OPN关联蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表达的制作方法
【专利摘要】本发明主要涉及一种OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，该方法包括：重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建和pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。本发明通过建立原核生物基因表达系统，可以大量表达pro-MMP-9，并建立高纯度蛋白纯化流程，获得量多、纯度高且制备方法简单可行的pro-MMP-9蛋白。
【专利说明】OPN关联蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表达
[0001]【技术领域】
本发明属于基因克隆表达【技术领域】，具体涉及一种OPN下游关联蛋白基质金属蛋白酶9酶原基因的克隆及表达的方法。
【背景技术】
[0002]胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤。在我国，胰腺癌发病率呈逐步上升趋势，是导致人口死亡的十大恶性肿瘤之一，未经治疗者一年生存率大约20%，5年生存率不到4%。侵袭(invasion)和转移(metastasis)是目前胰腺癌患者治疗失败的主要原因。骨桥蛋白(osteopontin,0PN)是一种具有多种功能分泌型|丐结合磷酸化糖蛋白。近年研究发现，OPN在胰腺癌肿瘤细胞中呈高表达，并与胰腺癌的侵袭和转移密切相关。因此，对其作用机制及信号通路的研究也显得极为重要。
[0003]基质金属蛋白酶-9 (matrix metal1proteinases 9, MMP-9)是金属蛋白酶家族的重要成员之一，具有多种生物学功能:降解基底膜和细胞外基质，激活生长因子，促进细胞迁移。多种文献报道⑴⑵，基质金属蛋白酶-9在肿瘤细胞中高表达，与肿瘤迁移密切相关。基质金属蛋白酶-9通常以酶原形式存在，从胞内分泌到胞外，当酶原激活后方具有生物学功能。而最近研究显示(3)，在胰腺癌中，OPN可能通过激活MMP-9而促进胰腺癌的侵袭和转移。因此，基质金属蛋白酶 _9 酶原(pro-matrix metal1proteinases 9，pro-MMP-9)的研究显得非常关键。
[0004]基质金属蛋白酶-9酶原作为分泌型蛋白，在细胞外作用，含量极少，从生物体中直接纯化得率低，操作繁琐，成本也高，不能满足工业化生产的需要。
[0005]参考文献:
1.HemaRangaswamij Anuradha Bulbulej and Gopal C.Kundu.NuclearFactor-1nducing Kinase Plays a Crucial Role in Osteopontin-1nduced MAPK/1κ B aKinase-dependent Nuclear Factor κ B-mediated Promatrix Metalloproteinase-9Activation.(2004) J.Biol.Chem.279:38921 - 35
2.Durlik M， Gardian K Metalloproteinase 2 and 9 activity in thedevelopment of pancreatic cancer.(2012) Pol Przegl Chir.84:377-82.3.Collins AL， Rock J， Malhotra L， Frankel WLj Bloomston M.0steopontinexpression is associated with improved survival in patients with pancreaticadenocarcinoma.(2012) Ann Surg Oncol.19:2673-8.
【发明内容】
[0006]本发明提供一种克隆、表达并分离纯化OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原(pro-MMP-9)蛋白质的方法，该方法包含:重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建和pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。
[0007]进一步地，所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法中，重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤:
1).pro-MMP-9的引物设计:
以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9，设计出4条引物pro-MMP-9pl>pro-MMP-9p2>pro-MMP-9pl-G_3，、pro-MMP-9p2-G_5，,
上游引物pro-MMP-9p I含有内切酶位点Nde I，下游引物pro-MMP_9p2含有内切酶位点Hind III，
pro-MMP-9pl:5’ -CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’
pro-MMP-9pl-G-3>:5’ -GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’
pro-MMP-9p2-G-5>:5’ -AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’
pro-MMP-9p2:5’ -CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3’ ；
2).拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段
以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段，先扩增NdeI与pro-MMP-9基因第66碱基中间的片段和pro-MMP-9基因第54-285位碱基序列，上述PCR产物用凝胶电泳，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增Nde I_mE7序列；
3).TA克隆连接与转化
取pMD18-T载体，加入 延伸过A的pro-MMP-9片段，再加入连接缓冲液，连接；
将上述TA连接产物转移到DH5 α感受态细胞中转化，即得TA阳性克隆。
[0008]进一步地，所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法中，重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤:
0.酶切与回收目标片段:pro-MMP-9基因序列中有I酶切位点，用I/HindIII双酶切TA- pro-MMP-9及pET_28a(+)质粒，然后回收目标片段；
2).T4 DNA连接酶连接及转化:在连接体系中连接过夜，然后将连接产物转入DH5a感受态，培养过夜即得阳性克隆。
[0009]进一步地，所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法中，pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定具体分为以下步骤:
0.重组质粒转化大肠杆菌:将上述鉴定为阳性的重组质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9转入感受态Rosetta，涂布于LB — Kan+平板上，培养过夜；
2).1PTG诱导蛋白表达:挑单克隆于LB - Kan+中，培养过夜，然后接过夜菌于LB —Kan+中，继续培养，然后加入IPTG诱导蛋白表达。
[0010]进一步地，所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法中，所述的方法中还包括pro-MMP-9蛋白的纯化和鉴定:
0.细菌蛋白表达形式的分析:_80°C冻存菌体:加入细菌裂解液，超声破菌后离心，包涵体沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示pro-MMP-9蛋白主要存在于包涵体中；
2).pro-MMP-9蛋白的纯化:超声破菌后，离心弃上清，沉淀超声洗涤，将溶解有包涵体的溶液离心，取上清上样至预先平衡好的镍柱，分别用溶液洗涤10个柱床体积，再用洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白液，充分透析，离心取上清液，收获的蛋白用SDS-PAGE进行纯度分析；3).pro-MMP-9蛋白的鉴定:SDS_PAGE电泳结束后取下凝胶，电转到硝酸纤维素膜上，取膜，于室温用5%脱脂奶粉封闭，加入鼠抗人pro-MMP-9抗体，室温孵育，用PBST洗膜，加入羊抗鼠抗体室温孵育，再用PBST洗膜，加入底物液显色，在暗室内显影、定影，即得目标条带。
[0011]本发明通过建立原核生物基因表达系统，可以大量表达pro-MMP-9，并建立高纯度蛋白纯化流程，获得量多、纯度高且制备方法简单可行的pro-MMP-9蛋白。
【具体实施方式】
[0012]下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的阐述。
[0013]实施例1 Dro-MMP-9克降、表汰与蛋白钝化
一种基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，主要分为以下步骤:
1.重组克隆载体TA- pro-MMP-9的构建
(1)pro-MMP-9的引物设计
以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9，设计出4条引物pro-MMP-9 p1、pro-MMP-9p2、pro-MMP-9pl-G-3，、 pro-MMP-9p2-G-5，。
[0014]上游引物pro-MMP-9p I含有内切酶位点Nde I，下游弓丨物pro-MMP_9p2含有内切酶位点 Hind III，
pro-MMP-9pl:5’ -CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3，
pro-MMP-9pl-G-3>:5’ -GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’
pro-MMP-9p2-G-5>:5’ -AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’
pro-MMP-9p2:5’ -CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3>
(2)拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段
以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段，先扩增NdeI 与 pro-MMP-9 基因第 66 碱基中间的片段(108bp，称为 Nde 1-PR0-MMP_966)和 pro-MMP-9基因第54-285位碱基序列(称为pro-MMP-954_285)。PCR反应体系(Pyrobest酶):41.25 μ L无菌水，5 μ L IOXbuffer (含 MgCl2), I μ L IOmM dNTPs, I μ L mE7pl/mE7pl-G_3’，I μ LmE7p2-G-5’/mE7p2，0.5μ L pET28a (+)-Ε7,0.25 μ L Pyrobest 酶，混匀后立即进行扩增。反应条件为:94°C预变性3min ;然后进行以下33个循环:94°C 45s, 55°C lmin，72°C 45s ;最后在72°C延伸3min。
[0015]上述PCR产物用1%琼脂糖凝胶90V恒压电泳20min，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增1-mE7序列。PCR反应体系(Pyrobest酶):39.75 μ L无菌水，5uL IOXbuffer(含MgCl2), I μ L IOmM dNTPs, I μ L pro-MMP_9pl，I μ L pro-MMP-9p2,I μ L Nde 1-pro-MMP-966, 1 μ L pro-MMP-954_285 , 0.25 μ L Pyrobest 酶，混匀后立即进行扩增。反应条件为:94°C预变性3min ;然后进行以下33个循环:94°C 45s, 55°C lmin，72°C45s ;最后在72°C延伸3min。
[0016] 琼脂糖凝胶电泳、胶回收DNA片段，为便于用Taq酶延伸加A，胶回收的洗脱缓冲液使用含MgCl2的Taq酶缓冲液。用25 μ L胶回收洗脱缓冲液洗脱PCR扩增的DNA片段。取13.7μ L 的胶回收洗脱液，加入 1.2μ L IOmM dOTl^P0.lyL Taq 酶，72°C 延伸 6min，PCR 产物延伸A。[0017](3) TA克隆连接
取I μ L pMD18-T载体，加入2 μ L延伸过A的pro-MMP-9片段，再加入5 μ L的连接缓冲液，2 μ L无菌水补足至1(^1^体系，于161:连接2hr。
[0018](4) TA克隆转化
将上述TA连接产物1(^1^转移到0册(1感受态细胞中；冰上静置30min ;42°C热激90s ;冰上再静置 5min ;加入 800 μ L LB, 37°C摇床 120rpm 摇 Ihr ；4000rpm 离心 3min ;在超净台中移去大部分上清，轻悬沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨节青霉素(Amp)的LB平板中；LB平板倒置于37°C培养箱培养过夜。
[0019](5) TA克隆的鉴定
随机挑取4个TA阳性克隆，接入4mL LB (Amp+)中；37°C摇床220rpm摇过夜；抽提质粒TA-pro-MMP-9，保存于_80°C，并进行双酶切和PCR鉴定。选取双酶切和PCR都为阳性的TA克隆质粒测序。
[0020]2.重组表达质粒 pET_28a(+)-pro-MMP-9 的构建 (O酶切与回收
pro-MMP-9基因序列中有&oR I酶切位点(pro-MMP-9上游引物中引入)，用&oR I/Hind III双酶切TA- pro-MMP-9及pET_28a(+)质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收目标片段。 [0021 ] (2 ) T4 DNA连接酶连接及转化
连接体系为:1μ L IOX连接酶缓冲液，I μ L双酶切pET-28a(+)质粒，7 μ L pro-MMP-9片段，ΙμL Τ4 DNA连接酶，16°C连接过夜。
[0022]将连接产物转入DH5 α感受态，转化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，37 °C倒置培养过夜。
[0023](3)阳性克隆鉴定
随机挑取4个阳性克隆，接入4mL的LB (Kan+)中；37°C摇床220rpm摇过夜；抽提质粒进行双酶切(&oR l/Η?η? III)和PCR鉴定。
[0024]3.pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定
(I)重组质粒转化大肠杆菌
将上述鉴定为阳性的重组质粒pET-28a (+) -pro-MMP-9转入感受态Rosetta，涂布于LB平板(Kan+)上，37 °C倒置培养过夜。
[0025](2) IPTG诱导蛋白表达
挑单克隆于LB (Kan+)中，37°C摇床，220rpm培养过夜，以1:50接过夜菌于20 mL LB(Kan+)中，继续培养3hr左右，OD6tltol达到0.6-0.8时加入IPTG至ImM诱导蛋白表达，分别于 Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。
[0026](3) SDS-PAGE 鉴定
取ImL菌液12000rpm离心Imin收集菌体,加入100 μ L的I X上样缓冲液,煮沸5min,冷却后12000rpm离心Imin,取10 μ L样品进行12% SDS-PAGE,电泳条件为18mA, 1.5hr。取下凝胶在考马斯亮蓝染液中摇动染色lhr，移入洗脱液中摇动洗脱过夜。观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示诱导4hr后蛋白表达到达高峰。
[0027]4.pro-MMP-9蛋白的纯化和鉴定(I)pro-MMP-9蛋白的诱导表达
将过夜培养已转入pET-28a (+)-pro-MMP-9的Rosseta菌液以1:50接于IL LB (Kan+)中，37°C摇床，220rpm培养2hr左右，OD6tltlnm达到0.6-0.8时，加入IPTG至ImM，继续诱导培养4hr，4°C，7000rpm离心6min，收集菌体，_80°C保存。
[0028](2)细菌蛋白表达形式的分析
-80°C冻存菌体按每克湿菌5-10mL的比例加入细菌裂解液(0.5M NaCl, 20mM Tris,IOmM巯基乙醇，ImM PMSF,pH7.9),超声破菌,4°C, 8000rpm离心20min,包涵体沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示pro-MMP-9蛋白主要存在于包涵体中。
[0029](3 ) pro-MMP-9 蛋白的纯化
超声破菌后，4°C，8000rpm离心20min，弃上清，沉淀用50mL溶液(0.5M NaCl, 20mMTris, 0.5% Triton, ρΗ7.9)超声洗漆一次；4°C, 8000rpm离心20min,弃上清。沉淀即包涵体加入 30mL 溶液(0.5M NaCl, 20mM Tris，6M 盐酸胍，ρΗ7.9)，置 37°C溶解 2hr 以上。4°C，16000rpm离心20min，取上清上样至预先用0.5M NaCl, 20mM Tris，6M盐酸胍，pH7.9的溶液平衡好的镍柱，分别用溶液①、②、③(①0.5M NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，5mM咪唑，6M 盐酸胍，ρΗ7.9;② 0.5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM 巯基乙醇，5mM 咪唑，8M 尿素，ρΗ7.9 ;③
0.5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，20mM咪唑，8M尿素，pH7.9)洗涤10个柱床体积，再用洗脱缓冲液(0.5 M NaCl, 20mM Tris, 5mM巯基乙醇，200mM咪唑，8M尿素，pH7.9)洗脱，收集蛋白液，置4°C对1父？85充分透析，41:，16000印111离心201^11，取上清液。收获的蛋白用SDS-PAGE进行纯度分析，结果显示纯化的蛋白分子量约为20kDa。
[0030](4) pro-MMP-9 蛋白的鉴定
Western blot鉴定:SDS_PAGE电泳结束后取下凝胶，电转到硝酸纤维素膜上(4°C，100V，lhr),取膜，于室温用5%脱脂奶粉封闭2hr，加入鼠抗人pro-MMP-9抗体，室温孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗体室温孵育1.5hr，再用PBST洗膜3次，每次IOmin,加入底物液显色,在暗室内显影、定影，结果显示约40kDa处出现了 pro-MMP-9的目标条带。
[0031]应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，该方法包含:重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+) -pro-MMP-9的构建和pro_MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。
2.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤: 1).pro-MMP-9的引物设计: 以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9，设计出4条引物pro-MMP-9pl>pro-MMP-9p2>pro-MMP-9pl-G_3，、pro-MMP-9p2-G_5，， 上游引物pro-MMP-9p I含有内切酶位点Nde I，下游引物pro-MMP_9p2含有内切酶位点Hind III，
pro-MMP-9pl:5’ -CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’
pro-MMP-9pl-G-3>:5’ -GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’
pro-MMP-9p2-G-5>:5’ -AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’
pro-MMP-9p2:5’ -CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3’ ； 2).拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段 以pET28a (+) -pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段，先扩增NdeI与pro-MMP-9基因第66碱基中间的片段和pro-MMP-9基因第54-285位碱基序列，上述PCR产物用凝胶电泳，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增Nde I_mE7序列； 3).TA克隆连接与转化 取pMD18-T载体，加入延伸过A的pro-MMP-9片段，再加入连接缓冲液，连接； 将上述TA连接产物转移到DH5 α感受态细胞中转化，即得TA阳性克隆。
3.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤: 0.酶切与回收目标片段:pro-MMP-9基因序列中有R I酶切位点，用I/HindIII双酶切TA- pro-MMP-9及pET_28a(+)质粒，然后回收目标片段； 2).T4 DNA连接酶连接及转化:在连接体系中连接过夜，然后将连接产物转入DH5a感受态，培养过夜即得阳性克隆。
4.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定具体分为以下步骤: 0.重组质粒转化大肠杆菌:将上述鉴定为阳性的重组质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9转入感受态Rosetta，涂布于LB — Kan+平板上，培养过夜； 2).1PTG诱导蛋白表达:挑单克隆于LB - Kan+中，培养过夜，然后接过夜菌于LB —Kan+中，继续培养，然后加入IPTG诱导蛋白表达。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，所述的方法中还包括pro-MMP-9蛋白的纯化和鉴定: 1).细菌蛋白表达形式的分析:_80°C冻存菌体:加入细菌裂解液，超声破菌后离心，包涵体沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示pro-MMP-9蛋白主要存在于包涵体中；2).pro-MMP-9蛋白的纯化:超声破菌后，离心弃上清，沉淀超声洗涤，将溶解有包涵体的溶液离心，取上清上样至预先平衡好的镍柱，分别用溶液洗涤10个柱床体积，再用洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白液，充分透析，离心取上清液，收获的蛋白用SDS-PAGE进行纯度分析； 3).pro-MMP-9蛋白的鉴定:SDS_PAGE电泳结束后取下凝胶，电转到硝酸纤维素膜上，取膜，于室温用5%脱脂奶粉封闭，加入鼠抗人pro-MMP-9抗体，室温孵育，用PBST洗膜，加入羊抗鼠抗体室温孵育，再用PBST洗膜，加入底物液显色，在暗室内显影、定影，即得目标条带。
【文档编号】C12N15/70GK104004738SQ201310056149
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2013年2月22日
【发明者】陈爱萍, 蒋晟, 梁静, 顾传虎, 姚洛芫 申请人:南京优科制药有限公司