专利名称：天麻素在制备半胱氨酸蛋白酶-3活性抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及天麻素在制备半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)活性抑制剂中的应用， 属于药学领域。
技术背景细胞凋亡的发生是一个复杂的Caspase家族引导的蛋白酶级联反应过程，尽管 对于不同的细胞或不同信号传导途径诱发的凋亡过程中参与的Caspase有所不同， 但Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也是凋亡的关键酶和执行者。 基因剔除实验和动物模型显示，阻断Caspase活性即阻滞了体外和体内的细胞凋亡。 因此，Caspase-3有望成为治疗异常凋亡引起的神经退行性疾病、心脑血管疾病、风 湿性关节炎等的新靶点，这就需要有效的Caspase-3抑制剂的研发。Caspase-3抑制剂将成为阻止细胞凋亡的重要新药，其潜在的优点在于能阻断 细胞凋亡所需的特异蛋白酶而不会产生绝大多数广谱药物的不良反应。病毒性及内 源性Caspase抑制剂不能用做药物，肽类Caspase-3抑制剂的研究虽取得了一些进展， 但肽在体内不稳定，这就限制了它的应用。因此，小分子非肽类Caspase-3抑制剂 的应用最有前景刘哲林,江涛,任素梅,等.Caspase-3抑制剂研究进展.广东药学院学 报，2004;20 (6):669-670。Caspase-3抑制剂可用于治疗异常凋亡引起的神经退行性疾病、心脑血管疾病、 风湿性关节炎等疾病。具体如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎縮性脊髓侧索硬化、 亨廷顿病、创伤性脑损伤、脊髓损伤、重症肝炎、肝功能紊乱、骨关节炎、风湿性 关节炎、获得性免疫缺陷综合征、心肌梗塞、脑缺血等陈益华，张华杰，南发俊,等. Caspases抑制剂的研究进展.生命科学，2006;18 (3):247-254;刘哲林，江涛,任素梅, 等.Caspase-3抑制剂研究进展.广东药学院学报，2004;20 (6):669-670;公开号 CN1662505，发明名称可用做Caspase-3抑制剂的喹啉衍生物及其制备方法和药用 组合物。天麻素(gastrodine)为兰科植物天麻的主要成分，分子式C13H1807，分子量 295.38，结构式如下CH2OHCH2OH药理实验表明天麻素可恢复大脑皮质兴奋与抑制过程间的平衡失调，具有镇静、 安眠和镇痛等中枢抑制作用。还有扩血管、改善心肌微循环、增加心肌营养性血流量、提高供氧能力；降压作用。临床用于治疗神经衰弱、血管神经性头痛、三叉神 经痛、坐骨神经痛、眩晕症。但天麻素及其同类化合物对Caspase-3活性的影响却未 见报道。 发明内容本发明要解决的技术问题是提供天麻素在制备Caspase-3活性抑制剂中的应用。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案 天麻素在制备半胱氨酸蛋白酶-3活性抑制剂中的应用。所述Caspase-3抑制剂可用于治疗的疾病包括异常凋亡引起的神经退行性疾病、 心脑血管疾病、风湿性关节炎等。具体如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓 侧索硬化、亨廷顿病、创伤性脑损伤、脊髓损伤、重症肝炎、肝功能紊乱、骨关节 炎、风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合征、心肌梗塞、脑缺血等。天麻素是一种已知的具有药物活性的物质，因此，可以按常规制剂方法， 将其制备成临床适用的任何一种药剂，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂等口服固体 制剂、口服液体制剂、注射剂等。天麻素在制备Caspase-3活性抑制剂药物时的用法用量根据体外试验结果结合 天麻素理化性质推算剂量范围为100-500mg/人/日，用法可口服、注射。因体内外差 异性，实际临床用量用法可以有所调整。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡 是依照本发明公开内容所做出的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为caspase3和AP42免疫荧光染色结果；(a)红色荧光显示为caspase3免 疫荧光染色阳性细胞；(b)绿色荧光显示为AP42免疫荧光染色阳性细胞；(a+b)蓝 色荧光为细胞核着色的DAPI染色，胞浆中橙黄色荧光显示为caspase3和A e 42均阳4性细胞；(1)转染PS1突变型M146L的细胞;(2)转染野生型PS1的CH0细胞;(3) 25 ug/ml 天麻素作用24h后转染PS1突变型M146L的CH0细胞。图2为caspase3活性蛋白的免疫印迹Western blot检测结果1)为未转染 CH0细胞；2)为转染野生型PS1的CH0细胞；3)转染PS1突变型M146L的CH0细胞； 7) gastrodine作用24h转染PSl突变型M146L的CH0细胞；4、 5、 6均为其他药物 单体作用后的转染PS1突变型M146L的CH0细胞。caspase3活性蛋白条带大约位于 17kDa处。图中P-actin (内参)显示样本的蛋白上样量保持均一。
具体实施方式
天麻素、天麻素片、天麻素胶囊、天麻素注射液皆为已获批准文号的上市产品，皆 可通过购买市售品获得，如皆购自昆明制药集团股份有限公司。 实施例l:天麻素对Caspase-3活性的影响一. 目的利用Western blot免疫印迹、细胞免疫荧光染色实验技术和方法，观察有效天 然药物单体对细胞凋亡执行基因caspase3蛋白表达的影响，进而从细胞凋亡基因表 达方面探讨天然药物单体抗细胞凋亡的作用机制。二. 材料与方法1.实验材料及设备(1) 细胞来源突变型PS1M146L和野生型APP751双转染细胞系(PS1M146L/APP751)、野生型PS1 和野生型APP751双转染中国仓鼠卵巢瘤细胞系(TW)、中国仓鼠卵巢瘤细胞系(CH0) 由美国哈佛大学医学院神经疾病研究中心构建，经中国医学科学院基础研究所梁平 教授转赠。(2) 试剂及药品Ae42小鼠抗人单克隆抗体、Caspase3兔抗小鼠单克隆抗体、actin多克隆兔抗 小鼠抗体均由宣武医院多肽室赠送。山羊血清封闭液(Lot Number:245742)购于中 山生物制品公司。Texas Red 羊抗小鼠免疫荧光二抗(Lot Number:51216) 、 CyTM 2羊抗兔免疫荧光二抗(Lot Number:51742) 、 DAPI染液(Lot Number:38495)均为 美国IR公司出品。辣根过氧化物酶(HRP)耦联羊抗小鼠二抗和羊抗兔二抗(Lot Number :73452) ， ECL发光液(Lot Number :EV052)均为香港Amersham Biosciences Ltd 公司出品。PVDF膜(Lot Number:2378)美国MA公司出品。BCA蛋白定量试剂盒为美国Proraega (Lot Number: EDM938)公司出品。细胞培养基高糖DMEM (Lot No:12100-061) 、 MEM (Lot No:41500-034) 、 F12 "ot No:21700-075 ) 、 Fetal Bovine Serum(Lot No: 16000 — 044 )、 Penicillin-Streptomycin (Lot No:15070-063) 、 Zeocin (Lot No:R25005) 、 G_418 (Lot No:11811-031 )均为美国GIBC0生物制品公司出品。Puromycin (Lot No:3025B52)由美国BD公司出品。细胞培养板由美国COSTER公司出品。天麻素(gastrodine， Gastro)、天然药标准品均购自中国生物制品检定所。(3)仪器设备仪器名称 产地恒温C02孵育箱 FORMA SCIENTIFIC, USA倒置相差显微镜 OLYMPUS， Japan倒置相差荧光显微镜 Nikon 2000-U， Japan台式离心机 Beckman， Germany转印全套系统 中国科学院武汉科学仪器厂 SP0T-RT冷却式数字显微摄像系统Nikon ， Japan 2.实验方法(1) 细胞培养及分组方法CH0细胞系培养用高糖DMEM，加入20y。FBS、 2% Penicillin-Str印tomycin，其中 PSl M146L / APP细胞培养基外加250ug/ml G418、 2.5 ug/ml Puromycin。所有细胞 均在37'C、 5%C02、饱和湿度下培养，0.25%胰酶消化传代。细胞以5X 105接种于6孔 板内孵育48h，弃培养基加入终浓度为25ug/ml天然药物单体无血清培养基，孵育24h 后加入4 uM丁酸钠作用24h后取材。(2) 细胞免疫荧光染色 -以30X1(T个细胞密度50ul接种24孔板，37。C孵育24h后弃去培养基，冷PBS 贴壁冲洗5min连续4次。每孔500ul 4%多聚甲醛固定细胞，室温放置lh。翻板弃 液，加PBS连续冲洗4次每次15min后加山羊血清封闭工作液每孔500ul，室温放置 lh。弃去山羊血清封闭液，直接加入预先用封闭工作液稀释的Caspase3兔抗小鼠单 克隆抗体(1: 150) 、 AP卜42小鼠抗人单克隆抗体(1: 250)，每孔总体积500ul 4'C 过夜。弃去一抗加PBS连续冲洗4次每次15min。加Texas Red 羊抗小鼠免疫荧光二抗或CyT"2羊抗兔二抗，以PBS按照l: 200进行稀释，每孔250ul ， 37°C闭 光孵育2h。弃去二抗，PBS闭光冲洗4次每次15min。每孔加入预先配好的冷PBS 稀释细胞核染液DAPI (1: 1000)工作液250ul ，室温避光染20min ， PBS冲洗2minX4 次，荧光显微镜下观看结果。SPOT-RT冷却式数字显微摄像系统收集图像，Image-Pro Plus 5.0图像分析软件进行图像分析。 (3) Western blot免疫印迹各细胞系均以相同密度培养，用冷PBS洗一次，加入预冷的RIPA裂解缓冲液，取 细胞并在冰上裂解30min，将裂解物以14， OOOrpm 4°C离心30min，收集上清。取10ul 样品用BCA蛋白定量试剂盒定量。余下样品加入5X上样缓冲buffer(100mmol/L Tris、 4%SDS、 0.2%溴酚蓝、20%甘油、200mmol/L二硫苏糖醇)充分混合。以25ug/为上样 量10XSDS-PAGE电泳分离后，350毫安3h将蛋白转移至PVDF膜。甲醇浸泡15S后干燥 lh， 5%脱脂奶粉封闭lh，按照l : 1000加入Caspase3—抗，小鼠抗人P-actin单克 隆抗体(1:500)， 4° C过夜辣根过氧化物酶(HRP)耦联羊抗小鼠二抗(l : 2000)、羊抗 兔二抗(l : 2000)室温孵育2h，用化学发光法(ECL)检测结果。蛋白表达条带通过 Bandscan图像分析软件进行分析。3.统计学方法实验结果采用SPSS11.5统计学分析软件中单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)进 行统计。其中免疫荧光值、免疫印迹图像的光密度(OD)值均与突变型基因细胞组 最大值相比进行数据的标准化处理后进行数据统计学分析。三.结果1.细胞免疫荧光染色细胞免疫荧光染色结果显示AP 42表达与capase3阳性表达部位均位于胞浆，且 两者阳性表达部位具有一致性(图1)。不同组细胞Ae仏caspase3表达IOD值分 析结果显示，突变型PS1M146L组AP42表达与capase3阳性细胞数均较转染野生型 PS1 (WT组)多，统计学分析差异显著(FAM2=3.489， F —e3 = 1. 211， P<0. 05)。 加用天然药物单体天麻素(Gastro)组Ae"表达较突变型PS1M146L组(对照组 control)明显降低，统计学显示差异显著P<0.05。Tab. 1 Comparation of effect of different naturally medical monomer on expression of AP42 and caspase3 ( 士s， n=8)CHO WT M146L GastroAP 420.976±0.1991.032±0.2461.446±0.192#* 1.078±0.194*.Caspase 31.000±0.4050.974±0.2641.309±0.157#* 1.126±0.2148*Note: # vs WT group P<0.05; * vs PS1M146L group P<0.05;2. caspase3 Western blot免疫印迹各组在分子量17 kDa左右出现caspase3活性片段条带(图2)，统计学分析结 果显示各组组间差异显著(F=4. 365， P〈0. 05)。突变型PS1M146L组caspase3活性 蛋白表达量较转染野生型PS1 (WT组)明显增多，统计学显示差异显著P〈0.05。加 用天然药物单体天麻素(Gastro)组与未加用天然药物单体处理的突变型 PSlM146(control)组caspase3活性蛋白表达量有不同程度减少，统计学分析差异显 著P〈0.05。Tab. 2 Comparation of effect of different naturally medical monomer on expression of caspase3 activation (3F±" n=6)CHOWTM146LGastro1.002±0. 4000.643±0. 5310.779±0.303#0.708 ±0.646*Note: # vs wt group P〈0. 05;承vs PS1M146L group P<0.05.
权利要求
1.天麻素在制备半胱氨酸蛋白酶-3活性抑制剂中的应用。
2. 根据权利要求1所述的天麻素在制备半胱氨酸蛋白酶-3活性抑制剂中的应 用，其特征在于所述半胱氨酸蛋白酶-3活性抑制剂可用于治疗的疾病包括异常凋 亡引起的神经退行性疾病、心脑血管疾病、创伤性脑损伤、脊髓损伤、重症肝炎、 肝功能紊乱、骨关节炎、风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合征。
3. 根据权利要求2所述的天麻素在制备半胱氨酸蛋白酶-3活性抑制剂中的应 用，其特征在于所述神经退行性疾病为帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎縮性脊髓 侧索硬化、亨廷顿病。
4. 根据权利要求2所述的天麻素在制备半胱氨酸蛋白酶-3活性抑制剂中的应用，其特征在于所述心脑血管疾病为心肌梗塞、脑缺血。
全文摘要
本发明公开了天麻素在制备半胱氨酸蛋白酶-3活性抑制剂中的应用，属于药学领域。天麻素在制备半胱氨酸蛋白酶-3活性抑制剂中的应用，所述Caspase-3抑制剂可用于治疗的疾病包括异常凋亡引起的神经退行性疾病、心脑血管疾病、骨湿性关节炎等。具体如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、亨廷顿病、创伤性脑损伤、脊髓损伤、重症肝炎、肝功能紊乱、骨关节炎、风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合征、心肌梗塞、脑缺血等。本发明的优点是能阻断细胞凋亡所需的特异蛋白酶而不会产生绝大多数广谱药物的不良反应。
文档编号A61P31/00GK101322713SQ200710118900
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月14日 优先权日2007年6月14日
发明者平 梁, 贾建平, 魏翠柏 申请人:首都医科大学宣武医院