专利名称：互动药物的筛选的制作方法
技术领域：
该发明采用系统的、高通量的手段旨在发现互动组合的治疗药物。该发明将有助于进一步确定互动疗法治疗疾病的新机理。
背景技术：
在过去的10年中，虽然药物研发经费不断增加，但实质上药物开发的产出却在实质性下降。我们认为其中一个限制因素是目前生物技术和制药工业上盛行的“单一药物单一靶点的中心法则”。传统药物的设计是根据疾病体系中单一独立的靶点进行设计的，这是制药工业中一个主要限制因素，因为疾病的发生往往是多样性的，所以基于多位点、多因子的处理方式更易根治疾病。因此，基于多因素系统筛选新的互动药物的方法已迫在眉睫。多种药品在其他药物的互动配合下，不但剂量可以降低而且会更加有效。这种互动药物的思想再一次唤起人们关注天然产物的兴趣。许多市场销售的传统药物(包括中药)在过去很长的历史中证明具有高效和安全的疗效，但是大部分的精力花费在纯化得到单分子，其药物活性却因为辅助因子分开而通常会丧失。非常可能的原因是多组分在起作用而不是单组分。本专利申请的一个目的在于开发符合系统生物学思维模式，与定向靶向药物互补的药物发明的研究方法。这些来源于天然产物的互动药物将增强现存药物的疗效，且有助于我们更好了解治疗疾病的多种途径。
现今寻找新的疾病相关的蛋白分子靶点推动着生物学研究和许多新药开发，而不再是过去的“盲目乱试侥幸命中”的技术。运用该模式，特定蛋白可以在体外、细胞和整个组织器官水平上被研究，用以评价是否可作为特定药靶来治疗某一特定疾病。过去“单一药物单一靶点的中心法则”曾经鉴定得到了许多针对特定蛋白的有效化学分子，这些化合物为生物学研究和药物开发提供了有价值的试剂。例如最近FDA批准的药物——Avastin，就是根据结合和抑制肿瘤血管新生中血管内皮生长因子(VEGF)设计得到的重组人源化抗体。
但是，在现实生理状态下，疾病是受多基因控制的。因此同时控制疾病发生过程中的多途径才能达到有效的治疗，从而治愈疾病。系统生物学研究成果表明人的细胞和组织是复杂的、具有丰富的集中和发散的信号通路的网络系统。例如根据细胞周期调节蛋白的多功能性，可以在信号通路中多个位点同时干涉。
更主要的一点是来源于天然产物的药物发明模式。20世纪中正是由于使用微生物和植物次级代谢产物才使人类寿命延长1倍，减轻疾病痛苦并且革新药物。很长一段时间，天然产物的比重是占目前市场上药物的主要部分。这很大程度上归功于其结构复杂性和临床治疗特异性。不幸的是正当新的分析测试方法已经建立和天然产物小分子化合物在检测、鉴定和纯化方面都有显著进展的时候，制药公司纷纷远离天然产物的药物发明模式。90年代早期组合化学公司曾尝试用大量新的分子填补该空白，不幸的是采用化学的方法并不能创新出足够多的变化或者制药上有活性的分子。很显然未来制药工业的成功建立在多种技术互补基础上如天然产物的发现、高通量筛选、遗传学、基因组学、蛋白质组学、组合生物合成以及组合化学。
就像生物体系具有丰富的集中和发散的多信号通路的网络特点一样，疾病症状也是由不同基因和通路的突变和干涉的逐步积累的结果。随着生物技术的进步以及生命体分子机理的阐明，多组分疗法也已经提上日程，制药研发公司已经开始转向组合疗法。Genentech公司将治疗结肠癌的Avastin和静脉内氟尿嘧啶化学疗法相结合治疗结肠癌，并于2004年2月27日获得美国FDA批准；辉瑞公司将降胆固醇试剂atorvastatin和抗高血压药amlodipine besilate组合而成的复合物CADUET集中于一个药丸，可以同时治疗高血压和高胆固醇，并于2004年2月2号获得FDA批准，该药宣称是第一个实现一个药丸能同时治疗两种不同症状，因为其同时治疗两种不同的病，内科医生可以帮助病人减少其发展为心脏血管疾病的危险。临床试验的1600个病人中，大约有57％的病人血液和胆固醇达到其年龄段的正常值；近来，礼来公司也同样转向互动药物，其产品Symbyax作为第一个治疗抑郁症的药物已于2004年1月进入美国市场，该药物由Zyprexa和Prozac组成，其中Prozac几年以前已经失去专利保护权；另一个复合药物在墨西哥已经上市，即将进入美国市场，该复合药物不仅是由两个药物组成而且是由两个不同的公司共同开发的，即Merck和Schering-Plough联合开发新的药物Vytorin，该药物由2006年存在专利过期竞争的Merck高价销售的降胆固醇药物statin和Merck的肠胃药组成。新产品Zetia显著增强了降低胆固醇的活性。
配伍组合药物并不是一个全新概念。来源于临床上药物精细组合的多组分疗法，虽然有时妙手偶得、或经推理设计而产生，但是历史上已经在医药许多领域如癌症、传染病、中枢神经疾病，HIV鸡尾酒疗法等有成功的先例。根据Cutting Edge Information最新研究显示，到2007年医药行业有800亿美元的专利药物将面临期满和无专利竞争压力状况，而寻找合适的组合药物可能会成为新的武器来迎接挑战。自1938年美国FDA正式实施功能以来，大约有5000单一药物被证实安全且有效，并已获得被FDA批准进入市场的(除非其是一个已有药物的先导化合物)。
针对已知的药物，该专利发明平台加速了对新药和新化合物的研发。制药公司也可以利用此专利为即将期满的专利注入新的生命。更重要的是该平台允许制药公司挽救药物开发过程中因其毒性、耐药性、临床生物利用度等问题而被淘汰的药物。允许制药公司从现存的、有效的、临床前开发的药物中，重新进行药物筛选，进行全面开发从而市场化。
系统生物学的方法可用来鉴定新的蛋白靶点和治疗干涉的新途径。许多市场化的传统药物可受益于该发明，传统医药药方大药典中，传统医药中的活性成分可以通过该发明中系统生物学的方法得到鉴定。该技术将会证实传统医药的药理，以上平台也有助于自然界中药物开发。20世纪中正是由于使用微生物和植物次级代谢产物才使人类寿命延长1倍，减轻疾病痛苦并且革新药物。很长一段时间，天然产物的比重是占目前市场上药物的主要部分。这很大程度上归功于其结构复杂性和临床治疗特异性。不幸的是正当新的分析测试方法已经建立和天然产物小分子化合物在检测、鉴定和纯化方面都有显著进展的时候，制药公司纷纷远离天然产物的药物发明模式。90年代早期组合化学公司曾尝试用大量新的分子填补该空白，不幸的是采用化学的方法并不能创新出足够多的变化或者制药上有活性的分子。很显然未来制药工业的成功建立在多种技术互补基础上如天然产物的发现、高通量筛选、遗传学、基因组学、蛋白质组学、组合生物合成以及组合化学。
生物学和制药上多点治疗的潜能被认识已经有很久的历史。早在1928年，Loewe观察到并定量了化合物组合可达到超出预料的效果，该效果不同于单一组分的活性。在互动作用、叠加作用、拮抗作用等概念应运而生，特别是在药理学、毒理学领域中。而且传染病人和癌症病人受益于共同用药的化学疗法。临床实验已经证明在生理上使用配伍药物具有提高治疗效果的作用。虽然临床上药物混合已经是一个很清楚的治疗策略，而且已经知道很多药物配合能起到增效的作用，但是在临床上用药敏感不能扩大药物配比浓度适用范围，只能在很小的范围内进行药量调整，很难测定药物最佳配比浓度，同时临床实验也限制了药物范围，阻止其成药可能性。因此，基于多因素原则建立药物筛选的方法迫在眉睫。
CombinatoRx Inc.用2,000多种可获得的药物化合物，配伍形成2,000,000种组合形式进行药物筛选。近来报道一种安定药和抗原虫药的组合药物可以抑制小鼠肿瘤生长而它们单独作用不表现抗肿瘤活性。这是个说明用单药作用单靶位的用药模式很难发现有这样显著疗效生动的例子来。
除去这次成功，CombinatoRx Inc.的技术也有严重的限制。首先，他们的化合物库只是来源于大约2000种药物，因此他们的化学物多样性受到限制，它们的靶位蛋白也有限，目前所有的药物只作用120个靶位，而销量最大的100种药只作用43个靶位，而基因组学和蛋白质组学为我们揭示了更多的疾病相关靶位；其次，他们的药物配伍是盲目的和有缺陷的，他们的目的在于非显著的组合但是现存药物的作用机制优势却未得到充分发挥，因此他们不得不做出许多初始决定并假设猜测，这些都会对科研方向和最终的结果产生影响；第三，两个药物的两个变化因素很难达到良好的治疗效果并且有很大潜在副作用的危险；最后，互动协同作用并不是他们最关注的。
本专利在以上基础上更进一步，充分利用现存药物浓度，在低剂量上筛选寻找那些互动伙伴，用以补偿、加强药物效果。本专利应用更加广泛的药物库，具有无限的化合物多样性；本专利充分利用已知药物的分子作用机制而不是寻找非明显的组合药物；本专利不是采用现有的治疗药物的报道使用剂量，而是采用独特的软件和算法计算出亚最适剂量浓度，同时还应用来指导剂型的调整；本专利采用了低浓度的药物剂量，可以降低药物的副作用，同时我们只关注互动表型。
发明总结本发明提供了在降低药物副作用及其他不良特性的同时，加强已有药物药效的方法和药物配方。本发明以抗真菌药物——酮康唑作为一个例子，提供了能特异提高其药效的方法和药物配方，尤其在本发明中提供了高通量鉴定药物的方法，并获得了一个药物。
互动是由于致敏、增强潜力或相互诱导。互动的混合药物还具有其他优势，当仅用以一个蛋白作为靶位的现有药物时，需要较高的剂量才能起作用，还常常产生副作用，同时耐药性问题也非常棘手；而“多药多靶位途径”可以降低每种药物的剂量。本发明提供了一个筛选新的混合药物的策略，这种混合药物能增强现有“保命良药”的药效。
互动药物的方法在抗癌和抗感染两个方面进行了尝试。混和药物化合物被应用于双组分药物或多组分的筛选，结合有效地实验策略和分析方法确定成分之间是否发生互动作用。确定一个混合物的所有配对组分的检测系统首先，定义每个化合物在检测体系中单独作用时的活性；然后将这些化合物的所有配对组成分两组(活性物质和非活性物质)进行测定。结合自动化筛选和信息系统，分别测定活性和非活性化合物，能够有效地和完全地筛选全部配对组分。首先，对非活性化合物以单药的形式进行分组检测(4个化合物一组)；然后，根据感兴趣的活性，检测活性组的特异配对组分，由于这些化合物中许多本身无活性，既然由两个非活性物质组成的活性组合是很罕见的，那么分组筛选会效率更高，不会因为活性重叠而造成混淆。本身具有可检测活性的化合物(活性化合物)在单个浓度下，分组评价更加困难；最好是检测一系列浓度去评价其活性转变或其固有活性的增强。检测每个活性化合物与所有其他化合物(包括活性的和非活性的)的相互关系，在剂量矩阵中每个化合物选用至少5个浓度(包括0)。
从天然产物中找到的酮康唑互动化合物白僵菌素(Beauvericin)为此概念提供了例证。在包括市售药物的20,000多种被筛选的化合物中，白僵菌素活性最好，且被分离，详述如下。这个采用所述的互动混合药物是从天然产物中得到抗真菌药物的例子，仅仅证明了从药物或药物候选物中筛选和鉴定互动混合药物的方法的强大作用，但此发明在方向上和形式上不局限于此例。此筛选和鉴定方法可用于鉴定任何人类、植物或动物疾病的药物候选物，鉴定已知药物的互动作用，筛选来自文库和其他来源的候选物。
图表详细描述
图1、如图1所示，此发明的技术平台试图为药物开发渠道提供帮助，从而拯救那些专利将要过期的药物或者由于安全问题而被废弃的药物。对于药物A，通过算法能够迅速算出一个远低于现有治疗剂量的有效剂量。这种情况结合强有力的高通量筛选使寻找互动混合药物成为可能，这些混合药物能够恢复或提高已知药物A的药效。混合药物可以来自于已知药物库、被淘汰先导药物、天然产物和合成化合物库。
图2、F101604与低剂量酮康唑的互动效果(X是抑制90％细胞生长的治疗浓度)。样品在顶上被标记，均有至少三次重复。上格是在潮湿的培养箱中，35℃过夜培养的检测板。中间格是用新鲜的MHB培养基再生的上格样品。对上格样品进行荧光检测，Ex为544nm，Em为590nm，并且在底格换算成生长抑制百分率。N阴性颜色对照，DMSO。P阳性颜色对照，Amphotericin B。
图3、为了展示酮康唑/F101604组合对人类细胞没有毒性，采用HepG2细胞作为替代系统，模拟其在人体中潜在的治疗副作用。在96孔板中，每一个孔接种同样数量的HepG2细胞。在CO2培养箱中，37℃培养24小时，检测基于细胞活力的颜色。
图4、为了达到更好去重复的目的，建立了一个结合了微生物遗传多样性和代谢多样性的整合数据库。
图5、在与酮康唑互动筛选中得到的白僵菌素的化学结构鉴定。
发明的详细描述定义“药物”FDA及其他国家的同等权威将“药物”定义为有商业用途的药。“药物候选物”是指还没有批准的，但是具有能够成为药物的特征或迹象的化合物或蛋白质。
“互动作用”是指两个或更多试剂组合的效果远大于这些试剂单独作用的总和，也就是1+1＞2。“叠加作用”的意思是1+1＝2。“拮抗作用”的意思是1+1＜2。
“苗头”意思是互动药物候选物与已知药物的亚最适剂量共同作用时，产生的活性为最大活性的70％-100％，当其以检测浓度单独使用时活性很小。表1是典型的“苗头”命中率。
“辅助药物”一个或几个化合物可以与低剂量的已知药物发生互动作用来达到预防和治疗疾病的目的。
最低抑菌浓度(MIC)是指一个药物达到抑制超过99％菌体的最低剂量。
表1在同一筛选中互动、叠加和拮抗样品的典型“苗头”命中率
强有力的系统的筛选和鉴定互动药物的方法此发明是一个系统的发现新一代化合物的方法，以及能够表示与低浓度的已知药物的互动作用的算法(计算方法)。它起始于一个已知药物或是一个由于毒性、溶解性、药效或耐药性等问题而被淘汰的先导药物X。这个药物可以是任何治疗领域的药物，例如癌症、感染疾病、炎症、糖尿病、中枢神经系统紊乱等。然后构建天然产物库或者合成化合物库(纯化的或混和的)，包括核酸和蛋白质等大分子物质。第三，建立功能检测，包括生物化学、细胞、动物模型及临床治疗水平的检测，然后确定药物X亚最适剂量(最高活性的10％-40％)。在此条件下，采用高通量的方法，将库中的化合物以浓度梯度进行筛选，可得到0.1％-1％的“苗头”命中率。互动药物“苗头”是指互动药物候选物与已知药物的亚最适剂量共同作用时，产生的活性为最高活性的70％-100％，当其以检测浓度单独使用时活性很小。最后，中标的混合药物被纯化和鉴定。混和药物可能是纯的合成分子或来自混合化合物库、天然产物库或其他合成化合物库。
此发明提供了一个筛选能够促进低剂量已知药物的药效的化合物的方法，包括(a)提供一个或者多个已知药物或被淘汰的先导药物；(b)建立天然产物和合成化合物的化合物库；(c)建立功能分析方法，确定已知药物或被淘汰的先导药物的亚最适剂量；(d)用c步骤中的方法在不同的浓度梯度下筛选b步骤中的化合物库；(e)对在化合物库中能够促进已知药物药效的化合物进行鉴定。就是说此发明提供了一个方法，但是并不局限于对化合物的近一步纯化和鉴定。
此化合物库包括但是并不局限于核酸或蛋白质类的大分子。此发明中的方法可以使互动药物先导化合物的中标率达到0.1％-1％；并且能使混合药物能够在低浓度下使已知药物的药效提高10％-40％。
此发明的方法是基于生物化学结合检测或酶活检测的，这个检测可以是细胞或者动物模型的生物学检测。此发明中的方法在筛选步骤(d)中能够实现自动化操作；在鉴定步骤(e)中，能够使用报告基因分析、cytoblot分析或显微镜检分析等方法。
此发明步骤(c)的亚最适剂量是通过软件和算法得到的，它被用来指导程序化操作。此发明中已知药物的浓度降低到了能够使用于筛选互动伴侣和先导化合物的细胞致敏的亚最适剂量。
此发明中筛选出来的化合物是未知的，并通过具体方法进行鉴定。此发明得到的组成，包括通过上述方法鉴定出来的化合物，已知药物或被淘汰先导药物和可接受的药剂载体。此发明中已知药物的亚最适剂量是由上述方法确定的。此发明中组成，包括由上述方法决定的已知药物或被淘汰的先导药物的亚最适剂量和一个可接受的药剂载体。
此发明中的环六酚缩肽白僵菌素(SZC-101)被鉴定为酮康唑的互动药物。环六酚缩肽白僵菌素(SZC-101)作为酮康唑的互动药物通过LC-MS-MS和NMR被鉴定，其结构已确定。
此发明提供了一个药物组成，包括上述组成和可接受的药剂载体。此方明中的“可接受的药剂载体”可以是任何标准的制药载体。合适的载体包括但不限于任何标准制药载体，例如磷酸缓冲盐溶液和各种溶解试剂。对于片剂、颗粒剂和胶囊可以添加其他的载体。经典的载体包括辅料淀粉、牛奶、糖；一定形态的粘块、凝胶、硬脂酸；硬脂酸镁或硬脂酸钙等盐类，滑石，植物油，橡胶，甘油及其他已知辅料，这些载体可以包括调味剂和颜色添加剂或其他配料。组成中的这些载体通过已知的常规方法来确定。
此发明采用具体的鉴定蛋白的方法或其他疾病相关的途经确定化合物的使用。这个方法使我们对互动机制更加了解(1)用系统的生物方法，包括DNA或蛋白质芯片，比对添加互动药物和不添加互动药物时的生物遗传标记、基因、蛋白质的变化；(2)在存在或不存在低浓度药物(例如酮康唑)的情况下，用siRNA技术，转化一个真菌致病菌的siRNA文库至待测真菌中。在酮康唑存在的情况下，受影响的基因被沉默。从上述检测中得到的互动化合物能够作为工具去研究某种蛋白质和途径，从而有利于对某种疾病的理解。SiRNA和其他方法可以用于研究互动机制。
运算法则充分了解现存药物的作用原理，并将已知药物治疗剂量显著降低到最低有效剂量敏化和激化细胞用于互动筛选，这些对筛选互动伴侣试剂是必要的。这个发明揭示了一个运算方法和一个高通量筛选方法。可以决定新药研发筛选方法成功的两个关键因素第一个因素是降低一个已知药物用药量；第二个因素是一个或多个合适的互动伴侣，它可以恢复或提升了已知药物疗效。用于筛选的化合物库来自天然产物库或合成化合物库(纯的或组合的)，包括核酸、蛋白质等大分子化合物。这个化合物库的化学多样性事实上是无限的。高通量筛选方法是一个系统的、客观不带偏见的方法。
一系列在筛选中量化互动效果的运算法则已被采用。比如，中值效果和等热辐射分析有效地确定了一些组合，在这些组合中，一个药物加强了另一个药物的药效。但这些模型并不适用于另一些组合，这些组合中一个药物仅仅增强了另一个药物的内在活性。在临床的和代谢动力学上，有效的组合相互作用可能改变药效或者提高内在活性。
三个标准参照模型被应用于确定互动作用。HAS模型(最高单药模型)是在混合物中，每一个成分在同样浓度下能够产生更大的效果。而Bliss互动模型，有时被称为棋盘定量模型，可以预测由两个成分的效应A和效应B产生的组合效应CC＝A+B-A*B。在这里，每个抑制结果作为部分抑制的效果用0-1之间的数字表达。这些基于效果的互动模型不需假设对于剂量-反应曲线的功能模型，所以不需要此筛选体系范围之外的剂量-反应信息。第三个模型，Loewe叠加模型，是通过组合指数来测定的，它是一种基于剂量的模型，并且仅仅应用于单个组分的活性水平。我们基于对上述三种模型的讨论，衍生出一个专有的运算法则。它通过互动模型显示出的较大抑制活性选出单个组分化合物，然后继续研究。这些化合物通过更高密度的384孔板的重复性试验以及其他的体内和体外的试验来验证。
专有的运算法则是一种上述3种算法的改良。首先，要找出两种或更多的能提高药理学性质的活性组分。叠加药物中一个组分对另一个组分的互动效应过去容易被忽视。叠加药物是指1+1＝2。而互动药物是指1+1＞＞2。而专有算法可以应用于拯救一些具有副作用的潜在药物候选物，通过与其他组分结合，减小副作用，可以使现有药物公司正在日益缩小的药物研发库存得到复苏。
其次，这个发明的方法是为生产符合生产商和消费者的共同利益的低成本药物而设计的，购买力是重要原则之一。随着化合物库的增长，对互动药物知识的了解也以指数增加，从而减少新药研发的成本和时间。FDA对重要的生物技术药物的研发规定有新进展，因此从已被批准的化合物中产生的新化合物，可以依赖最初研发这个化合物的公司的数据，从而提供了一个节省成本和迅速研发这类新药的途径。
为了证明这个概念，一个有效的吡咯类抗真菌药物酮康唑和一个来自天然产物库的天然产物粗提物F101604被用来作为一个例证。其中一个主要先导化合物成分已被鉴定。来自其他天然产物或者合成产物库的先导化合物也已被鉴定。我们收集了已知药物库中大约有3,000种被证明安全有效并且获得FDA市场前认证的单分子药物被用于测试。因为从这个库中的命中率也许不够，所以我们建立了自己的天然产物库。我们已经建立了的通过微生物多样性构建天然产物库的方法，这种方法从以下三方面最大多样化微生物天然产物库(1)从多样的生态系统中选择和分离样品，并根据其形态学和16s rRNA特性分离不同种类的微生物；(2)通过操控微生物的生理特性来激活微生物天然产物的产生；(3)改变的菌株的遗传性状来产生非自然的微生物天然产物。
通过运用这三种方法，天然产物库的多样性可以最大化。因此，发现一个新化合物的机会也随之增加。一个结合了的微生物遗传多样性和代谢多样性的三维数据库已经建立(图4)。一旦筛选出有效物质，可以很容易的追溯其来源。这个数据库帮助我们去除已经报道的有效药物，并使我们的研究重点放在天然产物新的结构和新的活性上。
我们以抗真菌药物作为例证，原因如下真菌已成为第四大医疗血液传染疾病，美国每年大约有90,000例严重感染病例，其中近40％的患者有生命危险；由于侵入性真菌感染和大量广谱抗生素的使用导致免疫缺陷病人的数量逐年增加，所以对高效抗真菌药物的需求也逐年增长。
另外，真菌感染已经作为临床死亡一个独立因素。因为真菌对现存药物抗药性不断提高，现存有效抗真菌药物种类较少，正在研发的药物也非常有限，所以现在迫切的需要研究抗真菌药物的新方法。微生物复杂的生化调控体系为发现崭新抗感染药物提供了开门匙，崭新的抗感染药物能选择性削弱微生物细胞，不危害人类细胞。比较基因组学恰恰提供了大量只存在于真菌中的必需基因。
许多研究组和公司利用这些基因产生的蛋白作为特殊的靶点来筛选新型药物。然而微生物经历38亿年的进化，已经产生了因必需基因被破坏后的备用代谢机制，并且具有了应对多种因生境变化带来危害的能力，不幸的是，它们持续的进化正在超出现存抗感染药物的能力范围。
抗真菌试剂市场是增长最迅速的市场之一，世界每年大约有50亿美元的销售额，其中用于系统治疗真菌疾病的费用大约30亿美元。目前超过100家的公司正致力于抗真菌药物的研发。大部分现存的抗真菌试剂仅能抑制真菌并不能根本地消除真菌，这还导致了真菌产生耐药性。治疗耐药性真菌费用比治疗敏感性真菌高且更加困难。那些对真菌具有致死作用的药物，往往具有很高的毒性，经常导致对肾、肺的破坏及一系列的其他副作用，这些毒副作用往往影响治疗的延续性。另外，大部分作为治疗系统真菌感染的药物，口服生物利用率低、效果差。因此，我们迫切的需要发现新的化合物来解决这些逐步出现的问题。
理想的抗真菌药物应具备如下特征具有口服和静脉注射两种用药方式；具有涵盖酵母状和丝状真菌的广泛的抗菌谱；在体外具有杀死真菌的活性；表现良好的药物代谢分布，最小限度的药物相互作用；对抗药性稳定；具有很好的组织穿透性(包括中枢神经系统)；副作用小，成本低。不幸的是，目前为止通用的抗真菌治疗方式还没有一种能满足上述大部分特点。例如Amphotericin B(两性霉素B)两性霉素B是多烯大环内酯类抗生素，1956年被发现，是当时唯一能治疗系统真菌感染有效的药物，所以一度被认为抗真菌治疗的黄金标准。它作用方式，主要是选择性的结合真菌细胞壁的特有组分麦角固醇，从而改变了细胞壁的成分，抑制了细胞壁形成，最终导致细胞死亡。两性霉素B具有很广泛的抗真菌效果，但是不得不注意两性霉素B还具有很强的毒性，能产生一系列副作用，其中肾毒性是最严重的副作用，必须采取间断性治疗。高烧、胃病、呕吐、贫血、肌痛等副作用症兆发生在50％的采用两性霉素B进行治疗的病人身上。现在以脂质类物质为介质的用药方式能降低两性霉素B一定的毒副作用，但是这种用药方式提高了治疗成本，限制了应用。
Azole(吡咯类)fluconazole(氟康唑)、itraconazole(伊曲康唑)、ketoconazole(酮康唑)吡咯类药物通过抑制细胞色素P450将landosterol转化为麦角固醇，从而抑制了真菌细胞壁固醇和其他壁脂质的合成，最终导致细胞壁结构破坏细胞死亡。每种吡咯类药物都有各自不同的抗菌谱。例如，氟康唑对曲霉类真菌无效，对假丝酵母类真菌有一定效果，对隐球菌属具有很好治疗效果；伊曲康唑虽然在不同病人和与其他药物联合使用时药效变化较大，但是它具有广泛的抗菌谱，涵盖了其他吡咯类药物抗菌范围，而且副作用最小。酮康唑临床对肝毒副作用很大，但是它是最有效的治疗慢性的及顽固的地方性真菌感染的药物。
Allylamines(丙烯胺类药物)这类药物的主要成员就是terbinafine(特比萘芬)，这类药物通过抑制鲨烯环氧酶起作用。鲨烯环氧酶是合成麦角固醇途径中另一个重要的酶，所以这类药物同吡咯类药物作用具有相关性。这类化合物具有很好的亲脂性，能在皮肤、指甲和脂肪层积累。特比萘芬有口服和霜剂两种用药方式。特比萘芬口服药物是在1991年在英国研制出来，1996年在美国进行临床应用。
Flucytosine(氟胞嘧啶)氟胞嘧啶是一种嘧啶类似物，影响在真菌中DNA的合成。氟胞嘧啶的活性谱有限，而且单独使用容易产生抗药性，因此它经常和两性霉素B配合使用。这种联合用药对临床上其他药物难以治疗的髓膜炎念珠菌具有显著效果。氟胞嘧啶具有毒性，经常会引起粘膜炎和骨髓抑制，这些病对于已经免疫缺陷的病人来说是非常危险的，非常容易受到感染。
其他的抗真菌药物还包括制霉菌素、乙酸卡泊芬净、伏立康唑，但都有各自的局限性。
多组分治疗，源自临床经过长期积累的用药方式，经过一些随机的药物搭配起到良好的治疗效果，在药物领域也有成功的历史，比如，在癌症、传染性疾病、中枢神经系统紊乱和HIV鸡尾酒疗法等。我们致力于寻找下一代具有互动效果的由低用量已知药物组合而成的药物。低药物用量不仅解决了药物溶解的问题和一些其他性质方面的问题，同时能将药物安全使用剂量降到安全范围内。研发步骤包括(a)建立一个已知药物或弃用药物的化合物库；(b)建立一个包括天然产物和合成的纯化或混合的化合物库，包括大分子物质，如蛋白质核酸；(c)建立一个方法用于测定和计算用于互动药物的亚最佳使用剂量；(d)在此基础上，筛选上述化合物库，按照0.1％-1％的检出率选出具有互动效果的化合物；(e)检测或计算被测组分的配比(通常药物联合使用能发挥出70％-100％的最大活性，而单独使用时在该低浓度下只能有非常微弱的活性效果)；(f)纯化和确认组合药物的组分。组合药物可以是超过两个组分。
互动药物替代了传统的利用提高用药浓度来提高药物活性，它通过降低药物使用浓度，筛选能互动增效的辅助药物，提高了药物的应用潜能。而互动药物的每个组分在低浓度单独使用时可能不表现任何活性。为了证明上述概念，我们从天然产物库中筛选出了能与酮康唑(一种吡咯类抗真菌药物)互动增效的抗真菌的天然产物粗提物F101604，并且其中一个主要的先导化合物已经确认并分离纯化出来。
因此，本专利发展出一种发现药物的新方法，这种方法符合系统的生物学思维模式，弥补了以靶点为基础的药物筛选方法。这些具有互动效果的联合药物增强现存药物的疗效，且有助于我们更好了解治疗疾病的多种途径。我们已经给出了一个由新的天然产物配合低浓度酮康唑获得更好的抗真菌效果的发现实例。
通过下面的例子能更好的理解这项发明。实例中每项特殊的方法和结果后面都配有详细的说明以供理解。
例子1自90年代中期引入高效抗逆转录酶病毒疗法(HAART)以来，HIV抗真菌药物市场发生了巨大的变化。在高效抗逆转录酶病毒疗法出现之前，AIDS和HIV相关疾病的机会感染以惊人的速度增长，频繁的反复发作的真菌感染很常见，这就需要进行长期的预防性治疗，使得医生们对抗真菌药物的耐药性有了广泛的关注，假丝酵母对吡咯类药物的耐药性不断增强，引起了HIV专家和研究人员的极大关注。他们认为，这个问题解决的关键是未能满足对HIV病人真菌治疗的需要。免疫力下降的病人容易重复感染，需要长期治疗，从而导致对吡咯类药物的耐受。由于HAART疗法的出现，HIV感染的病人免疫力重建能力得到增强，机会感染已经下降了60-80％。然而，对HAART疗法的抗性的出现也是不可避免的。目前，那些通过一次HAART治疗无法治愈的病人，也可以通过进行第二、三和四次治疗成功治愈。
然而，对于HAART治疗的抗性是常见的。临床医师估计，到一定时候，10-30％的病人会出现对抗逆转录酶病毒治疗的抗性现象，这样病人就需要改变疗法或使用其他药物。如果抗逆转录酶病毒药物的新药开发不能持续补偿HAART疗法缺陷的话，机会感染很有可能再次卷土重来。而预知何时会发生这种情况是非常困难的，但是在未来的几十年中，这个问题将是影响HIV市场最重要的因素，进而影响到抗真菌药物市场的需求。而且，如果新的抗真菌药物有特殊疗效而取得更广泛的应用，那将会影响到未来抗真菌药物市场的份额。另外，真菌感染对于一些非HIV病人也有很高的危险性，例如癌症病人，器官移植的病人等，假丝酵母的耐药性是个主要的问题。
这就需要寻找更安全更有效的抗真菌药物。因为真菌细胞的药物靶位与哺乳动物细胞中的相似，所以一些高效抗真菌药物，如两性霉素B和吡咯类药物(如氟康唑，伊曲康唑和酮康唑)就存在着毒性问题氮唑类药物抑制14-去甲基羊毛甾醇的合成；在真菌和哺乳动物中细胞色素P450酶对于胆固醇合成是至关重要的，氮唑类药物也是许多细胞色素P450反应的有效抑制剂，因此这些抑制剂是研究哺乳动物的细胞生物学有用的工具；两性霉素B攻击血浆薄膜中的固醇，对肾脏有害处。另外，近几年，白色念珠菌对于氮唑类药物的耐药性也逐渐增强。白色念珠菌是最重要的人类真菌病原菌。尤其是，白色念珠菌引起免疫缺陷病人的口腔念珠菌病和全身念珠菌病，以及引起妇女的外阴阴道念珠菌病(VVC)。念珠菌病在HIV感染病人中是非常重要的问题，其中84％的病人表现出由假丝酵母菌引起的口咽感染；外阴阴道念珠菌病传播广泛，已经成为一个严重的问题，据联邦疾病控制中心统计，在美国，大约75％的妇女在她们的一生中至少患过一次外阴阴道念珠菌病，40％患过两次，约5％的妇女会反复感染。综上所述，这些数据显示了白色念珠菌感染在医学和经济的重要性。
酮康唑普遍被用来治疗假丝酵母感染。然而，在临床用药的剂量上，它与包括肝炎在内的毒副作用有关。除此之外，耐药菌伴随长期治疗或预防性治疗出现，导致需要使用高浓度的药物。
所用的被测试真菌菌株是近平滑假丝酵母ATCC 22019，它是引起免疫缺陷性个体严重机会感染的人类致病菌。所用的天然样品是微生物发酵的粗提物。我们分离到很多来自世界各地多种生态环境下的微生物，在不同的生理培养基中被培养，从而产生多样化的天然产物库。
液体和固体两种获得粗提物的方法被采用。对于液体发酵的样品，首先离心将菌体与发酵液分离，大约40毫升/瓶，将上清液倒入另一个50毫升离心管中；然后在沉淀的菌体中加入20毫升的甲醇，而在上清中加入约2毫升HP20树脂处理，两管均置于振荡器上振荡1个小时；将处理后的HP20树脂和菌体表面的甲醇上清液混合，然后过夜浓缩干燥；其后用双蒸水冲洗HP20树脂，除去高极性的化合物，再用9∶1丙酮/水洗脱；样品充分干燥后，用100％DMSO溶解；样品稀释20倍后，进行筛选。对于固体样品，首先加40毫升的甲醇浸泡过夜；然后，在上清中加入2毫升HP20树脂混合，其他步骤与液体样品的处理一样。
准备用于筛选的母板，使用的天然产物是100倍稀释；测试菌近平滑假丝酵母(ATCC22019)在Mueller-Hinton(MH)肉汤基上进行培养；菌液(104/毫升)加入到MH肉汤和Alamar的蓝色染料(生物目录数字号DAL1100)的混合液内以及伴随0.01X倍酮康唑(X是抑制90％的真菌细胞生长的生理学浓度)的加入和缺失；在96孔测试板中每孔加入0.08毫升。
用96孔进样复制器取2微升稀释了20倍的天然提取物到培养好细胞的96孔板中。按照美国国家临床实验室标准(NCCLCS)对所有的实验进行了重复。试验板在一定湿度下，35℃过夜培养；荧光检测Ex 544nm和Em 590nm。当天然产物样品本身没有抗菌活性的时候，筛选其与酮康唑的互动活性。
天然产物粗提物F101604被确定为有互动效果的活性物质。图1A上面的图显示测试板在潮湿的培养箱35℃培养过夜，将等量的近平滑假丝酵母、培养基和Alamar蓝色染料加到每个孔中。上面显示的是样品重复的治疗效果。阳性对照(P)含有抗生素两性霉素B，杀死了所有的细胞，颜色呈蓝色，其荧光读数定义为100％的生长抑制。为了测试真菌病原菌是被杀死还是生长被抑制，取上述测试板中呈阳性结果的培养液2微升加入到含有Alamar蓝色染料的新鲜MH肉汤培养基中，再一次置于潮湿的培养箱35℃培养过夜。结果显示，如图1上面所示。如果颜色变红，说明病原菌仍然生存，其模式是抑制；如果颜色变蓝，说明病原菌被杀死，其模式是致死。阴性对照(N)仅加了DMSO，定义为0％的生长抑制。
酮康唑的单独作用浓度在0.01X只抑制了20％的生长，作用模式是抑制。单独用F101604粗提物检测，没检测到其对酵母病原菌有抑制作用。当酮康唑在1X浓度检测时，抑制了90％的菌生长。然而，酮康唑在0.01X浓度和F101604的混合作用时获得了95％抑制效果(比酮康唑1X的浓度效果要好)，作用的模式是致死，显示两个组份具有互动效果而非叠加效果。
因此，本发明在于开发符合系统生物学的思维模式，与定向靶向药物互补的研究。这种互动药物提高了现成药物的疗效，使我们能更好的理解多途径治疗疾病，给出的例子是用新的天然产物配合低浓度的酮康唑获得更好的抗真菌疗效。互动治疗提高了酮康唑的药效同时降低了其副作用以及药物抗性问题，这个互动药物概念的证实，给予许多治疗领域药物研发技术平台以希望和潜力。
例子2药物组合鉴定本专利将现有已知的药物与一个或多个药学上适当的载体相结合，为兽用和人类医学上用药提供药物配伍或组合的方法。更重要的是，这种药物的配伍可以在更低的剂量时发挥更好的疗效，同时减少副作用。载体介质必须是药学上可用的，而且与配方中的其他组分互不反应，对服用者无害。
经16s rDNA测序分析，活性物质的产生菌株被鉴定为镰刀霉菌(Fusarium proliferatum)。通过以下的纯化步骤，我们从培养液中分离纯化了这种天然活性产物1.每个发酵瓶中加入100毫升丙酮，共有36个发酵瓶。
2.振荡以打碎块状物并持续作用至少4小时。
3.从丙酮溶液中过滤除去生物基。
4.用适当大小的容器收集所有的生物基并加入2升丙酮提取2小时。
5.过滤并合并二次的丙酮提取物。
6.在真空条件下蒸发去除丙酮(剩余大约500毫升)7.加入500毫升的蒸馏水8.用MEK(1∶1)溶液萃取上述的1升分离物，重复萃取一次9.分别将MEK萃取物浓缩至干燥状态。
10.储存于冰箱中。
经对镰刀霉菌培养液混合物的LC-MS-MS和NMR研究分析，活性物质被确认为一种六元环状α肽类物质白僵菌素(白僵菌素(Beauvericin(SZC-101))
白僵菌素(Beauvericin)是一种微生物毒素，该类物质被定义为“真菌的次级代谢产物，若通过异常途径摄入，在低浓度时即对脊椎和其他动物存在有毒害作用”。这些化合物通常是非挥发性的，并且可能储存于孢子和生长菌丝中或分泌到生长环境中。许多微生物毒素的毒性作用机制包括从不同角度干扰细胞代谢过程，产生神经毒性，致癌或致畸作用。其他有毒的真菌代谢物如环胞霉素，可以对细胞免疫系统表现较强而独特的毒性作用，故被用于免疫抑制剂。
为了表明酮康唑/F101604结合使用对人类细胞无毒害作用，我们采用HepG2细胞作为替代系统来模拟在人体内潜在的治疗副作用。正如临床报道的那样，我们发现酮康唑在100和50ug/ml浓度下存在毒性，然而F101604和25ug/ml酮康唑都不会对人的肝脏细胞造成伤害(Fig2)。
我们从遗传学和形态学方面对真菌菌株F101604进行了鉴定，通过活性追踪的分离纯化，从F101604的粗提物中分离得到两个不同的化合物。在抑制近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)的生长方面，这两个化合物都与0.01X酮康唑表现出极大的互动作用。从Sigma。公司定购了商业化的标准产品白僵菌素也证实了这种活性作用。这种协同用药的抗真菌活性在文献中还未见报道。
该活性物质的协同作用是普遍存在还是某一类抗真菌药物的特例呢？弄清楚这一点非常重要。所以我们将研究分析推广到其他的常用的抗真菌药物中，如氟康唑(Fluconazole)，依曲康唑(Itraconazole)，两性霉素B(Amphotericin B)，氟胞嘧啶(Flucytosine)，科赛斯(Cancidas)，伏立康唑(Voriconazole)和特比萘芬(Terbinafin)。测试结果显示似乎白僵菌素对于吡咯类药物具有特殊的协同作用。
除了已报道的前期数据结果中用到的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis ATCC22019)我们还采用了其他病原真菌，包括白色念珠菌(Candida albicans ATCC 90028)，光滑假丝酵母(Candida glabrata ATCC 90030)，克柔假丝酵母(Candida Krusei(Issatchenkiaorientalis)ATCC 6258)，曲霉菌(Aspergillus fumigatus ATCC 46645)，啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae ATCC 2601)，新生隐球菌(Cryptococcus neoformans ATCC14116)。将Beauvericin与酮康唑配伍扩大了酮康唑对各种病原真菌抗菌谱。
另一个重要方面是测试互动药物对耐药性病原真菌的抑制效果。我们使用了临床耐药性分离的菌株包括从ATCC和其他生物医药研究所得到的各种野生型和突变型菌株。这些菌株的亮点在于对其耐药作用机制人们已经有了较为清楚的认识，包括细胞膜上外排机能泵的基因过量表达，如多药耐药蛋白基因MDR1和ABC转运蛋白基因(CDR1 and CDR2)以及目的酶ERG11基因的过表达或发生了突变。从前期的数据中我们发现，针对那些已经对氟康唑产生了耐药性的临床分离菌，采用具有互动作用的药物配伍能够极大的改善酮康唑的作用效果。
免疫缺陷病毒(HIV)感染人群中日益表现出的问题是病原性的酵母菌——白色念珠菌(Candida albicans)对唑类药物的耐药性。统计数据表明从AIDS患者体内分离到的超过33％的分离菌株，其氟康唑的最低抑制浓度至少是标准易感菌的3倍以上。我们从华盛顿大学的Theodore C.White博士实验室购买了一株临床分离的氟康唑耐药株#17(SZP-17)。我们从F101604的天然产物混合物中分离纯化了生物活性物质SZC-101，该物质与酮康唑在病原真菌抑制方面具有互动作用。通过培养液微量稀释，酮康唑在有或没有SZC-101配伍时的抗真菌活性进行分析可以确定酮康唑的最低抑制浓度。
表II显示了添加SZC-101到酮康唑中所表现出的极大的互动作用。正与前人所报道的那样，SZP-17对酮康唑和氟康唑表现出交叉耐药性而不耐两性霉素B(数据未给出)。酮康唑与具有互动效应的SZC-101一起作用，可对产生临床耐药菌SZP-17具有较好的抑制效果。添加2微克/毫升的SZC-101可使酮康唑的活性可增强200倍。表II SZC-101的添加量对酮康唑抑制临床耐药菌SZP-17的最低抑制浓度(MIC)的影响(单位微克/毫升)
其他二期测试分析包括检测药物的血清结合活性，对哺乳动物细胞毒性分析等，分析活性物质的各种性质对于今后的深入研究非常重要。
我们也测试了动物模型上互动用药方法与单独用药的临床对比。我们从中分离得到的新化合物可作为一种与DNA(RNA)芯片或蛋白芯片相结合的分析手段，可用于确认新基因和途径，解码复杂遗传通路控制的疾病过程。绘制微生物细胞通路图谱将为更好的治疗提供有效的细胞模型。以下几个方面给出了互动作用的可能作用模式1)耐药酶的抑制因子微生物产生的酶可以通过破坏抗生素分子的结构从而使其失活，这是抗性的主要作用机制。这些酶能被分泌到周围环境中，例如，葡萄球菌分泌青霉素酶，这种酶能使青霉素失活；或者被分泌到外周胞质间隙，例如，绿脓杆菌分泌头孢菌素酶，该酶可以降解头孢他啶。这种耐药性可以通过抑制降解性酶与特定抗生素结合而得到克服。这样，抗生素就能被保护起来，例如，Augmentin(阿莫西林和克拉维酸)。
2)膜屏障增强因子抗生素不能到达靶点目标原因通常是抗生素难以穿越细胞壁，不能进入周质间隙或者细胞质中。因此，能够提高这些膜屏障渗透性的复合物就能增强药物的活性，例如，庆大霉素能提高肠球菌对β内酰胺制剂的渗透性。
3)多药耐药泵的抑制因子微生物膜上的泵能够转移或者泵出细胞内产生的抗生素。通过抑制这些泵的作用也可以协同性的增强药物的活性。许多这种抑制因子已被发现，但市场上还没有进行销售。酮康唑与SZC-101配合使用抑制了染料流出体外——这是协同效应的一种作用模式。为了测试SZC-101和酮康唑在SZP-17菌株上的多药耐药泵的抑制作用，我们做了染料流逝实验。首先单独或配伍使用2微克/毫升SZC-101和0.04微克/毫升酮康唑对SZP-17培养物进行32℃ 30分钟预处理，然后用荧光染料若丹明G在32℃处理1小时。冲洗培养物，在没有药物存在下让细胞恢复。通过测定真菌细胞中残留的荧光性复合物可知化合物是否可以阻止染料流逝。在染料消逝实验中，SZC-101和酮康唑单独使用时只有很小的作用，而复合使用时，在染料消逝作用上却具有极强的作用(数据未列出)。这个结果证明了两种药物配伍使用时能有效的作用于膜上的泵，而单独使用时则没有这种效应。
4)其他互动作用途径互动筛选是一种新的用于确定天然产物或合成药物库中可以配伍的药品的方法，它们可能由上面提到的或者是完全新颖的机制运作。
互动筛选提供了几种化合物的最佳配伍比率。通过以下途径可更好的测试和理解互动效应的机制1)利用系统生物学方法，包括DNA或蛋白质微芯片的方法，来比较在互动药物存在与否时遗传生物标记、基因或蛋白质发生了哪些显著的改变。2)使用小分子RNA干扰技术，在某个药(例如酮康唑)低浓度存在与否时，将一个病原真菌的siRNA库转移到待测真菌中。在低浓度酮康唑存在情况下，效应基因遇到特异性的siRNA表达将会死亡。
现在常用的药物通过降低其剂量以及与其他化合物配伍可改进其疗效。由于常用药有明确的药物性质备案，对其作用模式也有较好的认识。所以使FDA更易于评估药物组合的疗效。本专利中具有互动作用的药物可让我们更好的了解真菌作用机制。这能使现有药物更有效，也有利于我们更好的多途径治疗疾病。
除了在抗感染疾病中的实例验证了概念，我们还测试了一些与抗癌，心血管病，抗炎症，和其他紊乱失调方面有关的药物。本专利提供了一种新的方法去确定天然产物或者合成药物库中的辅助成分药物，它们可以由上面提到的或是全新的机制来发挥作用。
通过上述的互动药物筛选来确定某种天然产物是一种杀真菌剂，而这仅仅只是证明了互动药物筛选的方法在筛选和确定药物及其互动组分时是非常强大有效的一个例子，但并没有限制任何别的方法或形式的发明。在确诊任何人类，植物和动物疾病或在其他经适当分析的情况下，以及确定对于治疗某种疾病的药物互动作用从库或其他资源里筛选互动组分，这种筛选和确定药物的方法都是非常有用的。
抗真菌互动药物的临床前试验部分是用免疫缺陷型老鼠和经系统传播的念球菌感染模型。
尽管历来采用死亡作为研究这种类型试验的终点，但这个终点判定已不再适合现在的动物研究时代。为了尝试修改研究方案使之与当今时代标准一致，我们采用了由T.E.Hamm所建议使用的方法。(被提议制度上关心动物，对于啮齿类动物研究采用规定指示的致死方法作为实验终点，美国实验动物协会今日议题.1995；3469-71)尽管这些实验可能导致死亡，但通过利用以下这些途径，我们会尽最大努力减少动物疼痛和痛苦的持续时间1)我们派实验组中训练有素并在识别动物生病的征兆和反常行为方面有丰富经验的成员，每天(包括周末和假期)监控动物3次，时间分别在上午9点，中午12点以及下午5点。这种监控时间表超过了最初Hamm博士所建议的一日两次的方法。此外，如果发现老鼠有疼痛，抑郁或者死亡的迹象，这种监控会更加的频繁。
2)看起来似乎有明显变化的动物，它们的姿态(例如，非正常的姿态或者将头埋进腹部)，皮毛，眼睛和/或者鼻子的分泌物，呼吸或运动将与群居下情况大不相同。我们不会给与这些动物止痛剂，因为这可能会出现药-药交互作用，并且它对研究结果的影响也是未知的。取而代之的是，我们会在离动物居住处很远的地方对其进行颈部脱臼，使它暴露在CO2环境下，无痛苦的死去。
死亡率这个术语将用于作为这个研究的终点；然而，需要明确理解的一点是，我们将尽最大努力减小动物的疼痛和痛苦，而且，如果观察到动物将自然地屈服于感染时，我们会在这之前对其实行安乐死以达到减少它们痛苦的目的。
a.动物从单个合法卖主获得的无特定病原，雌性ICR级小鼠，重量大约在23-27克之间，在实验整个过程中使用。在做活体实验前的一个星期，这些动物将会用标准饲料喂养，以适应实验需要。
b.抗真菌类药药剂将从SynerZ医药品公司在数量上得到充分的补给，以完成实验大纲的需要。此外，SynerZ公司会在贯穿研究过程中，在解决维持研究的连贯性所做准备之前，提供稳定的，分散的及公式化的数据。我们将直接从厂商处获得抗真菌类药物的标准对照——fluconazole。抗真菌类复合物将以腹膜内注射形式来给药。
c.菌种研究所用菌种为单一的白色假丝酵母(ATCC 36082)或者由SynerZ公司提供的临床药抗菌种。
d.易感性测试测试有机体所用的所有复合物的最小抑制浓度将参照SynerZ公司所提供的固定标准NCCLS微稀释技术。
e.急毒实验给药和药物评估我们用合适手段准备一连串测试复合物的两部稀释，这样，在0.2毫升体积稀释下，将产生跨越广泛范围浓度的剂量。每个测试复合物将用5种剂量来进行评估。这5个测试用的剂量的选择将通过与SynerZ公司的进一步协商所决定。
i.每个测试复合物(与低剂量标准对照fluconazole复合)用5种剂量，每个剂量用5只小鼠，5个复合物(共125只小鼠)。
ii.测试复合物用腹膜内注射给药。
iii.对照组(5只小鼠)接受与积极治疗组相同给药途径的手段，0.2毫升治疗剂和fluconazole的非最佳理想剂量。
iv.临床观察直到研究终点96小时后，动物会被每天观察3次，看是否有药物相关的发病的信号或者充血现象出现。
v.计算所需小鼠每个测试复合物的治疗组+对照组＝130只小鼠。
f.确认研究在感染之前，通过腹膜内注射环磷酰胺4天(150mg/kg)和接种前注射1天(100mg/kg)致使小鼠嗜中性白血球减少。测试有机体将在沙氏琼脂糖培养基上次培养，35℃ 24小时。一组小鼠(5个一组)用0.1ml 106CFU/ml，悬浮于温暖盐水中的接种体通过侧面尾部脉络进行感染。由早先的研究所提出的方法，这种接种体可稳定再生的感染。在重复实验中，最终候选菌种将证实感染。计算所需小鼠(5个小鼠/组×1个接种体×重复实验)＝每个菌种10只小鼠。
g.定量效率研究为每个单独或者复合使用的复合药物，比较评估治疗后感染小鼠肾中的真菌密度的治疗功效。在24小时期间，每个复合物6-8个剂量组将用于每组3个小鼠的研究。对照组小鼠将接受自由辅药互动作用手段，与治疗组相同剂量。一组非治疗对照组将在治疗开始前和所有治疗组治疗末期完成后处死，以确定感染建立。在用吸入CO2致死后，小鼠的肾降被切除，在消毒后的0.9％盐水中铺成均匀分布的颗粒。将均匀混合物的连续稀释液接种于SDA上，35℃孵育24小时后，数出存活真菌数。
1.感染培养先前所描述的测试有机体一夜后，得到接种体悬浮液，取0.1毫升从侧面尾部脉络注入到23-27克重小鼠中。
2.给药剂量选择决定于基于初步毒性研究所确定的最大忍受剂量。每个的标准对照(fluconazole)和测试复合物用6-8个治疗组来测试。最终剂量组将与发起人协商后决定。
3. 24[每个剂量3只小鼠*8个组*1个标准对照(fluconazole)]只小鼠将在接种后2小时由腹膜内注射给药。
4. 120[每个剂量3只小鼠*8个组*5个测试复合物]只小鼠将在接种后2小时由腹膜内注射给药。
5. 72[(30小时对照+324小时对照)*12套测试组]只小鼠被用作对照。治疗组的数量由及时处理每个实验的一定体积的样品能力所决定。基于这些树目，每个复合物的8个治疗组分为两套(每套4个)。
6.总共需要小鼠216只。
h.数据分析样本大小没有计算急毒实验用样本大小的预先估价，因为这些研究在以前没有做过，样品大小用5，是与工业标准相协和的，因为这能为初步评估测试药物提供足够的信息。
定量培养部分的样品是按以下方法来计算的1)典型的抗微生物剂最佳给药量组通常使真菌密度产生大约减少2-3log，2)为了使观察平均数背离真实平均数不超过1SD，使用两边95％独立间隔有80％可能性，需要6个数据点。用我们提议的方法，每个动物的肾脏组织中将产生两个数据点。
定量培养研究24小时后，通过治疗组小鼠肾中真菌密度的改变与开始的对照组小鼠对比，计算功效。组织中的真菌密度改变用log10 CFU的变化来表示，所有治疗和非治疗的小鼠用描述统计学报导。每个复合物包括标准对照构造log10CFU对抗菌剂剂量的曲线。数据将适合用Emax模型来决定50％有效剂量。单独药剂和复合药剂的效力(真菌浓度的改变)将用合适的统计学测验来处理。
权利要求
1.该专利是为筛选能与已知药物，相互作用并增强其疗效，从而降低药物临床剂量的化合物而开发的方法，这项发明包括(a)先确定几种现在临床上使用的或已经被淘汰的先导药物；(b)构建多个具有多样性的天然产物或合成化合物库；(c)建立一个已知药物或被淘汰先导药物亚最适剂量的功能性检测分析方法；(d)采用c步中所建立的检测方法，检测及筛选b步中所构建的天然产物或合成化合物库中各化合物在不同浓度下与已知药物或被淘汰先导药物相互作用的活性；(e)确定一种或者更多种具有增强已知药物疗效的化合物。
2.权利要求1中提出的方法，也包含对所确定的化合物的纯化方法。
3.权利要求1中提出的方法，化合物库中不仅包括小分子化合物同时也包括大分子化合物，例如蛋白质、核酸以及SiRNA库。
4.权利要求1中提出的方法，互动先导化合物的检出命中率是0.1％-1％。
5.权利要求1中提出的方法，互动药物指能增强已知药物在亚最适剂量时的疗效，k可达到最大疗效剂量的10％-40％。
6.权利要求1中提出的方法，检验系统包括任何生物化学结合试验，酶学检验等。
7.权利要求6中提出的方法，检验系统可以是基于任何细胞或动物模型基础上的生物检验。
8.权利要求6中提出的方法，检测系统可以应用任何疾病模型的临床试验。
9.权利要求1中提出的方法，筛选步骤d可以是应用任何人工的或机械手来完成。
10.权利要求1中提出的方法，探测系统e可以是通过报告基因分析，cytoblot分析和显微分析等方法来完成。
11.权利要求1中提出的方法，步骤(c)中亚最适剂量的确定使用了软件及其运算法则。
12.权利要求10中提出的方法，亚最适剂量用于指导配伍设计。
13.权利要求10中提出的方法，已知药物的剂量被降低到亚最适剂量时可加强细胞用于筛选互动伴侣或先导化合物的敏感度。
14.权利要求1-12中提出的方法，所筛选的化合物系未知或未曾应用此方法鉴定而被报道。
15.对权利要求13中的化合物进行确认。
16.组成成分包括如何在权利要求1-12中的方法所确定的化合物、已知药物或被淘汰的先导药物及合适的药剂载体。
17.已知药物的亚最适浓度的确定需采用权利要求1-12中的任何方法。
18.组成成分包括采用权利要求1-12中任何方法所鉴定的亚最适浓度时的已知药物或被淘汰的先导药物及合适药剂载体。
19.环六酚羧肽Beauvericin(SZC-101)被鉴定为一个酮康唑和其他唑类药物的互动药物。
20.药物组成成分或配伍药剂剂型包括权利要求15中的组分。
21.通过权利要求1-3中的方法所确定的化合物，可用于鉴别与疾病相关的蛋白质及其路径。
全文摘要
这项发明为挖掘可以与低剂量已知药物产生互动作用的新一代化合物或配伍提供了一个有力的系统方法。选用已知的药物或被淘汰的先导药物被用作参照物，然后建立一个包括核酸、蛋白质等大分子的天然产物或合成化合物(纯的或混合的)库。通过建立包括生物化学的、基于细胞、动物模型以及临床治疗在内的活性检测分析方法和确定参照物(10％－40％最大活性的)亚最适剂量，按照0.1％－1％的检出率进行高通量地筛选不同浓度下的天然产物或合成化合物库。被鉴定为具有互动作用的候选物必须在与已知药物的亚最适剂量的结合后能增强已知药物最大活性70％－100％的活性。最后，被检测到的具有互动作用的辅助药物将继续被纯化和鉴定，最终从天然的或合成的混合物库中分离纯化出单一成分的互动药物。
文档编号A61K31/70GK1968685SQ200480034073
公开日2007年5月23日 申请日期2004年11月19日 优先权日2003年11月19日
发明者张立新 申请人:张立新