专利名称：T细胞受体Vβ-Dβ-Jβ序列及其检测方法
背景技术：
本申请是于2000年2月22日申请的、同时待审的申请顺序号09/507,819的部分连续申请。
按照国立卫生研究院(National InStitutes of Health)的资助号NS36140，美国政府在本发明中可以拥有一定的权利。
1.发明领域本发明总的来讲涉及自身免疫病例如多发性硬化(MS)的治疗领域。更具体地讲，本发明涉及在某些MS患者中发现的T细胞受体序列及其检测方法。
2.相关技术的描述在人类和其它哺乳动物中，T细胞受体存在于T细胞上。T细胞受体包含α链和β链，其中从N端至C端，β链包含以下区域Vβ-Dβ-Jβ-Cβ。T细胞受体Vβ-Dβ-Jβ区天然有所变化。
当抗原通过抗原呈递细胞(APC)而呈递至T细胞时，恰好识别所述抗原、具有可变区(包括Vβ-Dβ-Jβ)的T细胞受体可与所述APC上的所述抗原结合。然后带有所述T细胞受体的T细胞活化(克隆性扩增)。
认为多种自身免疫病的发病机理在于自身免疫性T细胞对生物体正常呈递的抗原应答。这种疾病的一个实例是多发性硬化(MS)，一般而言，多发性硬化中T细胞对髓鞘抗原、尤其是髓鞘碱性蛋白(MBP)的应答持续升高。与对照个体相反，发现MS患者血液和脑脊液中的MBP反应性T细胞体内活化，并且以较高前体细胞率发生。这些MBP反应性T细胞产生Thl细胞因子，例如IL-2、TNF和γ-干扰素。这些Thl细胞因子促进炎性细胞迁移至中枢神经系统，并且在MS中使髓鞘破坏性炎症反应恶化。
可以利用多种调节机制来治疗MS。一种这样的机制是用一种或多种数目有限的、具有胞外结构域的T细胞膜相关肽进行接种。Vandenbark的美国专利5,614,192公开了通过利用15-30个氨基酸的免疫原性T细胞受体肽来治疗自身免疫病，所述肽包含T细胞受体的第二互补性决定区(CDR2)的至少一部分。Zhang的同时待审的美国专利申请(60/099,102)公开了通过利用免疫原性T细胞受体肽并结合免疫原性T细胞活化标记肽来治疗自身免疫病。
其中可以改进用T细胞受体肽接种的一个方面是通过确定自身免疫病(例如MS)患者T细胞受体中存在的共同基序(如果有的话)。如果存在这样的基序，则可以用与所述基序相同的肽接种所述患者，以促进治疗。
因此，最好是具有自身免疫病患者T细胞受体中存在的共同基序的氨基酸序列。最好是也能够通过诸如PCR的常规方法容易地检测到患者样品中的这类基序。另外，最好是应用与所检测基序相同的肽治疗自身免疫病患者。
本发明公开了Vβ13.1T细胞亚群的T细胞受体中存在的这样一种共同基序即“LGRAGLTY基序”以及通过PCR容易地检测到所述基序的方法，所述基序具有氨基酸序列Lue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(SEQ ID NO3)。该基序存在于某些识别MBP的氨基酸83-99(下文称为“MBP83-99”)的T细胞的某些T细胞受体中。该Vβ13.1T细胞亚群内的基序在下文可被称为“Vβ13.1-LGRAGLTY”。可以用与所述基序相同的肽接种患者，以治疗或预防与Vβ13.1-LGRAGLTY相关的自身免疫病。一种这样的自身免疫病是MS。
发明概述在一个实施方案中，本发明涉及一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO1的至少10个连续核苷酸或者与其互补或从其衍生的序列。甚至更优选的是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸或与其互补的序列。最优选的是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或与其互补的序列。
在一系列的其它实施方案中，所述寡核苷酸可以用于在Vβ13.1-LGRAGLTYT细胞中存在的核酸序列的扩增或检测。在这些实施方案的一个部分中，所述寡核苷酸以引物对使用，所述引物对包含或衍生自下列引物(a)第一种引物，所述第一种引物是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸并且包含SEQ ID NO1的至少10个连续核苷酸或与其互补的序列；(b)第二种引物，所述第二种引物是一种长约15和30个核苷酸、不包含序列(a)的寡核苷酸，并且所述第二种引物序列可以见于T细胞受体的T细胞中Vβ13.1基因Vβ-Jβ区(SEQ ID NO2)中，其中序列(a)和序列(b)不存在于所述T细胞受体基因的同一条链上。
优选所述第一种引物是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸或与其互补的序列。最优选的是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO1或与其互补的序列。
在这些实施方案的另一个部分中，所述寡核苷酸作为寡核苷酸探针使用，所述寡核苷酸探针包含(a)寡核苷酸，所述寡核苷酸长约15-30个核苷酸并且包含SEQ IDNO1的至少10个连续核苷酸或与其互补的序列；(b)标记部分。
优选所述寡核苷酸长约15-30个核苷酸并且包含SEQ ID NO1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸或与其互补的序列。最优选的是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO1或与其互补的序列。所述标记部分最好选自32p或洋地黄毒苷。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种检测表达LGRAGLTY基序的MBP83-99Vβ13.1T细胞的方法，所述方法包括(i)从MBP83-99Vβ13.1T细胞中获得一种核酸样品；(ii)使所述核酸样品与选自或衍生自以下的引物对接触(a)第一种引物，所述第一种引物包含一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸并且包含SEQ ID NO1的至少10个连续核苷酸或与其互补或从其衍生的序列；(b)第二种引物，所述第二种引物包含一种长约15和30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸不包含序列(a)而且存在于Vβ13.1T细胞的Vβ13.1基因Vβ-Jβ区(SEQ ID NO2)，其中序列(a)和序列(b)不存在于Vβ13.1基因的相同链上；(iii)检测LGRAGLTY基序编码核酸的存在。
优选所述第一种引物是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸或与其互补的序列。最优选的是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO1或与其互补的序列。
本发明的另一个实施方案涉及长8个至约45个氨基酸残基、包含LGRAGLTY基序(即包含序列SEQ ID NO3)的肽。在本发明该实施方案的不同方面，所述肽包含序列SEQ ID NO32的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个连续氨基酸。优选所述肽序列是SEQ ID NO3，或者所述序列是SEQ ID NO32的残基2-21。最优选所述肽序列是SEQID NO32的残基2-21。
在再一个实施方案中，本发明涉及一种治疗自身免疫病的方法，所述方法包括(a)从病人中获得MBP83-99Vβ13.1T细胞；(b)通过上述方法检测LGRAGLTY基序编码核酸的存在；并且如检测到所述核酸，那么(c)将长9个至约45个氨基酸残基的一种或多种肽给予所述病人，每种肽包含LGRAGLTY基序。在本发明该实施方案的各个方面，所述给予所述病人的肽分别包含序列SEQ ID NO32的9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个连续氨基酸。优选所述肽序列是SEQ ID NO3，或者所述肽序列包含SEQ ID NO32的残基2-21。最优选所述肽序列是SEQ ID NO32的残基2-21。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种监测自身免疫病的方法，所述方法包括(a)从病人中获得MBP83-99Vβ13.1T细胞；(b)通过上述方法检测LGRAGLTY基序编码核酸的存在；并且如检测到所述核酸，那么(c)对所述核酸进行定量。
附图简述以下附图构成本发明说明书的一部分并且包括所述附图，以进一步说明本发明的某些方面。参考这些附图中的一个或多个并结合本文提供的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1显示用于PBMC来源的PCR产物克隆和测序的实验流程。通过得自LGRAGLTY基序表达阳性的4个PBMC标本的5’Vβ13.1引物和3’Jβ引物，扩增来源于PBMC标本的cDNA，将其连接到TA克隆载体pCR2.1中，然后转化到大肠杆菌(E.coli)中。用M13引物和LGRAGLTY特异性引物，通过PCR对质粒DNA进行筛选。通过PCR显示可见扩增的阳性质粒用Vβ13.1引物根据VβDβJβ序列进行测序。
图2显示2个MBP83-99 T细胞克隆与具有单个丙氨酸取代的类似肽的反应性模式。检查表现出相同Vβ13.1重排(对于MS7-E2.6和MS27-C3.1而言)和相似Vα-Jα连接序列(对于MS7-E2.6和MS7-E3.1而言)的2对MBP83-99 T细胞克隆在[3H]-胸苷掺入测定中对一组丙氨酸取代的肽的反应性。用表达DRB1*1501的小鼠成纤维细胞系作为抗原呈递细胞的来源。在72小时后测定所述克隆对每种类似肽的增殖反应，结果以所掺入的CPM表示。阴影框表示对类似肽应答的T细胞克隆增殖减少＞50％。
图3显示交叉检查原始和无相关性T细胞克隆的CDR3寡核苷酸的特异性。检查对TCR VDJ区特异性的一组寡核苷酸在检测原始MBP83-99T细胞克隆以及在来源于相同和不同个体的无相关性MBP83-99T细胞克隆中存在的已知靶DNA序列中的特异性。采用CDR3特异性寡核苷酸作为正向引物且3’-Cβ引物作为反向引物来进行PCR反应。实心框表示在原始T细胞克隆或共享相同CDR3序列的T细胞克隆中存在的DNA序列的阳性检测。也检查所有引物与具有无相关性CDR3序列的随机所选T细胞克隆DNA产物的结合(阴影框)。
图4显示在来源于MS患者随机所选PBMC标本中与基序Vβ13.1LGRAGLTY互补的靶DNA序列的检测。首先用5’-Vβ13.1特异性引物和3’-Cβ引物，在RT-PCR中扩增从随机所选MS患者PBMC标本(n＝48)制备的cDNA。然后将所扩增的PCR产物与对LGRAGLTY基序特异性的洋地黄毒苷标记的寡核苷酸探针杂交。将原始MBP83-99克隆(MS7-E2.6)和无相关性T细胞克隆(MS32-B9.8)分别用作阳性对照和阴性对照。MS-7和MS-27是原始PBMC标本，从中可获得克隆MS7-E2.6(表1中的MS-7)和克隆MS27-C3.1(表1中的MS-27)。星号表示DRB1*1501的阳性表达。
图5显示来源于正常研究对象的随机所选PBMC标本中的Vβ13.1-LGRAGLTY基序的检测。如图4说明所述，对得自20位正常研究对象(NS)的PBMC标本在相同条件下进行分析。将原始克隆(MS7-E2.6)和无相关性T细胞克隆(MS32-B9.8)分别用作阳性对照和阴性对照。星号表示DRB1*1501的阳性表达。
图6显示LGRAGLTY基序在来源于MS患者和正常研究对象的PBMC标本中表达的半定量比较。基序Vβ13.1-LGRAGLTY的表达相对于来源于MS和正常个体的PBMC中每种cDNA中的Cβ表达通过半定量PCR进行分析。根据(LGRAGLTY基序表达/Cβ表达)×100％，计算相对表达水平。
图7显示在来源于MS患者的短期MBP83-99T细胞系中的Vβ13.1-LGRAGLTY基序的检测。用合成MBP83-99肽，从5位MS患者产生一组独立的短期MBP83-99T细胞系。所有这些T细胞系根据其对MBP83-99肽的比反应性(对MBP83-99应答的CPM/对照CPM＞5)加以证实。采用5’-Vβ13.1特异性引物和3’-Cβ引物，通过PCR扩增cDNA产物。随后在蛋白质印迹分析中，将所扩增的PCR产物与对应于Vβ13.1LGRAGLTY基序的洋地黄毒苷标记的寡核苷酸探针杂交。将得自原始MBP83-99克隆(MS7-E2.6)和无相关性T细胞克隆(MS32-B9.8)的cDNA产物分别用作阳性对照和阴性对照。
图8显示在免疫的MS患者中PBMC(外周血单核细胞)对免疫MBP反应性T细胞克隆和与MBP反应性T细胞频率有关的TCR肽的增殖反应。8A得自2位免疫患者的PBMC增殖反应以如下定义的刺激系数表示。与经照射的表达共同CDR3序列的免疫MBP反应性T细胞克隆(基序-阳性T细胞克隆MS7-D2.2和MS27-D4.4)一起培养的PBMC计数/分钟(CPM)/单独培养的PBMC CPM和经照射的单独培养的T细胞CPM之和。在增殖测定中分别确定基序-阳性肽(SEQ ID NO32的氨基酸2-21)和对照TCR肽(SEQ ID NO48的氨基酸1-20)的增殖反应，其中PBMC以100,000细胞/孔与TCR肽(20μg/ml)一起培养5天。所有实验在对应于基线(之前)和第4次接种后2个月(之后)的2个时间点进行。8B在相同时间点估计对MBP特异性的T细胞的前体细胞率。NS＝正常研究对象。
图9显示在免疫患者PBMC中产生抗TCR肽的抗独特型抗体的B细胞的估计前体细胞率。PBMC得自2位经免疫的MS患者和2位随机所选未经免疫的健康个体。在来源于EBV-生产细胞系和环孢菌系A(Sandoz，Bssel.Switzerland)的上清液存在下培养细胞。所有生长阳性孔根据在ELISA中对基序-阳性TCR肽和对照TCR肽有反应的抗体的存在进行筛选。通过阳性孔数除以初始接种的PBMC总数，估计产生抗TCR肽的抗独特型抗体的B细胞的前体细胞率。
说明性实施方案的描述为了有助于理解本发明，下面给出一些术语的定义。
“PCR”是指聚合酶链式反应，例如，一般性描述于美国专利第4,683,202号(于1987年7月28日授予Mullins)，所述专利通过引用结合到本文中。PCR是一种扩增技术，在PCR中将所选寡核苷酸或引物在聚合试剂(例如聚合酶)和4种三磷酸核苷酸存在下与核酸模板杂交，从所述引物形成延伸产物。然后使这些产物变性且在循环反应中用作模板，以扩增一定数量的现有核酸，以便于其随后的检测。多种PCR技术是可利用的并且可以用于本发明方法。
“引物”是指寡核苷酸，无论是天然的还是合成的，均能够用作与模板分子上特定DNA序列互补的DNA合成的起点。
在术语“衍生自…的引物或探针”情况下的“衍生自”是指引物或探针不限于所列的核苷酸序列，而且也包括在所列核苷酸序列中包括核苷酸添加、缺失或取代的的改变，所述序列的改变程度保持在检测编码Vβ13.1-LGRAGLTY序列即Lue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(SEQ ID NO3)的T细胞受体DNA中作为引物起作用的能力。
“免疫原性(的)”，当用来描述肽时，是指所述肽能够诱导免疫应答，为T细胞介导的免疫应答、抗体免疫应答或者它们两者。“抗原(的)”是指所述肽可以以游离形式被抗体识别并且就抗原特异性T细胞而论在MHC分子条件下。
“免疫相关性疾病”是指其中免疫系统参与疾病发病机理的疾病。一类免疫相关性疾病是自身免疫病。本发明所考虑的自身免疫病包括但不限于类风湿性关节炎、重症肌无力、多发性硬化、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、Graves氏病、炎性肠病、自身免疫性眼色素层视网膜炎(uveoretinitis)、多肌炎和某些类型的糖尿病。根据本发明的公开内容，本领域技术人员可以容易地想到可通过本发明的组合物和方法治疗的其它自身免疫病。“T细胞介导的疾病”是指在生物体中由生物体内正常存在的T细胞识别肽引起的疾病。
“治疗”，当指保护动物免患疾病时，是指预防、抑制或阻抑所述疾病。预防所述疾病包括在所述疾病诱发之前将本发明的组合物给予动物。抑制所述疾病包括在所述疾病诱发之后、但在其临床表现之前将本发明的组合物给予动物。阻抑所述疾病包括在所述疾病的临床表现之后将本发明的组合物给予动物。人们将会认识到，在人类医学中，不可能总是知道疾病诱发过程中什么时间给予本发明的组合物。
在一个方面，本发明涉及包含以下序列或衍生自下述序列的引物对(a)第一种引物，所述第一种引物是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO1的至少10个连续核苷酸或与其互补的核酸序列；(b)第二种引物，所述第二种引物是一种长约15和30个核苷酸的寡核苷酸，但所述寡核苷酸不包含序列(a)并存在于Vβ13.1T细胞中T细胞受体基因Vβ-Jβ区中。
其中序列(a)和序列(b)不存在于所述T细胞受体基因的同一条链上。
优选所述第一种引物是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸或与其互补的序列。最优选的是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸核苷酸序列SEQID NO1或与其互补的序列。
按照本发明的引物设计用来扩增人Vβ13.1T细胞的T细胞受体编码基因的片段，所述片段包含氨基酸基序Lue GlyArg Ala Gly Leu ThrTyr(SEQ ID NO3)。已经将编码包含LGRAGLTY基序的T细胞受体、来自Vβ13.1T细胞的基因提交给GenBank，登记号为AP117132。编码包含LGRAGLTY基序的T细胞受体、来自Vβ13.1T细胞的基因的序列在本文中称为SEQ ID NO2。在按照本发明的方法中，用两种引物扩增自Vβ13.1T细胞的T细胞受体基因的约400bp片段，其中第一种引物位于CDR3区中，而第二种引物位于Cβ区中。T细胞受体基因的Vβ-Dβ-Jβ区将位于CDR3和Cβ区之间且包括CDR3和Cβ区。在一个优选的实施方案中，所述引物是以上所述的引物对。
按照本发明的引物也包括衍生自引物(a)-(b)的寡核苷酸。如果一种序列具有或含有与所述引物之一基本上相同的序列且保留选择性地退火至如上所述来自Vβ13.1T细胞的T细胞受体基因Vβ-Dβ-Jβ区的大致相同的CDR3或Cβ区的能力，则所述序列衍生自引物(a)或(b)。更具体地讲，所述引物可以在长度上或者沿所述序列一个或多个位置中的核酸种类上与引物(a)或(b)不同，只要所述引物保留对于来自Vβ13.1T细胞的T细胞受体基因Vβ-Dβ-Jβ区的所鉴定区的选择性即可。例如，所述引物可以是具有至少15个核苷酸的寡核苷酸，其中所述15个核苷酸与一系列选自或衍生自引物序列(a)-(b)的15个连续核酸相同。所述引物也可以是约30个或更少核苷酸的任何寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有选自或衍生自引物序列(a)-(b)中任一种的区段。所述引物中的核苷酸数目在引物合成和PCR方法中应该高至足够保留选择性、而低至足够保留有效性和可操作性。所述引物可以具有多种改变，包括核苷酸缺失、添加或取代，其改变程度使得所述引物序列(a)-(b)在Vβ13.1-LGRAGLTY检测中仍保留作为引物起作用的能力。
按照本发明的Vβ13.1-LGRAGLTY检测方法在检测样品中的任何Vβ13.1-LGRAGLTY存在的方法中应用一对上述引物。需测试Vβ13.1-LGRAGLTY存在的样品是一种核酸、最好是DNA。所述DNA可以是基因组DNA、cDNA、先前通过PCR扩增的DNA或任何其它形式的DNA。所述样品可以从表达T细胞受体β链基因的任何动物或人体组织中直接或间接分离出来。一种优选的机体组织是外周血单核细胞(PBMC)。如果样品是基因组DNA，则它可以从机体组织中直接分离出来。如果样品是cDNA，则它可以通过从机体组织直接分离出来的mRNA的反转录而间接分离出来。如果样品是先前通过PCR扩增的DNA，则它可以通过基因组DNA、cDNA或任何其它形式的DNA扩增而间接分离出来。
在一个优选的实施方案中，扩增来自Vβ13.1T细胞的T细胞受体基因的一部分，以增强检测Vβ13.1-LGRAGLTY(5’-CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC-3’(SEQ ID NO1))存在的能力，所述基因部分包含LGRAGLTY基序编码序列。所述扩增可以采用提供灵敏、选择性快速扩增所述样品中所述部分的任何特定PCR技术或设备通过PCR反应进行。
例如，PCR扩增可以采用这样的流程其中制备含有以下组分的反应混合物5μL10×PCR缓冲液II(100mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl)、3μL 25mM MgCl2、1μL 10mM dNTP混合物、0.3μL Taq聚合酶(5U/μL)(AmpliTaq Gold，Perkin Elmer，Norwalk，CT)、30pmol引物A和30pmol引物B。根据本发明的公开内容，技术人员将能够选择合适的引物A和B，通过PCR扩增来自Vβ13.1T细胞的T细胞受体基因的所述部分。上述混合物适合于扩增1μL样品DNA。在下文，可以将需扩增的DNA称为“模板”。
一旦向上述反应混合物中加入样品DNA，则用以下的扩增形式进行总共35个循环的所述PCR反应95℃1分钟(变性)；56℃20秒(退火)和72℃40秒(延伸)。
在所述PCR反应中，可以将所述模板加热变性且退火成两种寡核苷酸引物。所述寡核苷酸包括需扩增的核酸序列区。在所述反应混合物中包括一种热稳定DNA聚合酶。通过添加合适的互补核苷酸，所述聚合酶可延伸退火至互补DNA的引物。优选聚合酶的特征为在至少95℃的温度下是稳定的、持续合成能力为50-60且延伸速率高于50个核苷酸/分钟。
在典型的PCR扩增反应中采用大约40个PCR循环。然而，某些PCR反应可以进行少至15-20个循环或多至50个循环。每个循环包括一个解链步骤，其中将所述模板加热至温度超过约95℃。
然后，将PCR反应温度冷却至允许所述引物退火至所述模板。在该退火步骤中，将反应温度调节在约55℃-72℃之间持续约20秒。根据具体的反应可以采用更长或更短的时间。
然后，将PCR反应温度加热至允许最大延伸所述聚合酶所作用的引物。在该延伸步骤中，将反应温度调节在约70℃-75℃之间持续约40秒。根据具体的反应可以采用更高或更低的温度和/或更长或更短的时间。
另外，在第一个循环开始之前，反应混合物可以经过一个初始变性持续约5-15分钟。同样，在最后一个循环结束之后，反应混合物可以经过一个最后延伸持续约5-10分钟。
可以采用两步PCR进行扩增。在该技术中，进行第一个PCR扩增反应，以扩增大于且包含目的区的第一个区。然后，采用第一个区为模板，进行第二个PCR扩增反应，以扩增目的区。如果来自第一个PCR反应的任一种引物可以在第二个PCR反应中使用，则所述第二个RCR反应是“半嵌套式”。如果来自第一个PCR反应的引物在第二个PCR反应中不能使用，则所述第二个RCR反应是“嵌套式”。
在实施本发明方法的一个优选方式中，通过两步PCR扩增Vβ13.1-LGRAGLTY基序。在第一个PCR反应中，采用退火至T细胞受体基因Vβ区的第一种引物和退火至T细胞受体基因Cβ区的第二种引物，使用以上公开的反应混合物和形式扩增所述样品。第一个PCR反应扩增约600 bp的第一区且从Vβ通过Vβ-Dβ-Jβ连接延伸至Cβ。第二个PCR反应是嵌套式或半嵌套式；用引物对(a)-(b)部分扩增第一区的一部分。第二个PCR反应扩增目的区。
在样品中的任何Vβ13.1-LGRAGLTY编码DNA扩增后，检测扩增产物。该检测可以通过多种方法来进行。例如，可以将等份的扩增产物上样至电泳凝胶上，应用电磁场根据大小分离DNA分子。在另一种方法中，将等份的扩增产物上样至可用SYBR green、溴化乙锭或与DNA结合且发射可检测信号的另一种分子染色的凝胶上。例如，溴化乙锭可与DNA结合且当用紫外光照射时发出可见光。另一方面，经干燥的凝胶可以含有与所扩增的模板序列的一部分互补的放射性标记或化学标记的寡核苷酸(下文称为“寡核苷酸探针”)，通过将所述凝胶对胶片曝光，进行放射自显影。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含(a)长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ IDNO1的至少10个连续核苷酸或与其互补的核酸序列；(b)标记部分。
优选“(a)”是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸或与其互补的序列。最优选的是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO1或与其互补的序列。所述标记部分最好选自32P或洋地黄毒苷。
一种可用于检测采用本发明引物产生的扩增产物的典型放射性标记寡核苷酸取自Vβ-Dβ-Jβ区。如果Vβ13.1-LGRAGLTY区通过以上公开的两步半嵌套PCR来扩增，其中使用对应于LGRAGLTY基序编码序列的引物，则可以使用任何与所扩增的Vβ13.1-LGRAGLTY区任一链的一部分互补的约10个或更多个核苷酸、最好是约18个或更多个核苷酸的寡核苷酸。更优选用寡核苷酸 5’-CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC-3’(SEQ ID NO1)或与其互补的核酸序列作为探针。
本发明也包含一种试验试剂盒，所述试验试剂盒包含长约15-30个核苷酸的第一种引物(a)，所述第一种引物(a)包含SEQ ID NO1的至少10个连续核苷酸或与其互补的核酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述试验试剂盒还包含第二种引物(b)，其中所述第二种引物是一种长约15和30个核苷酸的核酸序列，所述核酸序列不包含序列(a)并存在于T细胞中的Vβ13.1T细胞受体基因Vβ-Jβ区中。
其中序列(a)和序列(b)不存在于所述T细胞受体基因的同一条链上。
更优选所述第一种引物是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO1的11、12、13、14、、15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸或与其互补的序列。最优选的是一种长约15-30个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO1或与其互补的序列。
在该实施方案中，所述试验试剂盒还包含至少一种可用于通过如上所述的RCR技术扩增Vβ13.1-LGRAGLTY DNA的试剂。在所述试剂盒中可以包括的示例性试剂包括但不限于缓冲剂、三磷酸脱氧核苷、热稳定DNA聚合酶例如Taq聚合酶、Vβ13.1-LGRAGLTY DNA(阳性对照)和非Vβ13.1-LGRAGLTY DNA(阴性对照)。在所述试剂盒中可以包括的其它试剂是本领域技术人员已知的。
在另一个优选的实施方案中，所述试验试剂盒还包含标记部分。所述标记部分最好是32P或洋地黄毒苷。
本发明的另一个实施方案涉及长8个至约45个氨基酸残基的肽，所述肽包含LGRAGLTY基序(即包含序列SEQ ID NO3)。在本发明该实施方案的各个方面，所述肽包含序列SEQ ID NO32的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个连续氨基酸。优选所述肽序列是SEQID NO3或者所述序列是SEQ ID NO32的残基2-21。最优选所述肽序列是SEQ ID NO32残基2-21。在本发明该实施方案的一个优选方面，所述肽以纯化肽存在。所谓“纯化肽”是指在所述样品中所述多肽的大多数(高于50％)是所需要的肽。优选所需肽占所述纯化肽样品中肽的70％以上。更优选所述肽占所述样品中肽的90％以上。甚至更优选所述肽占所述样品中多肽的95％以上。另外，术语“纯化肽”表示所述样品不含干扰本发明实施的物质。
按照本发明该方面的肽可以来自任何与本发明匹配的来源，或者是天然的或者是合成的(它们可以得自技术人员已知的商业来源)。
本发明的其它实施方案提供包含上述肽的药用组合物。生产药用肽组合物的方法是本领域已知的，参见例如美国专利第6,066,619号和第6,068,850号，所述专利通过引用结合到本文中。本发明该实施方案的各个方面可以包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂且不含任何生物学上有害的物质。本发明的药用组合物可以由本领域技术人员配制。示例性的药用制剂也描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences(Alfonso R.Gennaro编著，第16版，1980)中，所述文献是药学领域的标准参考教科书，通过引用结合到本文中。
所述药用组合物可以还包含着色剂或稳定剂、渗透剂、抗细菌剂或不干扰所述组合物功能的任何其它物质。本发明的药用组合物可以例如用药学上可接受的胃肠外溶媒配制为溶液剂、混悬剂或乳剂。所述溶媒可以含有维持等渗性的添加剂(例如氯化钠或甘露醇)和维持化学稳定性的的添加剂(例如缓冲剂或防腐剂)。人们将会认识到，内毒素污染应该保持在安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。此外，对于人类给药，根据美国食品及药品管理局生物学标准部(Office ofBiological Standards)的要求，制剂应该符合无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。所述制剂可以通过常用技术例如过滤而除菌。
短语“药学上可接受的”是指适当时给予动物或人类时不产生不利反应、变态反应或其它不当反应的物质和组合物。引起任何这些副作用的物质在本发明范围内被称为“生物学上有害的”物质。药学上可接受的物质和组合物可以包括但不限于溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。考虑了与本发明相容的其它任何常规组分的应用。此外，在本发明组合物中也可以加入发挥某些其它药理学上有利目的的补充有效成分。
本发明也包括一种治疗自身免疫病的方法。所述疾病是其中至少对于某些患者，在Vβ13.1T细胞上发现包含LGRAGLTY的T细胞受体的疾病。所述患者可能存在其它类型的T细胞和/或缺乏包含LGRAGLTY基序的T细胞受体的Vβ13.1T细胞。所述方法包括(a)从病人中获得MBP83-99Vβ13.1T细胞；(b)通过上述方法检测LGRAGLTY基序编码核酸的存在；如果检测到所述核酸，那么(c)将包含长9个至约45个氨基酸残基的一种或多种肽的药用组合物给予所述病人；其中每种肽均由LGRAGLTY基序组成。
在该方法的各个方面，给予所述病人的药用组合物包含具有序列SEQ ID NO32的9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个连续氨基酸的一种或多种肽。优选所述肽序是SEQ ID NO3或者所述肽序列包含SEQ ID NO32的残基2-21。最优选所述肽序列是SEQ ID NO32的残基2-21。
所述自身免疫病可以是任何其中Vβ13.1T细胞上发现包含LGRAGLTY基序的T细胞受体的自身免疫病。本发明所考虑的自身免疫病包括但不限于类风湿性关节炎、重症肌无力、多发性硬化、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、Graves氏病、炎性肠病、自身免疫性眼色素层视网膜炎、多肌炎和某些类型的糖尿病。一种优选的自身免疫病是多发性硬化(MS)。
如果通过以上公开的方法检测到LGRAGLTY基序编码核酸，则所述自身免疫病可以通过给予包含如上所述的一种或多种肽的药用组合物进行治疗。本发明的药用组合物可以单独给予或者与T细胞活化标记肽一起给予。按照Zhang的美国专利申请60/099,102的公开内容，所述药用组合物最好与T细胞活化标记肽一起给予，所述专利申请通过引用结合到本文中。给予所述肽可以产生免疫原性反应，其中所述患者将会产生识别且结合Vβ13.1T细胞上存在的T细胞受体LGRAGLTY基序的抗体和T细胞受体。
因为Vβ13.1-LGRAGLTY可以在MS患者和未患所述疾病的正常个体中存在，所以设想本发明的药用组合物可以给予MS患者和正常个体。
在一个替代实施方案中，如果通过以上公开的方法检测到LGRAGLTY基序编码核酸，则所述自身免疫病可以通过定量所述核酸进行监测。样品例如PBMC中存在的所述核酸的量越高，Vβ3.1T细胞数目越多，则所述自身免疫病症状的严重程度可能越高。另外，根据升高的Vβ13.1T细胞水平和出现症状之间的时间，临床医师可以有机会接受应用将症状的严重程度减至最低的疗法和/或在症状出现之前治疗所述疾病。
包括用来说明本发明优选实施方案的下述实施例。本领域技术人员将会认识到，下文实施例中所公开的技术代表本发明人发现可很好地实施本发明的技术，因此认为可构成本发明实施的优选模式。然而，本领域技术人员将会认识到，根据本发明的公开内容，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行多种变化并且仍可获得相同或相似的结果。
实施例实施例1来源于不同MS患者的MBP83-99特异性T细胞克隆共享的T细胞受体Vβ-Dβ-JβDNA序列和序列基序从7位MS患者中产生一组20个CD4+独立T细胞克隆。根据利用用DRB1*1501转染的小鼠成纤维细胞(L细胞)作为抗原呈递细胞的测定，所有T细胞克隆在HLA-DR2情况下都识别髓鞘碱性蛋白83-99肽(MBP83-99)。采用Vα和Vβ特异性寡核苷酸引物，以反转录PCR(RT-PCR)表征所述T细胞克隆的TCR V基因重排，随后对Vα-Jα和Vβ-Dβ-Jβ连接区测序。所述连接区的序列示于表1和表2中。
表1.总结了采用一组对Vα基因家族特异性的寡核苷酸引物通过反转录PCR分析按照其Vα基因使用表征的一组20个独立的MBP83-99特异性T细胞克隆的结果(所用的独特引物序列在对应于每个克隆的DNA序列中以下划线表示)。每个克隆的“Vα”、“n”、“Jα”和“Cα”部分的氨基酸序列示于表1中。如下所述将“n”部分下划线，“Vα”和“Jα”序列在其“n”序列的相应一侧以粗体表示，而“Cα”序列以无下划线的正常字体表示。将所扩增的PCR产物与洋地黄毒苷标记的CαcDNA探针杂交，随后对其DNA序列进行分析。
表2.总结了一组20个独立的MBP83-99特异性T细胞克隆的分析结果。采用对26个Vβ基因家族特异性的一组寡核苷酸引物，通过反转录PCR分析所述克隆的Vβ基因使用(每个克隆的特异性引物序列在相应的DNA序列以下划线表示)。每个克隆的“Vβ”、“D”、“Jβ”和“Cβ”部分示于表2中。如下所述将“D”部分下划线，“Vβ”和“Jβ”序列在其“D”序列的相应一侧以粗体表示，而其余的序列“Cβ”以正常字体(无下划线或加粗)表示。将所扩增的PCR产物与洋地黄毒苷标记的CβcDNA探针杂交，随后对其DNA序列进行分析。
表1MBP83-99肽特异性TCR Vα基因序列
表2MBP83-99肽特异性TCR Vβ基因序列
虽然Vα和Vβ重排在不同MBP83-99T细胞克隆之间有所变化，但是许多来源于特定个体这些独立的T细胞克隆与相同的Vα-Jα和Vβ-Dβ-Jβ连接区序列共享相同的Vα和Vβ链。这一发现与先前报道的MBP83-99特异性T细胞在特定MS患者体内的体内克隆扩增相符合(Vandevyver 1995，Wucherpfenning 1994)。
有趣的是，如表1和表2所示，来源于1位患者(MS-1)的独立T细胞克隆(克隆E2.6)与从另一患者(MS-2)获得的4个T细胞克隆中的3个(克隆C3.1、D7.16和F3.4)共享相同的Vβ13.1和Vα17。这些T细胞克隆的Vβ13.1在Vβ-Dβ-Jβ连接区内共享相同的DNA序列。
实施例2Vβ-Dβ-Jβ特异性寡核苷酸引物在检测原始MBP83-99T细胞克隆以及在会有原始MBP83-99T细胞的PBMC中存在的相应DNA序列时是高特异性和灵敏的按照独立的MBP83-99T细胞克隆Vβ-Dβ-Jβ连接区内的DNA序列，合成一组14个寡核苷酸引物，随后在RT-PCR中检查它们的特异性。这些寡核苷酸引物的DNA序列示于表3中。
表3Vβ-Dβ-Jβ特异性寡核苷酸引物的DNA序列T细胞克隆 DNA序列SEQIDNOMS1-E3.1AGCAGCCAAGATCGTTTTTGG SEQ ID NO68MS1-E2.6CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTACSEQ ID NO69MS2-C3.1CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTACSEQ ID NO70MS2-D4.4MS3-F5.12 TACTCGATTAGGGGACAGGGTAACSEQ ID NO71MS3-B9.8MS4-D9.3CAAGATCGGGTTGCGCCA SEQ ID NO72MS4-B9.1ACCCGGCAAGGACCTCAAGAGACCSEQ ID NO73MS5-D2.7AGCTTAGGACAGGGGGCT SEQ ID NO74MS5-D1.3MS6-D8.1GCCAGCCGGGACAGGTCC SEQ ID NO75MS6-D1.2GAGTAGATTGGTACGGGA SEQ ID NO76MS7-C.26MS8-C7.2TACATCTGAAGTGCTATAGAC SEQ ID NO77这些Vβ-Dβ-Jβ特异性引物只与存在于原始MBP83-99T细胞克隆中的DNA序列结合，而不与来源于非相关性MBP83-99T细胞克隆的序列结合(图2)，表明其对原始Vβ-Dβ-Jβ DNA序列的高度特异性。注意到唯一例外的是克隆MS1-E2.6和克隆MS2-C3.1，其中同一种引物与两个T细胞克隆共享的Vβ-Dβ-Jβ连接DNA序列结合。
已知Vβ-Dβ-Jβ寡核苷酸引物的特异性和PCR检测系统的高灵敏性，我们要知道用5’Vβ引物和Vβ-Dβ-Jβ特异性寡核苷酸引物该两步PCR检测系统是否可以用来检测在从由其获得MBP83-99T细胞克隆的外周血单核细胞(PBMC)标本中存在的相应Vβ-Dβ-Jβ DNA序列，两个独立实验结果表明，可阳性检测原始PBMC标本中的Vβ-Dβ-Jβ序列。因此，所述发现证明，其中Vβ-Dβ-Jβ序列用作指印的PCR检测系统通过探测相同的DNA序列在微定量外周血单核细胞中存在的MBP83-99T细胞中是特异性和灵敏的。
实施例3来源于不同MS患者和健康个体的PBMC标本中的共同Vβ-Dβ-JβDNA序列的检测接下来，我们检查对应于MBP83-99T细胞克隆Vβ-Dβ-Jβ连接区的DNA序列是否可以在随机选自一组MS患者和健康个体的PBMC标本中检测到。使用采用对相应Vβ家族特异性的引物(在第一个PCR中)和对Vβ-Dβ-Jβ序列特异性的引物(在第二个半嵌套式PCR中)的相同PCR扩增系统。并结合用相应Vβ-Dβ-Jβ探针进行杂交的蛋白质印迹分析。已知两步PCR检测系统的特殊要求和Vβ-Dβ-Jβ引物和探针的特异性，因此所鉴定的DNA序列来源于特定TCRVβ链，并且代表与目的Vβ-Dβ-Jβ序列相同或相似。
结果表明，只有一种Vβ-Dβ-Jβ寡核苷酸引物(MSI-E2.6，Vβ13.1-LGRAGLTY)在得自不同MS患者的48个PBMC标本中的15个(31％)检测到互补TCRVβ13.1DNA序列。因此，这一发现表明，在这些MS患者中存在表达Vβ13.1-LGRAGLTY的MBP83-99T细胞。在类似的实验条件下，所述同一种引物也检测到来源于健康个体的20个PBMC标本中的5个(25％)中的相应DNA序列。其余的13种Vβ-Dβ-Jβ引物在同一组的PBMC标本中未能鉴定出任何序列信号。在三个独立实验中，所述结果是可再现的。所鉴定的DNA产物通过源自表达Vβ13.1的T细胞的E2.6引物进行扩增，因为Vβ13.1特异性引物在第一个扩增PCR中使用。
此外，所鉴定的Vβ3.1-LGRAGLTY序列也在从5位MS患者(MS-35、MS36和MS39)产生的24个短期MBP83-99 T细胞系中的13个(54％)中得到扩增，所述MS患者的PBMC标本显示含有Vβ13.1-LGRAGLTY序列。因此，结果证实在来源于识别MBP83-99的T细胞的PBMC标本中检测到Vβ13.1-LGRAGLTY DNA序列。这一发现也表明，表达Vβ13.1-LGRAGLTY序列的MBP83-99T细胞代表存在于在某些MS患者中的所有或大多数MBP83-99T细胞系。
其中用Vβ-Dβ-Jβ序列作为指印的联合PCR-DNA杂交检测系统通过检测相同的Vβ-Dβ-Jβ连接序列提供微定量抗原特异性T细胞的强有力的工具。所述检测系统的高特异性和灵敏性使得可以鉴定外周血T细胞中的特定Vβ-Dβ-Jβ序列。本项研究首次证明，在大约30％MS患者中存在识别MBP的免疫显性83-99肽且均一表达相同Vβ-Dβ-Jβ序列的共同Vβ13.1T细胞亚群。所述结论根据本文所述的分步实验得出。首先，在来源于不同MS患者的独立MBP83-99T细胞克隆中发现相同的DNA序列(Vβ13.1-LGRAGLTY)。其次，从得自不同MS患者PBMC标本的TCR Vβ13.1扩增的cDNA产物中鉴定出所述序列。第三，在从显示含有Vβ13.1-LGRAGLTY序列的PBMC标本产生的短期独立MBP83-99T细胞系中检测到所述DNA序列。表达Vβ13.1-LGRAGLTY序列的MBP83-99T细胞似乎代表从某些MS患者产生的所有或大多数MBP83-99T细胞系。最后，通过重组DNA克隆和直接DNA测序证实在PBMC标本中存在Vβ13.1-LGRAGLTY序列。
此外，在某些健康个体中也存在表达共同Vβ13.1-LGRAGLTY序列的MBP83-99T细胞并未使人感到意外。迄今为止报道的研究指出，在某些健康个体中也存在MBP反应性T细胞，包括识别免疫显性83-99肽的T细胞(Zhang 1994，Ota 1990)。然而，与健康个体相反，存在这样的功能性差异这些T细胞在MS患者中体内活化和克隆扩增(Zhang1994)。
这些共享共同Vβ-Dβ-Jβ序列的Vβ3.1MBP83-99T细胞可能代表在某些MS患者中存在的相当大比例的MBP83-99T细胞。这一可能性得到以下观测的支持在两个刺激周期之后，在从MS患者产生的短期MBP83-99T细胞系中的40％存在Vβ13.1-LGRAGLTY序列。
在定量PCR检测系统中，可以用所鉴定的共同Vβ-Dβ-Jβ序列作为特异性标记，以检测大量MS患者血液和脑脊液中的共同MBP83-99T细胞亚群，以监测与所述疾病潜在相关的体内克隆扩增和体内活性。该方法要好于常规基于细胞培养的测定，因为MBP反应性T细胞的体外选择和扩增常常受到细胞培养中固有的各种抑制因子阻碍。这与最近的研究相一致，在最近的研究中当用直接离体分析对MBP反应性T细胞定量时，发现MBP反应性T细胞频率在MS患者中相当高(Hafler为最后一位作者的JEM1997)。
此外，在MS患者中，已经显示对应于所述TCR的合成肽诱导T细胞抗独特型T细胞对MBP反应性的应答(Chou等，J.I.)。因此，含有共同CDR3序列的TCR肽在诱发抗独特型T细胞抑制其MBP83-99T细胞带有共同CDR3序列基序的患者群中的特异性MBP反应性T细胞亚群时可能具有巨大的潜力。用这样一种共同CDR3肽免疫将会优于在MS患者中用CDR2肽或个体依赖性CDR3肽作为可能的治疗方案(Vandenbark 1996)。
实施例4对MS患者通过T细胞接种诱导针对免疫MBP反应性T细胞克隆和20-mer TCR肽的免疫应答并且从免疫患者产生生产抗掺入共同CDR3序列的TCR肽的特异性抗体的B细胞系已经证明，用经照射的自体MBP反应性T细胞克隆皮下接种在MS患者体内诱导显著抗独特型T细胞应答，其与用于接种的循环MBP反应性T细胞的进行性耗竭相关(Medaer等，1995)
材料和方法试剂和肽细胞培养所用的培养基是Aim-V无血清培养基(Lif Technologies，Grand Island，NY)。MBP的免疫显性肽(残基83-99)和20个氨基酸的两种TCR肽由Chiron Mimotope(San Diego，CA)合成。所述肽的纯度高于95％。
MBP反应性T细胞前体细胞率的估计PBMC在MBP(40μg/mL)存在下以200,000细胞/孔(总共96个孔)平板接种。7天后，所有细胞培养物在经照射的自体PBMC存在下用MBP再刺激。1周后，将每孔分成4个等份(每份约104细胞)，与105经照射的自体PMBC一起在MBP存在和不存在时以双复份培养。培养3天后，在培养的最后16小时用[3H]胸苷(Nycomed Amersham，Arlington Heights，IL)以1μCi/孔脉冲处理。然后采用自动化细胞收获器收获细胞，测量[3H]胸苷掺入。
孔/培养物定义为当计数/分钟(CPM)大于1000且超过参比CPM(在无MBP时)至少3倍时对MBP或MBP肽的特异性。然后通过特定孔数除以在原始培养物中接种的PBMC总数(19.2×106细胞)，估计MBP反应性T细胞的前体细胞率。
髓鞘反应性T细胞克隆用限制稀释测定，在2μg/ml植物凝集素-蛋白(PHA-P)存在下，克隆所鉴定的阳性T细胞系。每3-4天用新鲜培养基饲喂培养物。用增殖测定测试生长阳性孔对MBP83-99肽的比反应性。所产生的MBP83-99特异性T细胞克隆进一步表征，可供T细胞接种用。
TCRV基因分析和DNA测序采用反转录PCR分析免疫MBP反应性T细胞克隆的T细胞受体V基因重排。如文献所述方法(Vandevyer等，1995；Zhang，Y.C.Q.等1998)，将TCRα和β链扩增并直接测序。概括地说，采用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN，Santa Clarita，CA)，从每个MBP83-99反应性T细胞克隆106细胞提取总RNA。用一组对其序列已公布的TCR Vα和Vβ基因家族(Vandevyer等，1995；Zhang，Y.C.Q.等1998)特异性的引物，使从总RNA反转录的第一链cDNA经过PCR扩增。所扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶中通过电泳分离，用溴化乙锭染色。切下显现的PCR产物，随后用QIAquicO凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Santa Clarita，CA)纯化，最后进行序列分析。经纯化的PCR产物用T7测序试剂盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)直接测序。采用双脱氧链终止法，用2pmol相应的基因引物对1.5μg模板测序。
用经照射的自体MBP反应性T细胞克隆免疫MS患者在本项研究中包括通过核磁共振图象证实的2位临床确定的MS患者。他们被诊断为患有复发-缓解性MS已有2年多。在本项研究之前，所述患者不再接受任何免疫调节药至少3个月。如先前所述(J.Zhang等1992，1993)，用经照射的自体MBP83-99反应性T细胞克隆进行免疫。概括地说，注射前7天，使MBP83-99反应性T细胞克隆在PHA存在下活化和扩增。然后以10,000rads(采用60Co源)照射细胞，然后用无菌生理盐水充分洗涤。将得自2个自体T细胞克隆的总共4×107细胞重悬于2ml无菌生理盐水中，手臂皮下注射。每位患者以2个月的间隔总共接受4次注射，以实现适当免疫应答，通过对免疫T细胞克隆的PBMC增殖测定。所述方案得到Baylor College ofMedicine的the Institutional Human Subjects Committee批准。在解释所述实验方案后，从所述患者获得同意表。在每次免疫之前和之后，评价患者的负面事件和劳动能力丧失计分(disability score)(ExpandedDisability Scale Score)。在免疫前和免疫后的不同时间点进行钆增强的MRI扫描。所述临床评价和放射照片评价是独立临床研究的组成部分。
通过EBV转化产生抗体生产B细胞系所述方法如文献所述(J.Zhang，1989，1991)。概括地说，在生产EBV的B95.8系(ATCC，Bethesda，MD)的无细胞上清液和0.5μg/ml选择性抑制T细胞生长的环孢菌素A(Sandoz，Basel，Switzerland)存在下，将PBMC以20,000细胞/孔接种到微量滴定板(Costar，Cambridge，MA)中。将细胞培养14天，每3-4天更换一次培养基。在第14天，出现生长阳性孔，收获培养上清液，供试验用。通过阳性孔数除以接种的PBMC总数，估计产生特异性抗体的B细胞的前体细胞率。随后将阳性B细胞系转移至24-孔板(Costar，Cambridge，MA)，供扩增用。所述B细胞系通常产生2-10μg/ml相当纯的抗体。
通过ELISA检测抗TCR抗体从单个B细胞系收集培养上清液，采用ELISA测试抗独特型抗体的存在。概括地说，将微量滴定板分别用基序-阳性TCR肽或对照TCR肽以浓度1μg/ml于4℃包被过夜。然后各孔用含有2％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，St.Louis，MO)的PBS于37℃封闭2小时，然后用含0.02％Tween_20(Sigma，St.Louis，MO)的0.9％NaCl溶液洗涤4次。向相邻孔中加入每种样品及其对照，孵育2小时。各板洗涤4次，与用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG/IgM抗体以1∶1500稀释(Sigma，St.Louis，MO)一起孵育30分钟。使用0.0125％四甲基联苯胺/0.008％H2O2的柠檬酸缓冲液(pH＝5.0)作为底物，用2N H2SO4终止显色反应。采用ELISA读数仪(Biorad，Hercules，CA)测量光密度。只含有培养基的孔用作背景对照。
免疫印迹分析采用文献中所述的标准方法(Hjelmeland等，1984)，从表达共同CDR3序列的代表性MBP反应性T细胞克隆(MS7.E2.6)制备裂解液。概括地说，将5×106T细胞在含有以下组分的100μl裂解缓冲液中裂解150MNaCl、50mM Tris(pH7.6)、0.5％Triton X-100、1mM PMSF、10μg/ml抑蛋白酶肽、10μg/ml亮抑蛋白酶肽。将细胞碎片以13,000g于4℃离心20分钟。所得的裂解液采用10％SDS-PAGE电泳。吸印后，将硝化纤维素膜切成条带，然后用含0.1％Tween_20的5％低脂奶粉Tris缓冲盐溶液(milk-TBST)封闭。然后将条带与未经稀释的上清液在微型培养盘中于室温孵育1小时。将与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG和IgM(重链+轻链)用作第二抗体(100ng/ml2％milk-TBST)，与经洗涤的条带一起孵育45分钟，然后让所述膜(Amersham，Piscataway，NJ)上的蛋白质通过增强化学发光显现。用从产生非反应性抗体的EBV转化B细胞系获得的上清液作为阴性对照。包括作为阳性对照的兔多克隆抗人TCR-β链抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)。
流式细胞术将表达共同CDR3序列的代表性MBP反应性T细胞克隆(MS7-E2.6)与来源于单独B细胞系的抗独特型抗体一起于4℃孵育30分钟。用从产生非反应性抗体的EBV转化B细胞系获得的上清液作为对照。将细胞用FACS缓冲液(含有5％胎牛血清和0.01％叠氮化钠的PBS)洗涤、以2300rpm于4℃离心2分钟后，重新悬浮，用与荧光素(FITC)缀合的山羊抗人IgG/IgM抗体染色。洗涤2次后，将细胞重悬于300μlFACS缓冲液中，运用FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)，通过流式细胞术进行分析。用FITC缀合的抗IgG1检测背景染色(BectonDickinson，San Jose，CA)。
抑制测定将20,000个细胞的免疫MBP反应性T细胞克隆(基序-阳性和基序-阴性T细胞克隆)在有和无MBP83-99肽(20μg/ml)的情况下在150μl经照射的自体PBMC(100,000细胞/孔)中培养。向各孔中加入50μl未经稀释的上清液。72小时后，用[3H]-胸苷掺入测定测量细胞增殖。用从产生非反应性抗体的EBV转化B细胞系获得的上清液作为对照。
结果免疫MBP反应性T细胞克隆的功能和结构特征从2位复发-缓解性MS患者产生四个为一组的MBP反应性T细胞克隆。这些T细胞克隆在DR4或DR2(DRB1*1501)分子的情况下表达CD4表型且识别MB83-99免疫显性肽。采用Vα和Vβ特异性引物通过RT-PCR分析其TCRV基因重排，随后对Vα-Jα和Vβ-Dβ-Jβ连接区测序。来源于患者MS7的独立T细胞克隆(E2.6)与从不同患者(MS27)中获得的另一T细胞克隆(C3.1)共享相同的TCR Vα17和Vβ13.1基因。这两个T细胞克隆在Vβ13.1-Dβ-Jβ连接区都具有相同序列SEQ ID NO3，而它们的Vα17链却具有两个不同的Vα-Jα连接区序列。如上文所述，所鉴定的LueGlyArgAlaGlyLeuThrTyr(SEQ ID NO3)序列代表不同MS患者(23)中识别MBP83-99免疫显性区的Vβ13.1T细胞中的共同CDR3基序。
通过T细胞接种MS患者诱导针对免疫MBP反应性T细胞克隆和20-mer TCR肽的免疫应答每位患者以2个月的间隔总共接受4次皮下接种，每次接种2个经照射的自体MBP反应性T细胞克隆(2×107细胞/克隆)。在相当于基线和最后一次免疫后2个月的2个时间点，检查PBMC对自体免疫T细胞克隆的增殖反应。如图8A所示，对这两个经照射的免疫T细胞克隆的增殖反应在T细胞接种后的患者中增加，显著超过基线值。此外，与来源于非免疫T细胞克隆的对照CDR3肽(基序-阴性肽，由SEQID NO48的氨基酸1-20组成)相反，针对掺入共同CDR3序列的TCR肽(基序-阳性肽，由SEQ ID NO32的氨基酸2-21组成)应答在接种后是明显的。然而，对基序-阳性肽应答的比增殖幅度明显低于通过经照射的免疫T细胞诱导的比增殖(图8A)。针对免疫T细胞的增殖反应与免疫患者循环MBP反应性T细胞频率下降呈负相关(图8B)。
从免疫患者产生生产抗掺入共同CER3序列的TCR肽的特异性抗体的B细胞系然后，我们检查用经照射的T细胞免疫在所述患者体内是否诱发特异性抗独特型抗体应答。作为表达可以干扰血清抗独特型抗体检测的表面分子阵列的完整T细胞，用掺入共同CDR3序列的TCR肽(基序-阳性肽)作为抗原供筛选用。在所有实验中都包括作为对照的来源于非免疫MBP反应性T细胞克隆的20-mer TCR肽(基序-阴性肽)。在免疫T细胞克隆没有检测到对照肽的CDR3序列。
采用ELISA或流式细胞术，当用来源于2位患者的血清试验时，未能检测到对TCR肽或原始免疫T细胞的反应性特异性抗体(数据未显示)。为了进一步确证在接种患者中是否存在抗独特型抗体，我们采用基于细胞培养的技术连同用有限稀释的EBV转化一起，从接种后血液样本中产生一组抗体生产B细胞系(参见材料和方法)。
由于接种前PBMC不可用于所述实验中，因此用从2位随机所选健康个体中获得的细胞作为对照研究对象并且在相同实验条件下进行分析。用ELISA分别测试所得B细胞系(来自每位患者/个体的92个细胞系)上清液抗基序-阳性TCR肽和对照TCR肽抗体的存在。当抗体表现出对所述基序-阳性TCR肽但不对对照TCR肽特异反应性时，所述抗体定义为抗独特型抗体。如图9所示，与2个非免疫对照研究对象相比，产生特异性抗独特型抗体的B细胞在患者MS7和MS27中分别以1.75×10-6前体细胞率存在。相反，在相同上清液中没有检测到对对照肽有反应性的特异性抗体。结果表明，高频率产生抗独特型抗体的B细胞与T细胞接种相关。
根据本发明的公开内容，无需过度实验，可以进行并实施本文中所公开和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管通过优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本发明的组合物和方法和本文所述方法的步骤或步骤顺序进行各种变化。更准确地讲，显而易见的是可以用与化学和生理学相关的某些试剂取代本文所述的试剂，同样可以实现相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有这类相似的取代和修改都认为在本发明的精神、范围和概念内，仅受所附权利要求书的限制。
参考文献本文中所列的所有参考文献，因为是描述和/或权利要求授权所必需的，所述文献通过引用结合到本文中。
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序列表<110>Jingwu，Zhang Z.
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<160>77<170>PatentIn version 2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>合成<400>1ctagggcggg cgggactcac ctac 24<210>2<211>400<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>2catgtctccg ataacccaga ggatttcccg ctcaggctgc tgtcggctgc tccctcccag 60acatctgtgt acttctgtgc cagcagccta gggcgggcgg gactcaccta cgagcagtac 120ttcgggccgg gcaccaggct cacggtcaca gaggacctga aaaacgtgtt cccacccgag 180gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag atctcccaca cccaaaaggc cacactggta 240tgcctggcca caggcttcta ccccgaccac gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag 300gaggtgcaca gtggggtcag cacagacccg cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat 360gactccagat actgcctgag cagccgcctg agggtctcgg400
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acggtcacag aggacctgaa aaac 84<210>64<211>31<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>64Tyr Phe Cys Ala Ile Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ile Tyr1 5 10 15Phe Gly Glu Gly Ser Trp Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys20 25 30<210>65<211>93<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>65tacttctgtg ccatcagtga ggggtccagc tctggaaaca ccatatattt tggagaggga60agttggctca ctgttgtaga ggacctgaac aag 93<210>66<211>26<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>66Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Ile Asp Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr1 5 10 15Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys20 25<210>67<211>78<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>67ttctacatct gcagtgctat agacggctac accttcggtt cggggaccag gttaaccgtt60
gtagaggacc tgaacaag 78<210>68<211>21<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>68agcagccaag atcgtttttg g 21<210>69<211>24<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>69ctagggcggg cgggactcac ctac 24<210>70<211>24<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>70ctagggcggg cgggactcac ctac 24<210>71<211>24<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>71tactcgatta ggggacaggg taac 24<210>72<211>18<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>72caagatcggg ttgcgcca 18<210>73
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1.一种8个至约45个氨基酸长度的肽，所述肽包含SEQ ID NO3序列。
2.权利要求1的肽，所述肽是SEQ ID NO3。
3.权利要求1的肽，所述肽包含SEQ ID NO32的氨基酸2-21。
4.权利要求1的肽，所述肽由SEQ ID NO32的氨基酸2-21组成。
5.一种治疗人类自身免疫病的方法，所述方法包括(a)从病人获得MBP83-99Vβ13.1T细胞；(b)从MBP83-99Vβ13.1T细胞获得核酸样品；(c)使所述核酸样品与选自或衍生自以下寡核苷酸的引物对接触(i)长度约15-30个核苷酸的第一寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO1的至少10个连续核苷酸或其互补核酸；和(ii)长度约15个和30个核苷酸的第二寡核苷酸，所述寡核苷酸不包含所述第一寡核苷酸序列并存在于T细胞受体T细胞Vβ13.1基因Vβ-Jβ区中，其中所述第一和第二寡核苷酸序列不存在于所述T细胞受体基因的同一条链上；(d)检测LGRAGLTY基序编码核酸的存在；如果检测到所述核酸，那么(e)将长度9个至约45个氨基酸的肽给予所述病人；其中所述肽包含SEQ ID NO3序列。
6.权利要求5的方法，其中所述Vβ13.1基因序列是SEQ IDNO2。
7.权利要求5的方法，其中所述给予步骤还包括给予T细胞活化标记肽。
8.权利要求5的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO32的氨基酸2-21。
9.权利要求5的方法，其中所述肽由SEQ ID NO32的氨基酸2-21组成。
10.一种用于治疗自身免疫病的药用组合物，所述药用组合物包含长度为8个至约45个氨基酸的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO3序列。
11.权利要求10的药用组合物，其中所述肽是SEQ ID NO3。
12.权利要求10的药用组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO32的氨基酸2-21。
13.权利要求10的药用组合物，其中所述肽由SEQ ID NO32的氨基酸2-21组成。
全文摘要
在一个实施方案中，本发明涉及包含序列5’－CTAGGGCGGGCGGGACTC ACCTAC－3’或其衍生序列或它们的互补核酸序列的第一寡核苷酸。所述第一寡核苷酸可以与长15－30个核苷酸的核酸序列一起使用，以扩增Vβ13.1基因的一部分，所述核酸序列不包含所述第一寡核苷酸序列并存在于Vβ13.1 T细胞Vβ13.1基因Vβ－Jβ区中，其中所述寡核苷酸序列和核酸序列不存在于Vβ13.1基因对的相同链上。另一方面，在检测在Vβ13.1 T细胞的T细胞受体中存在的LGRAGLTY基序的方法中，所述第一寡核苷酸可以与标记部分一起使用。该基序与自身免疫病例如多发性硬化(MS)相关。一旦检测出所述基序，则所述自身免疫病可以进行治疗或监测其进展。所述自身免疫病可以通过给予包含所述LGRAGLTY基序的一种或多种肽进行治疗。
文档编号A61P21/00GK1505640SQ00819972
公开日2004年6月16日 申请日期2000年8月22日 优先权日2000年8月22日
发明者J·Z·张, J Z 张 申请人:贝勒医学院