专利名称：戊二酰亚胺类化合物s632a的制作方法
技术领域：
本发明涉及由吸水链霉菌S632(Streptomyces hygroscopicus S632)(该微生物已于2001年12月17日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京中关村邮编100080)保藏，保藏编号为CGMCC NO.0665)培养并提纯所得到的戊二酰亚胺类化合物S632A3，本发明还涉及戊二酰亚胺类化合物S632A3的制备方法和以S632A3为活性成分在治疗病毒感染、抗肿瘤药物中的应用。
a.培养在培养基中培养具有产生戊二酰亚胺类抗生素S632A3化合物能力的属于链霉菌属的微生物使之在培养物中生成和积累；b.分离按发酵产物的一般提取分离方法从发酵液中分离含有S632A3物质的粗提物；c.精制进一步分离精制S632A3，采用一般脂溶性低分子量物质的分离精制方法；本发明上述制备方法的优选条件是步骤a中的培养基是采用所用微生物能利用的营养源，其中碳源可采用葡萄糖、淀粉、甘油，可两种以上组合使用；氮源组合使用蛋白胨、黄豆饼粉、酵母粉、血胨、棉子饼粉，此外还可在培养基中适当地添加钠盐、钾盐、磷酸盐；培养方法为振荡、通气搅拌的液体培养方法；步骤a中的培养基的PH以中性附近为好，培养温度保持在25-30℃，培养时间5-7天。
步骤b所说的发酵物的一般提取分离方法是包括溶媒提取、大孔吸附树脂、层析法，首先进行过滤或离心，除去菌丝体，发酵液经大孔吸附树脂吸附，将包括S632A3的S632物质都吸附于树脂之上，再将其洗脱下来，洗脱液经减压浓缩除去溶媒后，采用溶媒萃取法将S632A3物质转移到有机溶媒中，经无水硫酸钠脱水后，减压蒸馏除溶媒得到淡黄色油状物，该淡黄色油状物经薄层层析法或柱层析法分成A、B两种组分，A组分经减压蒸馏除溶剂后，再以SephadexLH-20凝胶或制备薄层分离得到含S632A3的粗提物。
步骤c的精制是采用吸附层析及ODS-键合型硅胶的反向层析，其中以乙腈/水，甲醇/水为洗脱剂的反向层析法为佳，精制过程中的S632A3物质的确认，使用物质对其具有抑制作用的微生物作为检定菌的生物检测法及高效液相层析法联用。
本发明人经大量的试验还发现，S632A3物质对病毒和肿瘤都有一定的活性，可以认为是一种有用的抗病毒、抗肿瘤药物。这些药物组合物是由含有有效量的S632A3物质和药学上可接受的载体组成，可用于治疗病毒感染、肿瘤等。
<实施例一>
a.培养由甘油4.0％，葡萄糖0.2％，土豆淀粉0.2％，热榨黄豆饼粉2.0％，全血胨0.5％，干酵母0.5％，NaCl 0.5％，CaCO30.2％组成的培养基(PH7.0)分装到500ml的三角瓶中，15磅高压灭菌后，接种一白金耳量的Streptomyceshygroscopicus S632菌株，在27℃旋转振荡培养3天(220次/分，振幅7cm)；然后用含有甘油3.0％，葡萄糖0.2％，土豆淀粉0.2％，热榨黄豆饼粉2.0％，蛋白胨0.3％，干酵母0.5％，NaCl0.3％的培养基(PH6.4)100ml分装到500ml三角瓶中，灭菌后加入5％的上述培养的种子，28℃旋转振荡培养5-7天(220次/分，培养时间可根据PH和生物检测的结果而定，一般培养终了时PH会上升，效价达到最大。
b.分离取由上述培养得到的发酵液抽滤，滤液经Diaion HP-20大孔吸附树脂(5％，v/v)吸附后，去离子水洗涤，50％的丙酮洗脱，生物检测后，具活性的洗脱液合并，减压蒸馏除丙酮，通风橱中过夜吹去剩余丙酮，调PH至7.6，用乙酸乙酯提取两次(1/2)，乙酯乙酯相用无水硫酸钠脱水后，减压除去乙酸乙酯得淡黄色油状物质，该物质经硅胶柱层析，以氯仿∶丙酮(4∶1)为洗脱液，可分成活性组分A，B。A组分减压浓缩得到淡黄色油状物，该物质再经SephadexLH-20柱层析，甲醇为展开液，活性部分减压蒸除甲醇，得到淡黄色油状物(粗品).
c.精制将上述粗提物经反向中压柱(YAMAZEN#11 1.5×52cm)，38％的甲醇展开，分份收集，洗脱液生物活性检测(Saccharomyces cerevisiae清酒酵母)，活性洗脱液以HPLC检测[岛津LC-6A高效液相色谱仪，流动相为甲醇∶水(60∶40)，流速1ml/min，紫外检测波长230nm]，合并含有单一S632A3，物质的组分，减压除去有机溶媒后，水溶液进行乙酸乙酯提取二次，减压除去乙酸乙酯，即可得到S632A3物质。
所得到的S632A3物质的理化性质如下所示。
(1)性状淡黄色油状物(2)实验式C17H25NO4(3)分子量308(M+HSIMS)(4)紫外吸收光谱λmax(nm)289.4，233.0(
图1)(5)红外吸收光谱vmax(cm-1)3420，3210，1730-1670，1375，1260，1143，750(图2)(6)比旋光度[α]28D＝+58.7°(c 0.15，CHCl3)(7)核磁共振图谱500MHz1H-NMR图谱(图3)和300MHz13C-NMR图谱(图4)及化学位移值如表1所示(8)溶解性易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿及二甲基亚砜，难溶于水。
表1S632A3的化学位移值
对本发明化合物S632A3的药理活性试验例一、S632A3物质的抗病毒活性的测定利用琼脂平板法，S632A3在0.02μg/ml剂量下可抑制脊髓灰质炎病毒在Hela细胞上的斑点形成，S632A3在0.02μg/ml剂量下抑制新城疫病毒，水泡口炎病毒在鸡胚纤维原细胞上的斑点形成。其结果如表2所示。
表2
二、本发明的药效、药理及作用机制(一)体外试验(1)S632A3对HL-60细胞增殖能力的影响A、对生长曲线的影响用不同浓度的S632A3处理HL-60细胞5-6天，测定其生长曲线。S632A3在3×10-5M时，对HL-60细胞有明显的抑制。在低浓度(10-7-10-5M)时，S632A3对HL-60细胞呈浓度和时间依赖性抑制作用。
B、S632A3对HL-60细胞克隆增殖的影响取不同浓度S632A3处理HL-60细胞不同的时间、收集细胞、生理盐水洗三次，倒置显微镜下血球记数板记数，然后进行双层软琼脂克隆实验。37℃，5％CO2培养10天。10-3M的S632A3处理HL-60细胞24小时后，就可以抑制50％的HL-60细胞克隆形成，作用72小时，就可以得到100％抑制。
C、对MTT还原能力的影响肿瘤细胞对还原MTT的能力在一定范围内取决于肿瘤细胞数量的多少，因而测定药物处理后细胞对MTT还原能力被用来评价药物对细胞生长增殖状态的影响，S632A3对HL-60细胞具有增殖抑制作用，其IC50分别为2.44×10-5M和2.31×10-5M。
(2)S632A3对HL-60细胞形态的影响未分化的HL-60细胞主要是早幼粒细胞，并有少量的较成熟细胞(中、晚幼粒细胞和杆状、分叶状核细胞)。HL-60细胞经10-7M S632A3处理一定时间后，能沿粒细胞系统定向分化，出现明显细胞形态学变化，细胞核比例增加，核染色质凝缩，核仁不明显，胞质染色变浅，嗜天青颗粒减少，嗜中性颗粒增多。有些较成熟细胞的体积变小，出现杆状、分叶状细胞核。但是大部分分化细胞停留在中、晚幼粒细胞阶段，并且S632A3诱导HL-60细胞分化呈浓度依赖性。HL-60细胞形态的变化为不可逆的并且S632A3对HL-60细胞诱导分化能力比对照组维甲酸(RA)要高一个数量级。S632A3的EC50M为6.05×10-10M，RA为5.85×10-9M。
(3)S632A3对HL-60细胞NBT还原能力的影响NBT是一种淡黄色水溶性染料，它能被激活的粒细胞还原成为不溶性的蓝黑色甲簪颗粒而沉积于胞浆内，当用TPA激活时，形态成熟的HL-60细胞可还原NBT，而未分化的不成熟的早粒细胞对NBT的还原能力很弱，因而NBT还原反应测定常作用为HL-60细胞向粒细胞分化的一个功能指标。未用S632A3处理的HL-60细胞仅有微弱的NBT还原能力。当用不同浓度的S632A3作用于HL-60细胞，NBT还原能力呈时间和浓度依赖性。10-5M的S632A3作用120h，可使NBT还原阳性率达90％，S632A3的EC50M为5.15×10-10M，RA为5.25×10-9M。
(4)S632A3对HL-60细胞酸性磷酸酶活性的影响酸性磷酸酶是嗜中性粒细胞胞浆内的标志酶。当S632A3处理HL-60细胞使其向粒细胞分化时，该酶的活性可随分化细胞数量的增多而增高，酶染色法显示，当用S632A3处理HL-60细胞5天后，酸性磷酸酶染色阳性增加，二者显示结果一致。
(5)S632A3对HL-60细胞非特异性酯酶的影响非特异性酯酶(NSE)是单核细胞的一个特征标志，应用酶染色法显示经10-5MS632A3处理6天的HL-60细胞其NSE活性明显地恢复。
(6)S632A3对HL-60细胞吞噬活性的影响某些成熟的血细胞如粒细胞、单核-巨噬细胞对颗粒性异物的吞噬活性与NBT还原活性一样，是其成熟的标志之一。HL-60细胞经10-5M S632A3处理5天之后吞嗜阳性细胞可达85％以上，而此时对照组仅为10％以下。见表3。见表3浓度μg/ml C0/C1S C2/M0 35.2 48.1 16.72.5 37.5 46.2 16.05.0 50.1 38.0 11.97.5 68.7 23.8 7.510.0 86.3 10.3 3.4(7)S632A3对HL-60细胞癌基因表达的影响本实验应用Dot Blot分析S632A3(5.0μg/ml)对HL-60细胞作用3小时，C-myc基因明显变化，12小时C-myc表达迅速下降。(二)、动物试验结果表明，S632A3经ip给药对小鼠肝癌有显著疗效，将制备的S632A3溶于无水乙醇至终浓度为10-2M(3.07mg/ml)，避光，-10℃保存。实验时用新鲜RPMI-1640培养基稀释至所需浓度，经ip给药对小鼠肝癌22有显著疗效，使用1/20、1/10、1/5LD50剂量抑制率分别为38.2％、56.2％、78.3％和32.8％、51.3％、72.0％。结果见表4表4S632A3对小鼠肝癌生长的作用剂量 小鼠数量体重(g) 肿瘤重量(g)抑制率(mg/kg) 开始/结束 开始/结束X±S ％对照组 10/10 22.6/31.33.45±0.56S632A314×1010/10 22.2/28.42.13±0.3238.228×1010/10 22.4/27.41.41±0.6356.256×1010/10 22.3/25.80.75±0.2178.3对照组 10/10 21.6/33.53.51±0.83S632A314×1010/10 22.3/27.52.36±0.6132.828×1010/10 21.7/28.51.71±0.3451.356×1010/10 22.2/23.40.98±0.3772.0(三)、小鼠急性毒性LD50(ip)280mg/kg(iv)240mg/kg
以上研究证明，抗癌抗生素S632A3是从我国土壤筛选的放线菌产生的新型抗肿瘤抗生素，S632A3的特色与创新之处是1、S632A3是戊二酰亚胺类新化合物，其结构类型有别于目前临床使用的抗肿瘤药物；2、S632A3体外实验能诱导HL-60细胞分化成熟，分化后细胞接近成熟的具有一定功能的粒细胞；3、动物体内实验，S632A3对小鼠肝癌H22有显著疗效。这表明，S632A3是一个既有促分化作用又有抗实体瘤作用的新型抗生素，具有开发应用前景。
权利要求
1.戊二酰亚胺类抗生素S632A3，它是具有下式结构I的化合物，
2.权利要求1的化合物的制备方法，该方法包括以下步骤a.培养在培养基中培养具有产生戊二酰亚胺类S632A3化合物能力的属于链霉菌属的微生物使之在培养物中生成和积累；b.分离按发酵产物的一般提取分离方法从发酵液中分离含有S632A3物质的粗提物；c.精制进一步分离精制S632A3，采用一般脂溶性低分子量物质的分离精制方法。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤a中的培养基是采用所用微生物能利用的营养源，其中碳源可采用葡萄糖、淀粉、甘油，可两种以上组合使用；氮源组合使用蛋白胨、黄豆饼粉、酵母粉、血胨、棉子饼粉，此外还可在培养基中适当地添加钠盐、钾盐、磷酸盐；培养方法为振荡、通气搅拌的液体培养方法；另外步骤a中的培养基的PH近中性，培养温度保持在25-30℃，培养时间5-7天。
4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b所说的发酵物的一般提取分离方法是包括溶媒提取、大孔吸附树脂、层析法，首先进行过滤或离心，除去菌丝体，发酵液经大孔吸附树脂吸附，将包括S632A3的S632物质都吸附于树脂之上，再将其洗脱下来，洗脱液经减压浓缩除去溶媒后，采用溶媒萃取法将S632A3物质转移到有机溶媒中，经无水硫酸钠脱水后，减压蒸馏除溶媒得到淡黄色油状物，该淡黄色油状物经薄层层析法或柱层析法分成A、B两种组分，A组分经减压蒸馏除溶剂后，再以SephadexLH-20凝胶或制备薄层分离得到S632A3粗提物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c的精制是采用吸附层析及ODS-键合型硅胶的反向层析，以乙腈/水或甲醇/水为洗脱剂，精制过程中的S632A3物质的确认，使用物质对其具有抑制作用的微生物作为检定菌的生物检测法及高效液相层析法联用。
6.用于治疗肿瘤的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。
7.用于治疗病毒引起的感染的药物组合物，其中含有治疗有效量的 1化合物和药学上可接受的载体。
8.权利要求1中的化合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
9.权利要求1中的化合物在制备治疗病毒引起的感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及式I所表示的戊二酰亚胺类化合物S632A
文档编号A61K31/4412GK1362407SQ0210093
公开日2002年8月7日 申请日期2002年1月4日 优先权日2002年1月4日
发明者李电东, 于其伟, 金莲舫, 刘琼岩, 范萃敏, 李京艳 申请人:中国医学科学医药生物技术研究所