还不含跨膜结构域（第1-23位氨基 酸的大部分或全部）。在一些实施方案中，片段包含至少450个氨基酸序列，其包含MRSA PBP2a转肽酶结构域的全部或一些以及非青霉素结合域的全部或一些，并在一些实施方案 中还不含跨膜结构域（第1-23位氨基酸的大部分或全部）。在一些实施方案中，片段包含 至少500个氨基酸序列，其包含MRSA PBP2a转肽酶结构域的全部或一些以及非青霉素结合 域的全部或一些，并在一些实施方案中还不含跨膜结构域（第1-23位氨基酸的大部分或全 部）。在一些实施方案中，片段包含至少550个氨基酸序列，其包含MRSA PBP2a转肽酶结构 域的全部或一些以及非青霉素结合域的全部或一些，并在一些实施方案中还不含跨膜结构 域（第1-23位氨基酸的大部分或全部）。在一些实施方案中，片段包含至少600个氨基酸 序列，其包含MRSA PBP2a转肽酶结构域的全部或一些以及非青霉素结合域的全部或一些， 并在一些实施方案中还不含跨膜结构域（第1-23位氨基酸的大部分或全部）。在一些实施 方案中，片段包含至少640个氨基酸序列，其包含MRSA PBP2a转肽酶结构域的全部或一些 以及非青霉素结合域的全部或一些，并在一些实施方案中还不含跨膜结构域（第1-23位氨 基酸的大部分或全部）。在一些实施方案中，本文所不的片段可包含信号肽序列。在一些实 施方案中，本文所示的片段可包含如SEQ ID NO :13所示的IgE信号肽序列。
[0095] 片段优选地包含转肽酶结构域的大部分或全部。包含400个或更多个氨基酸的 SEQ ID N0:2 的片段优选地包含PBP2a C端的第 638、639、640、641、642、643、644、645、646、 647,648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、 666、667或668位氨基酸中的一个或多个。包含425个或更多个氨基酸的SEQ ID N0:2的 片段优选地包含 PBP2a C 端的第 638、639、640、641、642、643、644、645、646、647,648、649、 650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667 或 668 位氨基酸中的一个或多个。包含450个或更多个氨基酸的SEQ ID N0 :2的片段优选地包 含 PBP2a C 端的第 638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、 653、 654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667 或 668 位氨基酸中的 一个或多个。包含475个或更多个氨基酸的SEQ ID N0:2的片段优选地包含PBP2a C端 的第 638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、 656、 657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667 或 668 位氨基酸中的一个或多个。 包含500个或更多个氨基酸的SEQ ID N0:2的片段优选地包含PBP2a C端的第638、639、 640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、 659、660、661、662、663、664、665、666、667或668位氛基酸中的个或多个。包含525个或 更多个氨基酸的SEQ ID N0 :2的片段优选地包含PBP2a C端的第638、639、640、641、642、 643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、 662、663、664、665、666、667或668位氨基酸中的一个或多个。包含550个或更多个氨基酸的 SEQ ID N0:2 的片段优选地包含 PBP2a C端的第 638、639、640、641、642、643、644、645、646、 647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、 666、667或668位氨基酸中的一个或多个。包含575个或更多个氨基酸的SEQ ID N0:2的 片段优选地包含 PBP2a C 端的第 638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、 650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667 或 668 位氨基酸中的一个或多个。包含600个或更多个氨基酸的SEQ ID N0 :2的片段优选地包含 PBP2a C端的第638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、 654、 655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667 或 668 位氨基酸中的一个 或多个。包含630个或更多个氨基酸的SEQ ID N0:2的片段优选地包含PBP2a C端的第 638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、 657、 658、659、660、661、662、663、664、665、666、667 或 668 位氛基酸中的个或多个。在一 些实施方案中，本文所示的片段可包含信号肽序列。在一些实施方案中，本文所示的片段可 包含如SEQ ID N0 :13所示的IgE信号肽序列。
[0096] 在一些实施方案中，片段可以为MRSA PBP2a无锚定区/无跨膜结构域（SEQ ID NO. 4)。在一些实施方案中，片段可以是"无锚定区"（SEQ ID NO. 10)，其为MRSA PBP2a无 锚定区/无跨膜结构域（SEQ ID NO. 4)加上IgE信号肽（SEQ ID NO. 13)。在一些实施方案 中，片段可以是？8?2&"短"彼〇10勵：12)，其仅为1?^?8?2&短/催化结构域（即，仅 催化结构域）（SEQ ID NO :6)加上IgE信号肽（SEQ ID NO. 13)。
[0097] 除了 SEQ ID NO. 2之外，MRSA PBP2a蛋白还可以具有与SEQ ID :N0 :2的同源性 为98%的氨基酸序列，并且MRSA PBP2a蛋白的片段包括诸如本文所公开的那些片段以及 具有与SEQID:N0:2的同源性为98%的氨基酸序列的MRSAPBP2a蛋白的相应片段。MRSA PBP2a蛋白可具有与SEQ ID :N0 :2的同源性为98%的氨基酸序列，还可以包含信号肽序列， 诸如如SEQ ID N0:13所示的IgE信号肽序列，但是信号肽序列不包括在同源性测定中。同 样，本文所公开的片段（包括具有与SEQ ID :N0 :2的同源性为98%的氨基酸序列的MRSA PBP2a蛋白的片段）还可以包含信号肽序列，诸如如SEQ ID N0 :13所示的IgE信号肽序列， 但是信号肽序列不包括在同源性测定中。
[0098] 3. PBP2a 编码序列
[0099] Genbank包括金黄色葡萄球菌分离株的完整基因组的序列。在Genbank中公开了 mecA编码序列的若干核苷酸序列，诸如具有登录号FR823294. 1、EF190335. UAB221121. 1、 AB221122. 1、AB221124. 1、AB221120. 1、AB221119. 1、E09771. 1、AB236888. 1、AB221123. 1、 AB063481. 1和X52593. 1的那些核苷酸序列。
[0100] 本文提供了编码序列，其编码能够在哺乳动物中引起针对MRSA PBP2a的免疫应答 的MRSA PBP2a蛋白。在一些实施方案中，该编码序列编码选自以下的MRSA PBP2a蛋白： MRSA PBP2a全长序列（SEQ ID N0:2)，或包含至少245个氨基酸的SEQ ID N0:2所示的 MRSA PBP2a全长序列的片段。另外，该编码序列可编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的 MRSA PBP2a蛋白或与SEQ ID N0:2的片段至少98%同源的蛋白片段。
[0101] 在一些实施方案中，该编码序列选自：SEQ ID N0 :1，编码至少245个氨基酸的SEQ ID N0:2的片段，与SEQ ID N0:1至少98%同源并编码与SEQ ID N0:2至少98%同源的蛋 白的编码序列，以及与SEQ ID N0 :1至少98%同源并编码与SEQ ID N0 :2至少98%同源的 蛋白的编码序列的片段，此片段包含至少245个氨基酸。
[0102] 在一些实施方案中，该编码序列还包含可操作地连接到MRSA PBP2a编码序列的 信号肽序列的编码序列。在一些实施方案中，信号肽序列的编码序列编码如SEQ ID N0 :13 所示的IgE信号肽序列。在一些实施方案中，该编码序列可包含SEQ ID NO :7( "完整"）， 其由连接到IgE信号肽序列（SEQ ID N0:13)的编码序列的MRSA PBP2a全长序列（SEQ ID NO. 2)的编码序列SEQ ID NO :1构成，使得在表达时，IgE信号肽处于蛋白的N端。
[0103] 在一些实施方案中，该编码序列包含与SEQ ID N0 :1至少98%同源并编码与SEQ ID N0 :2至少98%同源的蛋白的核酸序列片段。在一些实施方案中，该编码序列包含与SEQ ID N0 :1至少98%同源并编码为至少245个氨基酸的SEQ ID N0 :2片段的核酸序列片段。 在一些实施方案中，该编码序列包含编码至少245个氨基酸的SEQ ID NO: 1的片段。在一 些实施方案中，该编码序列包含编码至少245个氨基酸的SEQ ID N0 :1的片段，其可操作地 连接到信号肽序列的编码序列，优选IgE信号肽（SEQ ID N0:13)。在一些实施方案中，编码 序列包含SEQ ID N0 :3。在一些实施方案中，编码序列包含SEQ ID N0 :3并且还包含可操 作地连接的编码序列，其编码信号肽序列，优选IgE信号肽。在一些实施方案中，编码序列 包含SEQ ID N0 :9。在一些实施方案中，编码序列包含SEQ ID N0 :5。在一些实施方案中， 编码序列包含SEQ ID NO :5并且还包含可操作地连接的编码序列，其编码信号肽序列，优选 IgE信号肽。在一些实施方案中，编码序列包含SEQ ID N0:11。
[0104] 在一些实施方案中，包含与SEQ ID NO :1至少98%同源的核酸序列片段且编码与 SEQ ID N0:2的片段98%同源的蛋白的免疫原性片段的编码序列不编码MRSA PBP2a跨膜 结构域。在一些实施方案中，包含与SEQ ID N0 :1至少98%同源的核酸序列片段且编码SEQ ID N0 :2的免疫原性片段的编码序列不编码MRSA PBP2a跨膜结构域。在一些实施方案中， 包含SEQ ID N0:1的片段的编码序列不编码MRSA PBP2a跨膜结构域。此类编码序列优选 地包含信号肽的编码序列，优选IgE信号肽。
[0105] 在一些实施方案中，编码序列编码作为第2节列举的并且标题为"PBP2a蛋白"的 以上章节中所示的片段。在一些实施方案中，编码作为第2节列举的并且标题为"PBP2a蛋 白"的以上章节中所示的片段的编码序列是SEQ ID N0 :1的片段并且优选地还可以包含信 号肽序列的编码序列，优选IgE信号肽。在一些实施方案中，编码作为第2节列举的并且标 题为"PBP2a蛋白"的以上章节中所示的片段的编码序列是与SEQ ID NO :198%同源的编码 序列的片段，并且优选地还可以包含信号肽序列的编码序列，优选IgE信号肽。在一些实施 方案中，编码作为第2节列举的并且标题为"PBP2a蛋白"的以上章节中所示的片段的编码 序列是与SEQ ID NO :198%同源的编码序列的片段且编码SEQ ID N0 :2的免疫原性片段， 并且优选地还可以包含信号肽序列的编码序列，优选IgE信号肽。
[0106] 4.质粒
[0107] 本文提供了能够以有效引起哺乳动物中的免疫应答的量在哺乳动物的细胞中表 达MRSA PBP2a蛋白或其片段的载体。载体可包含编码MRSA PBP2a蛋白或其片段的异源核 酸。载体可以是质粒。质粒可用于通过编码MRSA PBP2a蛋白或其片段的核酸对细胞进行 转染，将转化后的宿主细胞进行培养，并维持在其中发生MRSA PBP2a蛋白或其片段的表达 的条件下。
[0108] 质粒可以包含编码蛋白的核酸，该蛋白包括在其N端连接到Ig信号肽序列的MRSA PBP2a蛋白或其片段。质粒还可以包含起始密码子，其可以位于编码序列的上游，以及终止 密码子，其可以为与编码序列的下游。起始和终止密码子可与编码序列在一个框内。
[0109] 质粒还可以包含可操作地连接到编码序列的启动子。可操作地连接到编码序列的 启动子可以是来自猿猴病毒40 (SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒（MMTV)启动子、人免疫缺 陷病毒（HIV)启动子例如牛免疫缺陷病毒（BIV)长末端重复（LTR)启动子、莫洛尼病毒启 动子、禽类白血病病毒（ALV)启动子、巨细胞病毒（CMV)启动子例如CMV立即早期启动子、 EB病毒（EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒（RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因例如人肌 动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子还可以是 组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子，天然或合成的。此类启动子的实例在美 国专利申请公布号US20040175727中有所描述，将其内容整体并入本文。
[0110] 质粒还可包含多聚腺苷酸化信号，其可位于编码序列的下游。多聚腺苷酸化信号 可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素（bGH)多聚腺苷酸化 信号、人生长激素（hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号。SV40多聚 腺苷酸化信号可以是来自PCEP4质粒的多聚腺苷酸化信号（Invitrogen，San Diego，CA)。
[0111] 质粒还可以包含位于编码序列的上游的增强子。增强子可以是人肌动蛋白、人肌 球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子例如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的一种。在 美国专利号5, 593, 972、5, 962, 428和W094/016737(每一者的内容均以引用方式整体并入 本文）中描述了多核苷酸功能增强。
[0112] 质粒还可包含哺乳动物复制起点以便在细胞中使质粒保持于染色体外并且产生 多个质粒的拷贝。质粒可以是得自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAXl、pCEP4或pREP4， 其可以包含EB病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其可产生高拷贝游离型复制而不整 合。质粒的主链可以是PAV0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型（Ad5)质粒。
[0113] 质粒还可以包含可非常适合在施用质粒的细胞中的基因表达的调控序列。编码序 列可包含可允许在宿主细胞中更高效地转录编码序列的密码子。
[0114] 编码序列还可以包含Ig信号肽序列。信号肽序列的编码序列可位于所述编码序 列的5'。由该序列编码的共有抗原可包含N端Ig信号肽，随后为共有抗原蛋白。N端Ig 信号肽可以为IgE或IgG。以引用方式并入本文的美国专利号6, 733, 994公开了包含优化 的RNA序列和IgE信号肽序列的构建体。均以引用方式并入本文的PCT专利申请号PCT/ US04/18962和相应的美国专利申请号10/560, 650也公开了包含IgE信号肽序列的构建体。
[0115] 质粒可以是pSE420(Invitrogen，San Diego, Calif.)，其可用于在大肠杆菌 Escherichia coli(E.coli)中产生蛋白。质粒还可以是 pYES2(Invitrogen，San Diego, Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)株系中产生蛋白。质 粒还可以具有MAXBAC?完全杆状病毒表达系统（Invitrogen，San Diego, Calif·)，其可 用于在昆虫细胞中产生蛋白。质粒还可以是pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen，San Diego, Calif.)，其可用于在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢（CH0)细胞中产生蛋白。
[0116] 5.疫苗
[0117] 本文提供了能够在哺乳动物中生成针对MRSA PBP2a的免疫应答的疫苗。疫苗可 包含如上所述的质粒。疫苗可包含多种质粒或其组合。可提供疫苗以诱导针对MRSA的治 疗性或预防性免疫应答。
[0118] 疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是作为媒介 物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包含 表面活性剂例如免疫刺激复合物（ISC0MS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物（包括单磷酰脂 质A)、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡例如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、 病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其他已知的转染促进剂。
[0119] 转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括多聚L-谷氨酸（LGS)或脂质。转染促进剂 为多聚L-谷氨酸，并且更优选地，多聚L-谷氨酸以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转 染促进剂还可以包括表面活性剂例如免疫刺激复合物（ISC0MS)、弗氏不完全佐剂、LPS类 似物（包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡例如角鲨烯和角鲨烯，并且也可将 透明质酸与基因构建体一同施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包含转染促进 剂例如脂质、脂质体，包括作为DNA-脂质体混合物的卵磷脂脂质体或其他本领域已知的脂 质体（参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其他已 知的转染促进剂。优选地，转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括多聚L谷氨酸（LGS)或 脂质。疫苗中转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于lmg/ml、低于0· 750mg/ml、低于 0· 500mg/ml、低于 0· 250mg/ml、低于 0· 100mg/ml、低于 0· 050mg/ml 或低于 0· 010mg/ml。
[0120] 药学上可接受的赋形剂可以是一种或多种佐剂。佐剂可以是从相同的质粒或从 替代质粒表达的其他基因，或作为蛋白与疫苗中的上述质粒组合地递送。所述一种或多种 佐剂可以是蛋白和/或编码选自以下蛋白的核酸分子：α-干扰素（IFN-α)、β-干扰素 (IFN- β )、γ -干扰素、血小板衍生生长因子（TOGF)、TNF a、TNF β、GM-CSF、表皮生长因子 (EGF)、皮肤Τ细胞虏获趋化因子（CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子（TECK)、粘膜相关上皮趋 化因子（MEC)、IL-12、IL-15(包括这样的IL-15,其信号序列或编码信号序列的编码序列缺 失，且任选地包含不同的信号肽（例如来自IgE的信号肽）或编码不同信号肽（例如来自 IgE 的信号肽）的编码序列）、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、 IL-18、MCP-1、ΜΙΡ-1 α、ΜΙΡ-1 β、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、 GlyCAM-1、MadCAM-l、LFA-l、VLA-l、Mac-1、ρ150. 95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、 LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因 子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、 TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶 ICE、 卩〇8、。-加11、5?-1、六？-14?-2、？38、？651^1、]\^088、1狀1(、了狀卩6、11^、失活肌1(、5六？1(、5六？-1、 JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、 RANK、RANK 配体、0x40、0x40 配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、 TAPI、TAP2及其功能片段或其组合。在一些实施方案中，佐剂可以是一种或多种蛋白和/ 或编码选自 IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC 或 RANTES 的蛋白的核酸分子。IL-12 构建体和序列的实例在以下专利中有所公开：PCT专利申请号PCT/US1997/019502和 相应的美国专利申请号08/956, 865、2011年12月12日提交的名称为"COMPOSITIONS， COMPRISING IMPROVED IL-12GENETIC CONSTRUCTS AND VACCINES, IMMUNOTHERAPEUTICS AND METHODS OF USING THE SAME"的美国临时专利申请号61/569, 600和指定的代理人案 卷号133172. 04100 (X5915)、及要求与此提交的专利申请同日提交的美国临时专利申请号 61/569, 600的优先权的PCT申请，这些专利申请各自以引用方式整体并入本文。IL-15构建 体和序列的实例在？(^专利申请号？(：17^504/18962和相应的美国专利申请号10/560,650、 以及在PCT专利申请号PCT/US07/00886和相应的美国专利申请号12/160, 766、以及在 PCT专利申请号PCT/US10/048827中有所公开，这些专利申请各自以引用方式整体并入 本文。IL-28构建体和序列的实例在PCT专利申请号PCT/US09/039648和相应的美国专 利申请号12/936, 192中有所公开，这些专利申请各自以引用方式整体并入本文。RANTES 以及其他构建体和序列的实例在PCT专利申请号PCT/US1999/004332和相应的美国专 利申请号09/622452中有所公开，这些专利申请各自以引用方式整体并入本文。RANTES 构建体和序列的其他实例在PCT专利申请号PCT/US11/024098中有所公开，所述专利申 请以引用方式整体并入本文。RANTES以及其他构建体和序列的实例在PCT专利申请号 PCT/US1999/004332和相应的美国专利申请号09/622452中有所公开，这些专利申请各 自以引用方式整体并入本文。RANTES构建体和序列的其他实例在PCT专利申请号PCT/ US11/024098中有所公开，所述专利申请以引用方式整体并入本文。细胞因子CTACK、TECK 和MEC构建体和序列的实例在PCT专利申请号PCT/US2005/042231和相应的美国专利申请 号11/719, 646中有所公开，这些专利申请各自以引用方式整体并入本文。0X40和其他免疫 调节剂的实例在美国专利申请号10/560,653中有所公开，所述专利以引用方式整体并入 本文。DR5和其他免疫调节剂的实例在美国专利申请号09/622452中有所公开，所述专利申 请以引用方式整体并入本文。
[0121] 疫苗还可以包含1994年4月1日提交的美国专利021，579 (所述专利以引用方式 整体并入本文）中描述的基因疫苗促进剂。
[0122] 疫苗可按如下的量包含共有抗原和质粒；约1纳克至100毫克；约1微克至约10 毫克；或优选约0. 1微克至约10毫克；或更优选约1毫克至约2毫克。在一些优选的实施 方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选的实施 方案中，药物组合物包含约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组 合物包含约0. 1至约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约1至约 350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约25至约250微克、约100至 约200微克、约1纳克至100晕克、约1微克至约10晕克、约0. 1微克至约10晕克、约1晕 克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0. 1至约500微克、约 1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克的共有抗原或其质粒。
[0123] 可根据待使用的施用模式来配制疫苗。注射用疫苗药物组合物可以是无菌、无热 原以及无颗粒的。可使用等渗制剂或溶液。等渗添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山 梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸缓冲盐水。疫苗还可以包含稳 定剂，包括明胶和白蛋白。稳定化可使得制剂在室温或环境温度下长期稳定，例如将LGS或 聚阳离子或聚阴离子加入疫苗制剂。
[0124] 除了使用基因疫苗诸如DNA疫苗外，还可以将编码序列或蛋白并入减毒活疫苗、 重组载体或亚单位疫苗中。减毒活疫苗和那些使用重组载体以递送外源基因的疫苗的实 例见述于美国专利：4, 722, 848、5, 017, 487、5, 077, 044、5, 110, 587、5, 112, 749、5, 174, 993、 5, 223, 424、5, 225, 336、5, 240, 703、5, 242, 829、5, 294, 441、5, 294, 548、5, 310, 668、 5, 387, 744、5, 389, 368、5, 424, 065、5, 451，499、5, 453, 364、5, 462, 734、5, 470, 734 和 5, 482, 713,它们均以引用方式并入本文。
[0125] 6.递送疫苗的方法
[0126] 本文提供了用于递送疫苗的方法，该疫苗提供编码MRSA PBP2a蛋白的基因构建 体，可诱导针对所述蛋白的免疫应答。可提供递送疫苗或接种的方法以诱导治疗性和预防 性免疫应答。接种过程可在哺乳动物中产生针对MRSA的免疫应答。疫苗的递送可包括转 染核酸分子，该核酸分子包含编码MRSA PBP2a蛋白的编码序列，其导致在细胞中的高水平 表达。MRSA PBP2a蛋白或其肽被递送到细胞表面和/或由细胞表面分泌，在细胞表面上免 疫系统加以识别并诱导细胞、体液或细胞和体液应答。疫苗的递送可用于通过向哺乳动物 施用如上所述的疫苗来诱导或引发哺乳动物中针对MRSA的免疫应答。
[0127] 在将疫苗和质粒递送进哺乳动物细胞后，转染的细胞将表达编码序列并分泌MRSA PBP2a蛋白。这些蛋白将被免疫系统识别为外来物并将产生针对它们的抗体。这些抗体将 被免疫系统维持并能对正在发生的MRSA感染和后续MRSA感染产生有效的应答。
[0128] 可向哺乳动物施用疫苗以引起哺乳动物的免疫应答。哺乳动物可以为人、灵长类 动物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、 象、胳马、羊§它、小鼠、大鼠和鸡。
[0129] a.联合治疗
[0130] 可将疫苗与其他蛋白和编码以下物质的基因组合施用：α-干扰素、Y-干扰素、 血小板衍生生长因子（PDGF)、TNFa、TNF0、GM-CSF、表皮生长因子（EGF)、皮肤Τ细胞虏获 趋化因子（CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子（TECK)、粘膜相关上皮趋化因子（MEC)、IL-12、 IL-15(包括信号序列缺失的并任选地包含不同信号肽诸如IgE信号肽的IL-15)、MHC、 CD80、CD86、IL-28、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1α、ΜΙΡ-1β、 IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、 VLA-1、Mac-1、p150· 95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18 的 突变体形式、⑶40、⑶40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管 内皮生长因子、Fas、TNF 受体、Fit、Ap〇-l、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、 DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶 ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、 p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、 Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配体、0x40、0x40 配 体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及其功能片段或其 组合。在一些实施方案中，将疫苗与以下核酸分子和/或蛋白中的一种或多种组合地施用： 选自包含编码IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC和RANTES中的一种或多种或其功能 片段的编码序列的核酸分子，以及选自IL-12蛋白、IL-15蛋白、IL-28蛋白、CTACK蛋白、 TECK蛋白、MEC蛋白或RANTES蛋白或其功能片段的蛋白。
[0131] 可通过不同的途径施用疫苗，包括经口、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局 部、通过吸入、通过颊面施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜、皮下、肌内、鼻内、鞘内以及关 节内或其组合。对于兽医用途，可按正常兽医实践将组合物作为适当地可接受的制剂施用。 兽医可容易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。可利用常规注射器、无针注 射装置、"微粒轰击基因枪"或其他物理方法诸如电穿孔（"EP"）、"水动力学法"或超声施 用疫苗。
[0132] 可通过若干熟知的技术将疫苗的质粒递送至哺乳动物，所述技术包括利用和不利 用体内电穿孔的DNA注射（也称为DNA接种）、脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体例 如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组疫苗。共有抗原可通过DNA注射结合体内电穿 孔来递送。
[0133] b.电穿孔
[0134] 可使用电穿孔装置来实现通过疫苗质粒的电穿孔而施用疫苗，所述电穿孔装置可 被构造成将有效引起可逆的孔在细胞膜中形成的能量脉冲递送至哺乳动物的所需组织，并 且优选的是，能量脉冲是与由使用者预设的电流输入相似的恒定电流。电穿孔装置包括 电穿孔组件、电极组合件或柄部组合件。电穿孔组件可以包括并纳入电穿孔装置的各种 元件（包括控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、 通讯端口、存储器组件、电源和电源开关）的一种或多种。电穿孔可使用体内电穿孔装置 例如 CELLECTRA EP 系统（Inovio Pharmaceuticals，BlueBell，PA)或 Eigen 电穿孔仪 (Genetronics，San Diego, CA)来实现以有利于质粒对细胞的转染。
[0135] 电穿孔组件可用作电穿孔装置的一个元件，而其他元件是与电穿孔组件相连的单 独元件（或组件）。电穿孔组件可以用作电穿孔装置的不止一个元件，这些元件可以与电 穿孔组件分开的电穿孔装置的另外其他元件相连。作为一个机电或机械装置的部件存在的 电穿孔装置的元件可以不受限制，因为所述元件可用作一个装置或用作彼此连通的单独元 件。电穿孔组件能够递送能量脉冲并包括反馈机制，该能量脉冲在所需的组织中产生恒定 电流。电极组合件可包括具有空间排布的多个电极的电极阵列，其中电极组合件接收来自 电穿孔组件的能量脉冲并通过电极将该能量脉冲递送至所需的组织。所述多个电极中的至 少一个在能量脉冲的递送中是中性的，并测量所需组织中的阻抗，且将该阻抗传至电穿孔 组件。反馈机制可以接收测得的阻抗，并可调节电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电 流。
[0136] 多个电极可以按分散的形式递送能量脉冲。所述多个电极可以通过电极的控制按 程序化的序列以分散形式递送能量脉冲，并且所述程序化的序列由使用者输入到电穿孔组 件。程序化的序列可包括按序列递送的多个脉冲，其中所述多个脉冲的每个脉冲由至少两 个活性电极递送，其中一个是测量阻抗的中性电极，并且其中所述多个脉冲的后续脉冲由 不同于至少两个活性电极（其中一个是测量阻抗的中性电极）的电极递送。
[0137] 反馈机制由硬件或软件执行。反馈机制由模拟闭环电路执行。该反馈每50ys、 20 μ s、10 μ s或1 μ s发生一次，但优选地为实时反馈或瞬时反馈（S卩，通过测定响应时间的 可用技术测定时基本上为瞬时的）。中性电极可测量所需组织中的阻抗并将该阻抗传至反 馈机制，并且反馈机制响应该阻抗且调节能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的 值。在能量脉冲的递送过程中，反馈机制连续且瞬时地维持恒定电流。
[0138] 可促进本发明的DNA疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在 Draghia-Akli等人的美国专利7, 245, 963、Smith等人提交的美国专利公布2005/0052630 中所述的那些，这些专利的内容均以引用方式整体并入本文。可用于促进DNA疫苗递送的 其他电穿孔装置和电穿孔方法包括在2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的 美国专利申请号11/874072中所提供的那些，所述美国专利申请根据35USC119(e)要求 2006年10月17日提交的美国临时专利申请号60/852, 149和2007年10月10日提交的 60/978, 982的权益，将这些专利申请均以引用方式整体并入本文。
[0139] Draghia-Akli等人的美国专利号7, 245, 963描述了模块化电极系统及其在促进 将生物分子引入体内或植物的选定组织的细胞中的用途。该模块化电极系统可包括多个针 电极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲控制器向所述多个针电极的导电性连接的电连 接器；和电源。操作员可握住安装在承载结构上的所述多个针电极并将它们牢牢插入体内 或植物的选定组织。然后生物分子经由皮下针递送至选定的组织。激活可编程恒定电流脉 冲控制器并将恒定电流电脉冲施加到所述多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进生物分 子引入所述多个电极之间的细胞。美国专利7, 245, 963的全部内容以引用方式并入本文。
[0140] Smith等人提交的美国专利公布2005/0052630描述了可用于有效促进将生物分 子引入体内或植物的选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括由软件或固件 规定其操作的电动装置（"EKD装置"）。EKD装置基于使用者控制和脉冲参数的输入在电 极之间产生一系列可编程恒定电流脉冲模式，并允许存储和获得电流波形数据。该电穿孔 装置还包括具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中心注射通道，以及可移除的 导向盘。将美国专利公布2005/0052630的全部内容以引用方式并入本文。
[0141] 美国专利号7, 245, 963和美国专利公布2005/0052630中所述的电极阵列和方法 不仅可适用于深层穿入诸如肌肉的组织，而且还可适用于深层穿入其他组织或器官。由 于电极阵列的构造，注射针（用于递送所选生物分子）也被完全插入靶器官，并在由电 极所预描绘的区域垂直于所述靶组织进行注射。美国专利7, 245, 963和美国专利公布 2005/005263中所述的电极优选为20mm长和21号。
[0142] 此外，在一些实施方案中设想了包括电穿孔装置及其用途，在这些实施方案中存 在以下专利中所述的那些电穿孔装置：1993年12月28日公布的美国专利5, 273, 525、2000 年8月29日公布的美国专利6, 110, 16U2001年7月17日公布的6, 261，281和2005年10 月25日公布的6, 958, 060以及2005年9月6日公布的美国专利6, 939, 862。此外，本文设 想了涵盖2004年2月24日公布的美国专利6, 697, 669 (涉及使用多种装置中的任一种递 送DNA)以及2008年2月5日公布的美国专利7, 328, 064中所提供的适于DNA注射方法的 主题的专利。将上述专利以引用方式整体并入本文。
[0143] c.制备DNA质粒的方法
[0144] 本文提供了用于制备构成本文所述的DNA疫苗的DNA质粒的方法。在最终亚克隆 进哺乳动物表达质粒的步骤后，可使用本领域已知的方法将DNA质粒用于在大规模发酵罐 中接种细胞培养物。
[0145] 可使用已知的装置和技术的组合来配制或制备与本发明的EP装置一起使用的 DNA质粒，但优选地使用在2007年5月23日提交的许可、共同未决的美国临时专利申请美 国序列号60/939, 792中所述的优化质粒制备技术来制造质粒。在一些实例中，可以大于或 等于10mg/mL的浓度配制这些研究中使用的DNA质粒。除了美国序列号60/939792中所述 的装置和方案（包括2007年7月3日发布的许可美国专利号7,238,522中所述的装置和 方案）外，制造技术还包括或结合对于本领域普通技术人员而言通常已知的各种装置和方 案。将上述申请和专利（分别为美国序列号60/939, 792和美国专利号7, 238, 522)整体并 入本文。 实施例
[0146] 在以下实施例中进一步对本发明进行阐述。应当理解，这些实施例虽然表示本发 明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出。根据上文中的论述和这些实施例，本领域 技术人员可确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本发明进 行各种改变和变动以使之适合于各种用法和条件。因此，根据上述说明，除了本文中显示和 描述的变动外的本发明的各种变动对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类变动也旨 在落在所附权利要求的范围内。
[0147] 实施例1
[0148] 与MRSA感染在逐渐增多这一事实相关的高死亡率使人们努力得到能够诱导MRSA 特异性PBP2a蛋白的免疫力的疫苗。为此，最初构建了两种PBP2a DNA疫苗抗原：一种仅由 连接到IgE信号肽序列的PBP2a的催化结构域构成（SEQIDN0:12，下文称为由SEQIDN0 : 11编码的"短"），而另一种由连接到IgE信号肽序列的为跨膜结构域而保存的整个PBP2a 蛋白组成（SEQIDN0:10，下文称为由SEQIDN0:9编码的"无锚定区"）。包含IgE信号 肽序列提供高效率的信号肽序列。将编码序列进行密码子优化和RNA优化以进一步提高表 达水平。
[0149] 将小鼠用25ug短或无锚定区的疫苗变体在四头肌中免疫，然后通过得自Inovio Biomedical的Cellectra装置进行电穿孔。单次免疫两周后，采集小鼠血样，并测试血清的 PBP2a特异性抗体。接受短变体的动物组与该组的免疫前血清相比显示出抗体滴度的3倍 以上的增加，而接受无锚定区疫苗变体的动物显示出超过6倍的增加（图2)。这些数据表 明这些质粒抗原能够在单次免疫后两周引起体内PBP2a特异性抗体应答。这些数据支持将 此类免疫原设计用作这一重要感染性疾病的治疗方法。
[0150] 实施例2
[0151] 制备了包含PBP2a蛋白的全长变体（包含跨膜结构域）的构建体。包含连接到IgE 信号肽序列（SEQ ID N0:13)的全长PBP2a蛋白（SEQ ID N0:2)的编码序列的该全长MRSA PBP2a蛋白DNA疫苗构建体在下文称为由SEQ ID N0:7编码的"完整"构建体，并具有氨基 酸序列SEQ ID N0 :8。图3显示了主链质粒pVaxl的示意图，该质粒具有经克隆以可操作 地连接到CMV启动子和BGH polyA位点的PBP2a编码序列的插入。
[0152] 实施例3
[0153] 图4显示了得自表达实验的结果，其中使用pVax (作为对照）以及包含编码PBP2a 蛋白的完整和无锚定区形式的构建体的质粒对蛋白表达水平进行比较。
[0154] 对通过包含编码PBP2a蛋白的完整和无锚定区形式的构建体的质粒产生的免疫 应答进行了比较。在第〇天采集小鼠血样并用25yg pVax、完整（SEQ ID N0:7)或无锚定 区疫苗（SEQ ID NO :9)变体在四头肌中免疫，然后用得自Inovio Biomedicai的Cellectra 装置进行电穿孔。两周后，采集小鼠血样并接受第二次免疫。在第28天，采集小鼠血样 并通过ELISA、血清杀菌力试验（Serum Bactericidal Assay)以及调理吞噬和杀灭试验 (Opsonization Phagocytosis and Killing Assay)进行分析。
[0155] 对在第0天、第14天和第28天从初始/对照小鼠或在第0天和第14天用完整或 无锚定区疫苗免疫的小鼠采集的血清中的PBP2a特异性IgG抗体的滴度进行了比较。综合 结果在图5中示出。图6显示了在第0天、第14天和第28天初始/对照小鼠中或在第0 天和第14天用无锚定区（中）或完整（右）疫苗免疫的小鼠中的抗PBP2a IgG滴度的各 个数据。
[0156] 测量了得自初始/对照小鼠或用完整或无锚定区疫苗免疫的小鼠的稀释血清中 的PBP2a特异性IgG抗体滴度，数据在图7中示出，其中使用点到点作图（左）和最佳拟合 作图（中）对数据绘图。还在图7(右）中示出了稀释度倒数对应的终点滴度。
[0157] 在第0天和第28天从初始/对照小鼠或在第0天和第14天用完整或无锚定区疫 苗免疫的小鼠采集的血清中的IgGl和IgG2a的独立滴度。示出IgGl滴度的结果在图8左 侧示出，示出IgG2a滴度的结果在图8右侧示出。
[0158] 实施例4
[0159] 开展了另外的研究，其中将豚鼠用100ug进行皮内（ID)免疫。完成免疫三周和六 周后，采集动物血样，并测试血清的PBP2a特异性抗体。完整和无锚定区变体均在免疫后三 周产生了稳健的终点滴度，对于完整变体接近1〇 6,而对于无锚定区变体接近1〇4。免疫后六 周，滴度在很大程度上保持一致，从而表明应答的耐久性。
[0160] 图9示出了从通过完整或无锚定区变体进行皮内（ID)免疫的豚鼠获取的IgG滴 度。将动物以三周的间隔在皮肤中免疫三次。最终免疫三周（左图）和六周（右图）后， 采集动物血样并测量PBP2a抗原特异性滴度。
【权利要求】
1. 一种编码MRSA PBP2a蛋白或其包含至少245个氨基酸的片段的核酸分子，所述核酸 分子包含： 与SEQ ID NO: 1至少98 %同源并编码与SEQ ID NO :2至少98 %同源的蛋白的核酸序 列；或 与SEQ ID NO: 1至少98 %同源并编码与SEQ ID NO :2至少98 %同源的蛋白的核酸序 列的片段，其中所述片段编码与包含至少245个氨基酸的SEQ ID NO :2的片段98%同源的 蛋白的免疫原性片段。
2. 根据权利要求1所述的核酸分子，包含与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白的核酸序列的片段，其中所述片段编码与包含至少245个氨 基酸的SEQ ID NO :2的片段98%同源的蛋白的免疫原性片段。
3. 根据权利要求2所述的核酸分子，包含与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白的核酸序列的片段，其中所述片段编码具有至少245个氨基 酸的SEQ ID NO :2的免疫原性片段。
4. 根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述片段为SEQ ID NO :1的片段。
5. 根据权利要求2所述的核酸分子，包含SEQ ID NO :5。
6. 根据权利要求2所述的核酸分子，包含SEQ ID NO :3。
7. 根据权利要求2所述的核酸分子，其中与包含至少245个氨基酸的SEQ ID NO :2的 片段98%同源的蛋白的免疫原性片段不含编码MRSA PBP2a跨膜结构域的编码序列。
8. 根据权利要求2所述的核酸分子，包含编码信号肽序列的编码序列，所述编码序列 可操作地连接到与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋 白的核酸序列的片段。
9. 根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述信号肽序列为IgE信号肽序列SEQ ID NO ：13〇
10. 根据权利要求9所述的核酸分子，包含序列SEQ ID NO :11。
11. 根据权利要求9所述的核酸分子，包含序列SEQ ID NO :9。
12. 根据权利要求所述的核酸分子，包含与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的蛋白的核酸序列。
13. 根据权利要求12所述的核酸分子，包含与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码SEQ ID NO :2的核酸序列。
14. 根据权利要求12所述的核酸分子，包含SEQ ID NO :1。
15. 根据权利要求12所述的核酸分子，包含编码信号肽序列的编码序列，所述编码序 列可操作地连接到与SEQ ID NO :1至少98%同源并编码与SEQ ID NO :2至少98%同源的 蛋白的核酸序列。
16. 根据权利要求15所述的核酸分子，其中所述信号肽序列为IgE信号肽序列SEQ ID NO ：13〇
17. 根据权利要求16所述的核酸分子，包含SEQ ID NO :7。
18. 根据权利要求1-17任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子为质粒。
19. 根据权利要求1-17任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子为表达载体并且编 码所述一种或多种蛋白的序列可操作地连接到调控元件。
20. 根据权利要求1-17任一项所述的核酸分子，其中将所述核酸分子掺入病毒颗粒。
21. -种包含根据权利要求1-17任一项所述的核酸分子的组合物，所述组合物被配制 成使用电穿孔递送给个体。
22. -种包含根据权利要求1-17任一项所述的核酸分子的组合物，还包含编码选自 IL-12、IL-15和IL-28的一种或多种蛋白的核酸序列。
23. -种包含根据权利要求1-17任一项所述的核酸分子的组合物，所述组合物被配制 成使用电穿孔递送给个体并且还包含编码选自IL-12、IL-15和IL-28的一种或多种蛋白的 核酸序列。
24. -种诱导针对MRSA PBP2a的免疫应答的方法，包括向个体施用在所述个体中有效 诱导免疫应答的量的根据权利要求1-17任一项所述的核酸分子。
25. -种治疗诊断有MRSA的个体的方法，包括向个体施用治疗有效量的根据权利要求 卜17任一项所述的核酸分子。
26. -种预防个体的MRSA感染的方法，包括向个体施用预防有效量的根据权利要求 卜17任一项所述的核酸分子。
27. -种选自以下的蛋白： 包含与SEQ ID NO :2至少98%同源的氨基酸序列并且还包含信号肽的蛋白；或 作为包含与SEQ ID NO :2至少98%同源的氨基酸序列并具有至少245个氨基酸的蛋 白的免疫原性片段并且还包含信号肽的蛋白。
28. 根据权利要求26所述的蛋白，包含SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10或SEQ ID N0:12。
29. -种诱导针对MRSA PBP2a的免疫应答的方法，包括向个体施用在所述个体中有效 诱导免疫应答的量的包含根据权利要求27所述的蛋白的组合物。
30. -种治疗诊断有MRSA感染的个体的方法，包括向个体施用包含治疗有效量的根据 权利要求27所述的蛋白的组合物。
31. -种预防个体的MRSA感染的方法，包括向个体施用包含预防有效量的根据权利要 求27所述的蛋白的组合物。
【文档编号】C12Q1/68GK104254616SQ201280069488
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2012年12月11日 优先权日:2011年12月12日
【发明者】D·B·韦纳, M·P·莫罗 申请人:宾夕法尼亚大学托管会