专利名称：分析活化聚乙二醇化合物的方法
分析活化聚乙二醇化合物的方法技术背景本发明涉及分析聚乙二醇化合物的化学分析方法。更具体地说， 本发明涉及利用"临界状态"液相色谱对聚乙二醇化合物的分析。本发 明的聚乙二醇化合物被"活化"以利于生理活性材料的化学改性，例如， 改性材料可应用于药物释放体系。生物活性化合物与聚氧化烯共轭连接，能够提高该化合物的生物相容性，参见，例如USP 5,366,735和USP 6,280,745。在一篇相关综述 (Bioconjugate Chem., 1995,6, pl50-165)中，Zalipsky认为，聚乙二醇是 能与生物活性化合物(如药物、蛋白质、肽、或酶)共轭连接的生物 相容性最好的聚合物之一，得到的共轭物具有改善的性质，如相容溶 解性，减小的毒性，提高的表面相容性，增加的循环吋间，以及减小 的免疫原性。聚乙二醇(PEG)是羟基封端的线性聚氧化烯，通常由分子式 HO(CH2CH20)nH表示。单甲氧基聚乙二醇(mPEG)通常由分子式 CH30(CH2CH20)nH表示。mPEG可以用基团"A"来"活化"，基团A可 以与生物活性材料的基团偶联。活化的mPEG通常由分子式 CH30(CH2CH20)nA表示。例如，三氯均三嗪(trichloro-s-triazine)活 化的mPEG可以与生物活性材料的胺基偶合，如Henmanson在 Bioconjugate Techniques (1996) 15章中的讨论。双活化线性PEGs在水 凝胶的形成中也是有用的。更最近，所谓的"第二代"PEGylation化学得到发展，例如，使mPEG 的二醇杂质污染问题最小化，增大PEG的分子量及增加接头(linker) 的稳定性，参见Roberts等，Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) p459-4。美国专利6，455，639描述了一种分子量增大的mPEG，其具有 窄的分子量分布。临界状态液相色谱成为了一种重要的聚合物分析方法，参见，例 如Gorbunov等，J.Chrom A, 955 (2002) 9-17。临界状态液相色谱被用于
测定mPEG中的聚乙二醇(参见，例如Baran等，J. Chrom. B， 753 (2001) 139-49;禾n Kazanskii等，Polymer Science, Series A, Vol 42, No. 6 (2000): p585-595)。然而，当mPEG分子量为5，000g/mol或更大时，聚乙二醇 和mPEG峰的分辨率低(参见Kazanskii等文献中的图2)。并且，临 界状态液相色谱不被用于分析活化的mPEG。发明内容本发明揭露临界状态液相色谱(LCCC)可以用于分析活化的PEGs， 用来测定残留的未活化的PEGs和不同程度活化的PEGs。例如，甚至 mPEG的分子量为5,000 g/mol或更大时，LCCC可以被用于测定活化 的mPEG中未活化的mPEG醇和PEG 二醇，单活化的mPEG和PEG 二醇，及双活化的PEG的相对量。而且，活化的PEG的衍生作用能增 加色谱分辨率。因此，例如，根据本发明，包含双活化的PEG的单活 化的mPEG的衍生作用可以增加其色谱分辨率。另外，根据本发明， 包含双活化的PEG 二醇的单活化的mPEG的衍生作用使其在被色谱法 分开后，更易于检测PEGs。因此，在一个实施方案中，本发明是一种化学分析方法，其包括 提供含活化基团A活化的PEGs的组合物样品，并利用临界状态液相 色谱法分析样品来确定样品中不同活化度(degrees of activation) PEGs 的相对量。更具体地说，在一个实施方案中，本发明是一种测定 RO(CH2CH20)nH ， RO(C2H40)nA ，及AO(C2H40)nA的混合物中 RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nA，及AO(C2H40)nA的化学分析方法， 其中R为氢或烷基，A为与表面或生物活性材料或用到的其它东西偶 联的官能团，n为大于10的整数，包括步骤利用临界状态液相色谱 分析混合物样品以确定混合物中RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nA,及 AO(C2H40)nA的相对量。在另一个实施方案中，本发明是一种测定RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nA，及AO(C2H40)nA的混合物中RO(CH2CH20)nH ， RO(C2H40)nA，及AO(C2H40)nA的化学分析方法，其中R为氢或垸基， A为与表面或生物活性材料或用到的其它东西偶联的官能团，n为大于
IO的整数，包括步骤(a)利用衍生化试剂衍生化混合物中的A基团， 形成包含RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nAD，及DAO(C2H40)nAD的 衍生化混合物，其中AD为衍生化的A基团；(b)利用临界状态液相色 谱分析衍生化混合物样品以确定衍生化混合物中RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nAD，及DAO(C2H40)nAD的相对量。作为另一选择的实施方案，羟基、R、或A基团可以出现两次以 上和/或在PEG链末端以外的地方。因此，在另一个实施方案中，本发明是一种化学分析方法，其包括提供含分子式M
x所示的聚乙二醇化合物的样品，其中M为小分子或聚合物骨架，其带有至少x个与0(CH2CH20)nB基 团连接的位点；n每次出现时独立地为1或大于1的整数，优选5或更大的整数， 更优选10或更大的整数，n优选小于2500，更优选小于2000,尤其优 选小于1000;B每次出现吋独立地为氢或A，其中A定义如上；禾nx为2或大于2的整数，优选3或更大的整数-,以及利用临界状态液相色谱分析混合物样品以测定具有不同A基 团活化度的聚乙二醇的相对量。作为这个的一个变体，在色谱分析之 前，化合物可以利用基团D衍生化。在另一个实施方案中，本发明的方法可以用来分析活化的聚乙烯 化合物的混合物，其中活化基团作为侧基连在含PEG的聚合物上。因 此，根据本实施例，样品包含分子式BO[(CH2CH20)nM]m(OCH2CH2)pOB 所示的化合物，其中M为连接两个PEGs的小分子，其带有含B的侧基，B每次出现时独立地为H或A，m,n,和p分别为大于1的整数，A定义如上。作为这个的一个变体，化合物可以由基团D衍生化。
图1为色谱图的复印件，其给出了 mPEG，丙醛双缩醛 (propionaldehyde diacetal)活化的mPEG和丙醛双縮醛活化二醇的分 离结果；图2为色谱图的复印件，其给出了 mPEG醇，甲磺酰酯活化的 mPEG和甲磺酰酯活化的二醇的分离结果；图3为色谱图的复印件，其给出了mPEG醇，对硝基苯基碳酸酯 活化mPEG和对硝基苯基碳酸酯活化的二醇的分离结果。发明详述本发明的一种方法所分析的化合物由分子式i， n和m所示(I )RO(C2H40)nA;(II) AO(C2H40)nA;禾口(III) RO(C2H40)nH其中，R代表(每次出现独立地代表)氢或C,.7烃基团(通常为甲 基)，n代表C2H40基团的摩尔平均数，如10-2000之间，A是"活化" 基团。在许多应用中，分子式I的化合物为所要的材料。分子式III的 化合物为无反应活性的未活化的PEG。分子式II的化合物是由PEG 二 醇杂质生成的双活化PEG。因此，被分析的样品通常主要由分子式I 的化合物与混合物中含量相对低的分子式II和III的化合物组成。分子 式I ， II和III化合物的相对量利用临界状态液相色谱分析混合物样品 中RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nA,及AO(C2H40)nA的相对量来测定。应了解，在其全部范围内，本发明包括PEG共聚物(例如，含C2H40 基团的无规或嵌段共聚物)和包含但不限于线性、支化、梳状及星形 拓扑结构的任意聚合物拓扑(topology)。活化基团A可以是已知的用于活化PEGs以进行下一步反应的任 何官能团，例如，偶联到生理活性试剂上。该活化基团的非限定例子 包括卤化物、磺酸酯(如甲磺酸酯)、异氰酸酯、胺、肼、氨氧基 (aminooxys)、硫醇、羧酸、酉旨、碳酸酯(如对硝基苯基碳酸酯)、酰 胺、氨基甲酸酯、醛(如丙醛)、縮醛(如丙醛縮醛)、酮、缩酮、马 来酰亚胺、乙烯基砜、碘乙酰胺、及二硫化物(如二硫吡啶)。应了解，需要一定的试验来获得临界状态液相色谱。然而，参考
文献将指导液相色谱领域的技术人员得到必要的条件，参见，例如Gorb画v等，J. Chrim A， 955 (2002) 9-17。临界状态LC 一般根据聚合 物端基组成分离聚合物，(理论上)不受聚合物分子量的影响。例如， 如果在临界状态下进行反相柱操作，那么，带有疏水端基的聚合物能 够与带有亲水端基的聚合物分开。LCCC可以等度(isocratically)操作，或先等度再梯度操作。虽然临界状态是所希望的，稍微偏离临界状态 的操作也会提供关于样品中多种官能化PEG的一定比例的测定信息。实施例1O.lg被丙醛双縮醛活化的重均分子量为5,000的mPEG与3毫升 水混合制备成注射样品。5微升注射样品被注射进52% A和48% B的 流动相中(这里A为47。/。的乙腈水溶液，B为43。/。乙腈水溶液)，流动 相流速为0.75 ml/min，在柱温为3(TC时，流经包装直径(packing diameter)为5微米的Supelco LC-18反相柱，柱内径为4.6 mm，柱长 为250 mm，接下来由一个蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector)生成图1的色谱图。色谱图1在大约3.8分钟时显示了 mPEG 峰，在约4.8分钟时显示了活化的mPEG峰，在约5.6分钟时显示了活 化的二醇峰。不同PEGs的相对量由峰面积和蒸发光散射检测器的响应 因子确定。蒸发光散射检测器在液相色谱中已被熟知，参见，例如Rissler, J. Chrom. A， 742(1996)45。O.lg被甲磺酸酯活化的重均分子量为5，000的mPEG与3毫升水 混合制备成注射样品。5微升注射样品被注射进52% A和48% B的流 动相中(这里A为47。/。的乙腈水溶液，B为43。/。乙腈水溶液)，流动相 流速为0.75 ml/min，在柱温为30。C时，流经包装直径为5微米的Supelco LC-18反相柱，柱内径为4.6mm，柱长为250 mm，接下来由一个蒸发 光散射检测器生成图2的色谱图。色谱图2在大约3.8分钟时显示了 mPEG峰，在约4.4分钟时显示了活化的二醇峰，在约4.9分钟时显示 了活化的mPEG峰，不同PEGs的相对量由峰面积和蒸发光散射检测
器的响应因子确定。 实施例3O.lg被对硝基苯基碳酸酯活化的重均分子量为20,000的mPEG与 3毫升水混合制备成注射样品。5微升注射样品被注射进52% A和48% B的流动相中(这里A为47。/。的乙腈水溶液，B为43。/。乙腈水溶液)， 流动相流速为0.75 ml/min，在柱温为29。C时，流经包装直径为5微米 Jupiter C-18反相柱，柱内径为4.6mm，柱长为150 mm，接下来由一 个蒸发光散射检测器生成图3的色谱图。色谱图3在大约3分钟时显 示了 mPEG峰，在约4.8分钟时显示了活化的mPEG峰，约8.5分钟时 显示了活化的二醇的小峰。不同PEGs的相对量由峰面积和蒸发光散射 检测器的响应因子确定。衍生化的活化的mPEG在另一个实施方案中，本发明是用于测定上面所讨论活化的PEGs 的化学分析方法，其包含利用衍生化试剂D使PEGs的A基团衍生化。因此，根据一个实施方案，该方法包括提供混合物中的 RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nA，及AO(C2H40)nA的样品，利用衍生 化试剂使混合物中的A基团衍生化，形成含RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nAD，及DAO(C2H40)nAD的衍生化混合物，其中AD为衍 生化的A基团；利用临界状态液相色谱分析衍生化的混合物样品来确 定衍生化的混合物中RO(CH2CH20)nH ， RO(C2H40)nAD ，及 DAO(C2H40)nAD的相对量。当活化基团是亲水时，例如包含但不限于， 醛、马来酰亚胺、胺或硫醇的基团，尤其能应用本发明的该实施方案。 亲水基团活化的mPEG难于与mPEG醇分离，因为mPEG醇的羟基也 是亲水性的。然而发现，如果该活化的mPEG由衍生化试剂衍生化， 其中将疏水基团连在活化的mPEG的A基团上，那么衍生化的活化的 mPEG就能够很容易地与未活化的PEG醇分开。类似地，亲水基团活化的mPEGs难于与用两个亲水基团活化的 PEG二醇分离，因为mPEG醇的甲基不是非常疏水。然而发现，如果 活化的mPEG与双活化的PEG的A基团由衍生化试剂衍生化，其中将
疏水基团连在活化的mPEG和双活化的PEG 二者的A基团上，那么， 衍生化的活化的mPEG能够很容易与衍生化的双活化的PEG分开。因此，衍生化试剂是与活化基团A反应改变基团亲水性/疏水性的 基团。衍生化试剂的使用也可能是所需的，其中衍生作用是可逆的， 能可逆地转化回活化基团A。合适的衍生化试剂的非限定性例子包括 醇、胺、肼(如l-(肼基羰甲基)氯化吡啶和二硝基苯基苯基胼，其与PEG 醛(如丙醛)、縮酸、酮、及缩酮反应生成PEG腙)、氨氧基、硫醇(如 萘硫醇，其与PEG马来酰亚胺反应生成PEG硫醚)、醛(如与PEG胺反 应生成PEG亚胺的芳香醛)；縮醛、酮、縮酮、马来酰亚胺、乙烯基砜、 碘乙酰胺、二硫化物(如二吡啶二硫化物，其与PEG硫醇反应生成PEG 二硫吡啶)、氯化物、磺酸酯、异氰酸酯、羟酸、酉旨、碳酸酯、酰胺、 及氨基甲酸酯。衍生化试剂最优选将可检测的特征给予衍生化的活化的PEG (例 如mPEG)，如紫外(UV)载色体(chromaphore)或荧光基团，使得 衍生化的活化的PEG (例如mPEG)在从临界LC体系中洗脱时能被检 测出来。应了解，即使当活化基团A具有足够的疏水特征，使单活化 的PEG (例如mPEG)与双活化的PEG在临界LC色谱柱上能够充分 地拆分，在从临界LC体系中洗脱时，利用衍生化试剂使活化的mPEG 和双活化的PEG衍生化也是必须的，衍生化试剂给予它们足够的可检 测特征。结论总之，显而易见，尽管上面描述了有关优选实施方案的发明，应 了解，本发明不限于此，而是要覆盖所有包含在由权利要求限定的范 围内的本发明的各种选择、修改和等同状况。
权利要求
1.化学分析方法，该方法用于测定RO(CH2CH2O)nH，RO(C2H4O)nA，及AO(C2H4O)nA的混合物中的RO(CH2CH2O)nH，RO(C2H4O)nA，及AO(C2H4O)nA，其中R为烷基，A为与表面或生物活性材料或用到的其它东西偶联的官能团，n为大于10的整数，所述方法包括步骤利用临界状态液相色谱分析混合物样品以确定混合物中RO(CH2CH2O)nH，RO(C2H4O)nA，及AO(C2H4O)nA的相对量。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，R基本上由甲基组成。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，A包含酸基。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，醛基为丙醛。
5. 报据权利要求1所述的方法，其屮，A为丙醛双缩醒。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，A为甲磺酰酯。
7. 根据权利要求所述的方法，其中，A为对硝基苯基碳酸酯。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中，A包含马来酰亚胺基团。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中，A包含胺基。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中，A包含硫醇基团。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中，A包含二硫醇基团。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中，RO(C2H40)nA的重均分 子量大于5,000 g/mol。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中，RO(C2H40)nA的重均分 子量大于10,000 g/mol。
14. 化学分析方法，该方法用于测定RO(CH2CH20)nH ， RO(C2H40)nA，及AO(C2H40)nA的混合物中的RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nA，及AO(C2H40)nA，其中R为烷基，A为与表面或生物 活性材料或用到的其它东西偶联的官能团，n为大于10的整数，该方 法包括步骤(a)利用衍生化试剂使混合物的A基团衍生化，形成包 含RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nAD，及DAO(C2H40)nAD的衍生化 的混合物，其中AD为衍生化的A基团；(b)利用临界状态液相色谱 分析衍生化的混合物样品来确定衍生化的混合物中RO(CH2CH20)nH， RO(C2H40)nAD，及DAO(C2H40)nAD的相对量。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中，R基本上由甲基组成。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中，A包含羰基。
17. 根据权利耍求16所述的方法，其中，A包含醛基。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中，醛基为丙醛。
19. 根据权利要求16所述的方法，其中，衍生化试剂为l-(肼基 羰甲基)氯化吡啶。
20. 根据权利要求16所述的方法，其中，衍生化试剂为二硝基苯 基肼。
21. 根据权利要求14所述的方法，其中，A为马来酰亚胺。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中，衍生化试剂为硫代萘。
23. 根据权利要求14所述的方法，其中，A包含胺基。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中，衍生化试剂为芳香醛。
25. 根据权利要求14所述的方法，其中，A包括硫醇基团。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中，衍生化试剂为邻二吡啶 二硫化物。
27. 根据权利要求14所述的方法，其中，RO(C2H40)nA的重均分 子量大于5,000 g/mol。。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中，RO(C2H40)nA的重均分 子量大于10,000 g/mol。
29. 化学分析方法，该方法包括提供含活化基团A活化的PEGs 的组合物样品，和利用临界状态液相色谱分析样品来确定样品中不同 活化度PEGs的相对量。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中，样品包含分子式M[0(CH2CH20)。BL所示的聚乙二醇化合物，其中M为小分子或聚合物骨架，其带有至少x个与0(CH2CH20)nB基 团连接的位点；n每次出现时独立地为或大于1的整数，B每次出现时独立地 为氢或A;禾口x为2或大于2的整数，以及利用临界状态液相色谱分析混合物样品以确定具有不同A基 团活化度的聚乙二醇的相对量。
31. 根据权利要求29所述的方法，其中，样品包含聚乙二醇，其 中活化基团A为聚合物链的侧基。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中，样品包含分子式<formula>formula see original document page 5</formula>所示的聚合物，其中 M为连接到两个PEGs的小分子，其有含B的侧基， B每次出现时为H或A， m, n，和p独立地为大于1的整数， A定义如上。
33.根据权利要求29-32任一项所述的方法，进一步包括在色谱分 析样品前利用衍生化试剂使A基团衍生化。
全文摘要
化学分析方法，该方法用于测定RO(CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>O)<sub>n</sub>H，RO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A，及AO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A的混合物中的RO(CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>O)<sub>n</sub>H，RO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A，及AO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A，其中R为烷基，A为与表面或生物活性材料或用到的其它东西偶联的官能团，n为大于10的整数。所述方法包括步骤利用临界状态液相色谱分析混合物样品以确定混合物中RO(CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>O)<sub>n</sub>H，RO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A，及AO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A的相对量，另外，化学分析方法，该方法用于测定RO(CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>O)<sub>n</sub>H，RO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A，及AO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A的混合物中的RO(CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>O)<sub>n</sub>H，RO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A，及AO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>A，其中R为烷基，A为与生物活性材料偶联的官能团，n为大于10的整数。该方法包括两个步骤。第一个步骤是利用衍生化试剂使混合物的A基团衍生化，形成包含RO(CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>O)<sub>n</sub>H，RO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>AD，及DAO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>AD的衍生化的混合物，其中AD为衍生化的A基团。第二个步骤是利用临界状态液相色谱分析衍生化的混合物样品来确定衍生化的混合物中RO(CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>O)<sub>n</sub>H，RO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>AD，及DAO(C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O)<sub>n</sub>AD的相对量。
文档编号A61K47/48GK101133322SQ200680007046
公开日2008年2月27日 申请日期2006年3月3日 优先权日2005年3月4日
发明者M·图罗夫斯基, R·A·沃林福德 申请人:陶氏环球技术公司