专利名称：作为激酶抑制剂的2-杂芳基氨基嘧啶衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白激酶抑制剂和使用该化合物的方法。更具体而言，本发明涉及c-kit和PDGFR抑制剂及其用于治疗和预防c-kit和PDGFR介导的病症的用途。
背景技术：
蛋白激酶代表一大族蛋白质，它们在调节各种细胞过程和保持对细胞功能的控制中扮演重要角色。这些激酶包括但不限于受体酪氨酸激酶例如血小板衍生生长因子受体激酶(PDGFR)、干细胞因子受体激酶c-kit、神经生长因子受体(trkB)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR3)、非受体酪氨酸激酶如Abl、融合激酶BCR-Abl、Fes、Lck和Syk；和丝氨酸/苏氨酸激酶如b-RAF、MAP激酶(例如MKK6)和SAPK2β。在许多疾病状态中都观察到激酶活性异常，所述疾病状态包括良性和恶性的增殖性疾病以及由免疫和神经系统不合适的激活所导致的疾病。
发明内容
本发明提供可用作蛋白激酶抑制剂的化合物及其药物组合物。
本发明的一个方面提供式(1)化合物或其可药用盐
其中 1-4个X1、X2、X3、X4、X5和X6是N且其余的是CR3W，且E环通过碳原子与NR、R2和R3连接； Ar是任选被取代的5-6元芳基或杂芳基，条件是Ar不是咪唑基； R1和R2独立的是C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基或羟基取代；或是卤素、氰基、硝基、(CR2)kOR7、(CR2)kO(CR2)1-4R7、(CR2)kSR7、(CR2)kNR9R10、(CR2)kC(O)O0-1R7、OC(O)R7、(CR2)kC(S)R7、(CR2)kC(O)NR9R10、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)kNRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR9R10、(CR2)kS(O)1-2R8、(CR2)kNRS(O)1-2R8或(CR2)kR6；或任意两个相邻的R2基团与其连接的原子一起可形成任选取代的5-8元碳环、杂环、芳基或杂芳基环； R3是-L-NR4R5、-X-NR-C(O)R8或-X-NR-C(O)NR4R5，其中L是-X-C(O)、-X-OC(O)、-SO0-2(CR2)j、(CR2)1-4、-O(CR2)1-4或
且X是(CR2)j或[C(R)(CR2OR)]； R4、R5、R9和R10独立的是H；C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6取代；或是(CR2)kCN、(CR2)1-6NR7R7、(CR2)1-6OR7、(CR2)kC(O)O0-1R7、(CR2)kC(O)NR7R7或(CR2)k-R6； R6是任选取代的C3-7环烷基、C6-10芳基或者5-10元杂芳基或5-7元杂环； R7和R8独立的是(CR2)k-R6或C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、酰胺基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6取代；或R7是H； 或者R4和R5与NR4R5中的N一起、R7和R7与NR7R7中的N一起或R9和R10与NR9R10中的N一起，可形成4-7元杂环，所述杂环任选被1-3个R11基团取代且任选含有NR12、O、S、＝O或双键； R11是R8、(CR2)k-OR7、CO2R7、(CR2)k-C(O)-(CR2)k-R8、(CR2)kC(O)NR7R7、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)kNRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR7R7、(CR2)kS(O)1-2R8或(CR2)kNRS(O)1-2R8； R12是H、R8、-(CR2)1-4CO2R7、(CR2)k-C(O)-(CR2)k-R8、(CR2)kC(O)NR7R7、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)1-4NRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR7R7、(CR2)kS(O)1-2R8或(CR2)kNRS(O)1-2R8； R是H或C1-6烷基； k是0-6； j和m独立的是0-4； 条件是Ar是苯基且X是(CR2)0时，-X-NR-C(O)R8中的R8不是苯基。
在一些实例中，上式(1)中的E环是吡啶基。在其它实例中，Ar是苯基。
在另一些实例中，若R2存在则为卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基或CO2R7且R7是H或C1-6烷基。在另一些实例中，R3是-L-NR4R5、-X-NR-C(O)R8或-X-NR-C(O)NR4R5；L是-X-C(O)；X是(CR2)j；且j是0。
在一个实施方案中，本发明提供式(2A)、(2B)或(2C)的化合物
其中 R1是C1-6烷氧基或含有1-6个氟原子的卤代烷基； R2若存在则是C1-6烷基； R3是-L-NR4R5、-X-NR-C(O)R8或-X-NR-C(O)NR4R5； L是-X-C(O)； X是(CR2)j； R4和R5独立的是H；C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6取代；或R4和R5与N一起形成哌嗪基、吡咯烷基或哌啶基，其中每个基团都任选被＝O或1-2个R11基团取代； j是0； k是0-4； m是0-1；且 R、R6、R8和R11如式(1)中所定义。
在上式(1)、(2A)、(2B)和(2C)中，R1可以是C1-6烷氧基或含有1-6个氟原子的卤代烷基。例如，R1可以是OCH3、OCHF2、OCF3、OCH2CF3、OCF2CH3或OCH2CF3。
在上式(1)、(2A)、(2B)和(2C)中，R3选自于
在其它实例中，上式(1)、(2A)、(2B)和(2C)中的R3选自于
其中RA选自于-NH2、-NEt2和-NH(CH2)1-6OH。
在另一些实例中，上式(1)、(2A)、(2B)和(2C)中的R3选自于
本发明的另一方面提供含有治疗有效量的式(1)、(2A)、(2B)或(2C)化合物和可药用赋形剂的药物组合物。
本发明的另一方面提供调节激酶活性的方法，其包括向有需要的系统或主体施用治疗有效量的式(1)、(2A)、(2B)或(2C)的化合物或其可药用盐或其药物组合物从而调节所述激酶活性。
在一个实施方案中，本发明提供调节c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6、SAPK2β、BRK、Fms、KDR、c-raf或b-raf激酶的方法。在具体实施方案中，本发明提供调节c-kit、PDGFRα或PDGFRβ的方法；更具体而言，本发明提供的方法中，式(1)、(2A)、(2B)或(2C)的化合物或其可药用盐或其药物组合物可以在体外或体内直接接触c-kit、PDGFRα或PDGFRβ。
本发明还提供用于治疗通过调节激酶活性可阻止、抑制或改善所述疾病或情况的病理学和/或症状的疾病或情况的方法，其包括向个体施用治疗有效量的式(1)、(2A)、(2B)或(2C)的化合物或其可药用盐或其药物组合物，并任选地与第二种治疗剂联用。可以与本发明化合物联用的治疗剂的实例包括但不限于抗纤维化药、吡非尼酮、他克莫司、抗炎药、皮质类固醇、色甘酸钠、白三烯拮抗剂、IgE阻滞剂、支气管扩张药、β2-激动剂、黄嘌呤类、抗胆碱药或化疗药。当与第二种治疗剂一起给药时，式(1)、(2A)、(2B)或(2C)的化合物或其可药用盐或药物组合物可以在第二种治疗剂之前、与其同时或在其之后施用。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗由c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6、SAPK2β、BRK、Fms、KDR、c-raf或b-raf激酶调节的疾病或情况的方法。在具体实例中，本发明提供用于治疗由PDGFRα、PDGFRβ或c-kit调节的疾病或情况的方法。在一些实例中，本发明提供用于治疗由c-kit调节的疾病或情况的方法。
可以用本发明化合物和组合物调节的激酶介导的疾病或情况的实例非限制性地包括肥大细胞相关疾病、过敏性病症、肠易激综合征(IBS)、纤维变性疾病、肿瘤性病症、炎性病症、自身免疫性病症、移植物抗宿主疾病、代谢综合征、CNS相关病症、神经变性病症、疼痛情况、物质滥用、癌症、心血管疾病和朊病毒病。
可以用本发明化合物和组合物治疗的肥大细胞介导的疾病的实例非限制性地包括过敏性病症(包括哮喘和特应性皮炎)、荨麻疹、痤疮和痤疮丙酸杆菌、进行性骨化性纤维发育不良(FOP)、炎症和由于接触化学或生物武器(如炭疽和硫-芥子气)引起的组织破坏、囊性纤维化病；肾病、炎性肌肉病症、HIV、II型糖尿病、脑局部缺血、肥大细胞增多症、药物依赖和戒断症状、CNS病症、预防和最小化脱发、细菌感染、间质性膀胱炎、炎性肠病(例如，克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、不确定的结肠炎和感染性结肠炎)、肿瘤血管生成、自身免疫性疾病、炎性疾病、多发性硬化(MS)和骨损失。
可以用本发明化合物和组合物治疗的过敏性病症的实例非限制性地包括哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、过敏性鼻窦炎、过敏性综合征、荨麻疹、血管性水肿、变应性接触性皮炎、结节性红斑、多形性红斑、皮肤坏死性静脉炎(cutaneous necrotizing venulitis)、昆虫叮咬皮肤炎症和吸血性寄生虫感染。
肠易激综合征(IBS)是一种功能性胃肠病症，其特征是腹痛和肠习惯的改变。疼痛的特点是排便后得以缓解，并且可能伴有大便频率的增加或减少、大便粘稠度的改变、便痛、便急、排便不尽、大便带有粘液或腹胀。
本文中的纤维变性疾病包括与细胞外基质组分形成和沉积特别是在内部器官包括肾脏、心脏、肺脏、肝脏、皮肤和关节中形成和沉积有关的所有情况。可以用本发明化合物和组合物治疗的纤维变性疾病的实例非限制性地包括硬皮病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、原发性肺高血压(例如肺动脉高血压(PPAH))、肝纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、肝硬化、骨髓纤维化、丙型肝炎(HCV)和非酒精性脂肪肝(NASH)。
可以用本发明化合物和组合物治疗的肿瘤性病症的实例非限制性地包括肥大细胞增多症、胃肠道间质瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、脊髓发育不良综合征、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、胃癌、睾丸癌、成胶质细胞瘤和星形细胞瘤。
可以用本发明化合物和组合物治疗的炎性病症的实例非限制性地包括类风湿性关节炎、结膜炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎。
可以用本发明化合物和组合物治疗的自身免疫性病症的实例非限制性地包括多发性硬化、银屑病、肠的炎性疾病、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、多关节炎、局部或全身性硬皮病、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、皮肤红斑、皮肌炎、多发性肌炎、斯耶格伦氏综合征、结节性全动脉炎、自身免疫性肠病和增生性肾小球肾炎。
可以用本发明化合物和组合物治疗的移植物抗宿主疾病的实例非限制性地包括器官移植的移植物排斥，如肾移植、胰腺移植、肝移植、心脏移植、肺移植和骨髓移植的移植物排斥。
可以用本发明化合物和组合物治疗的代谢综合征的实例非限制性地包括I型糖尿病、II型糖尿病和肥胖。
可以用本发明化合物和组合物治疗的CNS相关病症的实例非限制性地包括抑郁、心境恶劣障碍、循环型情感性障碍、厌食症、易饿病、月经前期综合征、绝经后综合征、精神迟缓(mental slowing)、集中力缺失、悲观烦恼、精神激动、自嘲和性欲降低、焦虑症、精神病学病症和精神分裂症。
可以用本发明化合物和组合物治疗的抑郁情况的实例非限制性地包括双相性抑郁、严重的或忧郁性抑郁、非典型的抑郁、难治性抑郁和季节性抑郁。可以用本发明化合物和组合物治疗的焦虑症的实例非限制性地包括与换气过度和心律失常有关的焦虑、恐怖症、强迫症、创伤后应激障碍、急性应激障碍和泛化性焦虑症。可用本发明化合物和组合物治疗的精神病学病症的实例非限制性地包括恐慌发作，包括精神病、妄想性障碍、转换障碍、恐怖症、躁狂症、谵妄、分离性发作(dissociative episode)，包括分离性遗忘症、分离性漫游和分离性自杀行为、自我忽视、剧烈的或攻击性行为、创伤、边缘型人格、以及急性精神病如精神分裂症，包括偏执型精神分裂症、错乱型精神分裂症、紧张型精神分裂症和未分化型精神分裂症。
可以用本发明化合物和组合物治疗的神经变性病症的实例非限制性地包括骨关节炎、阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、朊病毒病、运动神经元病(MND)和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
可以用本发明化合物和组合物治疗的疼痛情况的实例非限制性地包括急性痛、术后痛、慢性痛、伤害性疼痛、癌症痛、神经性疼痛和心理性疼痛综合征。
可以用本发明化合物和组合物治疗的物质使用障碍的实例非限制性地包括药物成瘾、药物滥用、药物习惯性、药物依赖性、戒断综合征和超剂量用药。
可以用本发明化合物和组合物治疗的癌症的实例非限制性地包括神经胶质瘤、黑素瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、小细胞肺癌、结肠直肠癌和其它实体肿瘤。
可以用本发明化合物和组合物治疗的心血管疾病的实例非限制性地包括心绞痛、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌病、高血压、动脉狭窄和静脉狭窄。
更具体而言，本发明化合物可用于治疗和预防哮喘、特应性皮炎、荨麻疹、肠易激综合征(IBS)或纤维变性疾病，包括但不限于硬皮病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、原发性肺高血压(PPH)、肺动脉高血压(PPAH)、特发性动脉高血压(IPAH)、肝纤维化、肾纤维化和心脏纤维化。
此外，本发明还提供式(1)、(2A)、(2B)或(2C)的化合物或其药物组合物任选地与第二种治疗剂联合用于制备治疗由c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6、SAPK2β、BRK、Fms、KDR、c-raf或b-raf激酶调节的疾病或情况的药物的用途；更具体而言，用于制备治疗由PDGFRα、PDGFRβ或c-kit调节的疾病或情况的药物的用途。
在上面使用本发明化合物的方法中，可以将式(1)、(2A)、(2B)或(2C)的化合物给药于一种包含细胞或组织的系统中。在另一些实施方案中，可以将式(1)、(2A)、(2B)或(2C)的化合物给药于人或动物主体。
定义 “烷基”是一种基团和作为其它基团例如卤代烷基和烷氧基的结构元素，并且可以是直链或支链的。本文所用的任选被取代的烷基、链烯基或炔基可以任选被卤化(例如，CF3)，或者其中一个或多个碳原子被杂原子，如NR、O或S取代或替代(例如，-OCH2CH2O-、烷基硫醇、硫代烷氧基、烷基胺等)。
“芳基”是指包含碳原子的单环或稠合的二环芳族环。例如，芳基可以是苯基或萘基。“亚芳基”是指由芳基衍生的二价基团。
本文所用的“杂芳基”是其中一个或多个环成员是杂原子的以上所定义的芳基。杂芳基的实例非限制性地包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并-咪唑基、嘧啶基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
本文所用的“碳环”是指包含碳原子的饱和或部分不饱和的单环、稠合的二环或桥连的多环，其可任选被取代，例如，被＝O取代。碳环的实例非限制性地包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙烯、环己酮等。
本文所用的“杂环”是其中一个或多个环碳是杂原子的以上所定义的碳环。例如，杂环可以包含N、O、S、-N＝、-S-、-S(O)、-S(O)2-或-NR-，其中R可以是氢、C1-4烷基或保护基团。杂环的实例非限制性地包括吗啉代、吡咯烷基、吡咯烷基-2-酮、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺环[4.5]癸-8-基等。
本文所用的任何取代基(例如CH2)中的H原子包括所有合适的同位素变体例如H、2H和3H。
除非另有说明，否则当一个取代基被认为是“任选被取代”时，是指该取代基可以被一个或多个各自独立地选自例如任选地被卤化的烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷基胺、烷硫基、炔基、酰胺、氨基(包括单-和二-取代的氨基)、芳基、芳氧基、芳硫基、羰基、碳环、氰基、环烷基、卤素、杂烷基、杂链烯基、杂炔基、杂芳基、杂环、羟基、异氰酰基、异硫氰酸根合、巯基、硝基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、全卤代烷基、全氟代烷基、甲硅烷基、磺酰基、硫代羰基、硫氰酸根合、三卤代甲磺酰基及其被保护的化合物的基团取代。可以形成以上取代基的被保护化合物的保护基团是本领域技术人员已知的并且可以在参考文献如Greene和Wuts，有机合成中的保护基团(Protective Groupsin Organic Synthesis)，第3版，John Wiley & Sons，纽约，NY，1999和Kocienski，保护基团(Protective Groups)，Thieme Verlag，纽约，NY，1994中找到，二者全部引入本文作为参考。
本文所用的术语“共同施用”或“联合施用”等意在包括向单一患者施用所选择的治疗剂，并且意在包括其中这些治疗剂不一定通过相同途径施用或同时施用的治疗方案。
本文所用的术语“药物组合”是指通过将活性成分混合或联合获得的产品，并且既包括活性成分的固定组合，又包括活性成分的非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分例如式(1)的化合物和共活性剂以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”是指活性成分，例如式(1)的化合物和共活性剂以独立实体的形式同时、并行或在没有特定时间限制的情况下相继给药于患者，其中这种施用方式在患者体内提供治疗有效水平的活性成分。后一种情况也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或多种活性成分。
术语“治疗有效量”是指将在细胞、组织、器官、系统、动物或人体内引起研究者、兽医、医生或其它临床医师所寻求的生物学或医学响应的主题化合物的量。
术语主题化合物的“给药”或“施用”是指为有需要的个体提供本发明的化合物或其前体药物。
除非本发明另有说明，选自于c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6、SAPK2β、BRK、Fms、KDR、c-raf和b-raf的激酶是指野生型和突变型(即与野生型相比具有单个或多个氨基酸变化)。
本发明的实施方式 本发明提供可用作蛋白激酶抑制剂的化合物及其药物组合物。
本发明的一方面提供式(1)化合物或其可药用盐
其中 1-4个X1、X2、X3、X4、X5和X6是N且其余的是CR3，且E环通过碳原子与NR、R2和R3连接； Ar是任选被取代的5-6元芳基或杂芳基，条件是Ar不是咪唑基； R1和R2独立的是C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基或羟基取代；或是卤素、氰基、硝基、(CR2)kOR7、(CR2)kO(CR2)1-4R7、(CR2)kSR7、(CR2)kNR9R10、(CR2)kC(O)O0-1R7、OC(O)R7、(CR2)kC(S)R7、(CR2)kC(O)NR9R10、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)kNRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR9R10、(CR2)kS(O)1-2R8、(CR2)kNRS(O)1-2R8或(CR2)kR6；或任意两个相邻的R2基团与其连接的原子一起可形成任选取代的5-8元碳环、杂环、芳基或杂芳基环； R3是-L-NR4R5、-X-NR-C(O)R8或-X-NR-C(O)NR4R5，其中L是-X-C(O)、-X-OC(O)、-SO0-2(CR2)j、(CR2)1-4、-O(CR2)1-4或
且X是(CR2)j或[C(R)(CR2OR)]； R4、R5、R9和R10独立的是H；C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6取代；或是(CR2)kCN、(CR2)1-6NR7R7、(CR2)1-6OR7、(CR2)kC(O)O0-1R7、(CR2)kC(O)NR7R7或(CR2)k-R6； R6是任选取代的C3-7环烷基、C6-10芳基或者5-10元杂芳基或5-7元杂环； R7和R8独立的是(CR2)k-R6或C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、酰胺基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6；或R7是H； 或者R4和R5与NR4R5中的N一起、R7和R7与NR7R7中的N一起或R9和R10与NR9R10中的N一起，可形成4-7元杂环，所述杂环任选被1-3个R11基团取代且任选含有NR12、O、S、＝O或双键； R11是R8、(CR2)k-OR7、CO2R7、(CR2)k-C(O)-(CR2)k-R8、(CR2)kC(O)NR7R7、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)kNRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR7R7、(CR2)kS(O)1-2R8或(CR2)kNRS(O)1-2R8； R12是H、R8、-(CR2)1-4CO2R7、(CR2)k-C(O)-(CR2)k-R8、(CR2)kC(O)NR7R7、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)1-4NRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR7R7、(CR2)kS(O)1-2R8或(CR2)kNRS(O)1-2R8； R是H或C1-6烷基； k是0-6； j和m独立的是0-4； 条件是Ar是苯基且X是(CR2)0时，-X-NR-C(O)R8中的R8不是苯基。
在一个实施方案中，本发明提供式(2A)、(2B)或(2C)的化合物
其中 R1是C1-6烷氧基或含有1-6个氟原子的卤代烷基； R2若存在则是C1-6烷基； R3是-L-NR4R5、-X-NR-C(O)R8或-X-NR-C(O)NR4R5； L是-X-C(O)； X是(CR2)j； R4和R5独立的是H；C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6取代；或R4和R5与N一起形成哌嗪基、吡咯烷基或哌啶基，其中每个基团都任选被＝O或1-2个R11基团取代； j是0； k是0-4； m是0-1；且 R、R6、R8和R11如式(1)中所定义。
在以上各式中，任何不对称碳原子可以以(R)-、(S)-或(R，S)-构型存在。因此所述化合物可以以异构体混合物或者纯异构体的形式存在，例如以纯对映体或非对映体的形式存在。本发明还包括本发明化合物的可能的互变异构体。
本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体或其可药用盐。本发明化合物的同位素变体或其可药用盐的定义是其中至少一个原子被具有相同原子数但原子量与自然界常见的原子量不同的原子所替代。本发明的化合物及其可药用盐可包含的同位素的实例包括但不限于氢、碳、氮和氧的同位素，例如2H、3H、11C、13C、14C、15N、17O、18O、35S、18F、36Cl和123I。本发明化合物的某些同位素变体及其可药用盐例如含有放射性同位素例如3H或14C的化合物及其可药用盐可用于药物和/或底物组织分布研究。
在具体实例中，由于制备简便、容易检测，可使用2H、3H和14C同位素。在其它实例中，用例如2H同位素取代可由于代谢稳定性增强获得某些治疗上的优势，例如半衰期加长或剂量要求减少。本发明化合物的同位素变体或其可药用盐通常可通过常规方法使用适当试剂的适当同位素变体制备。所述化合物的同位素变体有可能改变化合物的代谢情况和/或使物理性质例如疏水性等发生小的变化。同位素变体有可能加强功效和安全性，提高生物利用度和加长半衰期、改变蛋白质结合、改变生物分布、增加活性代谢物比例和/或减少反应性或毒性代谢物的形成。
在上述各式中，每个任选被取代的基团可被C1-6烷基、C2-6链烯基或C3-6炔基(其中每个基团都可以任选被卤素取代或任选有一个碳原子被N、S、O或其组合取代或替代(例如羟基C1-C8烷基、C1-C8烷氧基C1-C8烷基))；卤素、氨基、脒基、C1-6烷氧基；羟基、亚甲基二氧基、羧基；C1-8烷基羰基、C1-8烷氧基羰基、氨基甲酰基、C1-8烷基氨基甲酰基、磺酰氨基、氰基、氧代、硝基或任选被取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基取代，如前所述。
游离形式或可药用盐形式的式(1)、(2A)、(2B)或(2C)的化合物可表现有价值的药理学性质，例如，如本申请中的体外试验所述。这些实验中的IC50值是指与不含抑制剂的对照相比细胞计数降低50％时的受试化合物浓度。一般而言，本发明化合物的IC50值为1nM至10μM。在一些实例中，本发明化合物的IC50值为0.01μM至5μM。在其它实例中，本发明化合物的IC50值为0.01μM至1μM或更具体而言为1nM至1μM。在另一实例中，本发明化合物的IC50值低于1nM或高于10μM。在10μM下，本发明化合物对以下一种或多种激酶的抑制百分比可高于50％，或者在其它实施方案中，抑制百分比高于约70％c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6、SAPK2β、BRK、Fms、KDR、c-raf或b-raf激酶。
本发明的化合物还可以用于治疗激酶介导的疾病或情况，例如由c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6、SAPK2β、BRK、Fms、KDR、c-raf或b-raf激酶介导的疾病。
更具体而言，本发明化合物可用于治疗和预防哮喘、特应性皮炎、荨麻疹、肠易激综合征(IBS)或纤维变性疾病，包括但不限于硬皮病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、原发性肺高血压(PPH)、原发性肺动脉高血压(PPAH)、特发性动脉高血压(IPAH)、肝纤维化、肾纤维化和心脏纤维化。
药理和用途 针对激酶列表(野生型和/或其突变型)对本发明化合物进行筛查，本发明化合物可调节激酶列表中至少一个成员的活性。因此，本发明化合物可用于治疗其中激酶与疾病的病理和/或症状有关的疾病或病症。所述的可被本发明化合物和组合物抑制的以及本发明的方法对其有用的激酶包括但不限于c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6、SAPK2β、BRK、Fms、KDR、c-raf或b-raf激酶。
c-Kit 肥大细胞是衍生于表达CD34、c-kit和CD13抗原的造血干细胞的特定亚集的组织元素。肥大细胞的特征在于其异质性，其不仅组织定位和结构不均匀，而且在功能和组织化学水平方面也不均匀。未成熟的肥大细胞祖细胞在血流中循环并分化成各种组织。这些分化和增殖过程受细胞因子影响，其中一种重要的因子是干细胞因子(SCF)，也称为Kit配体、青灰因子或肥大细胞生长因子。该干细胞因子受体被原癌基因c-kit所编码，该基因在造血祖细胞、肥大细胞、胚细胞、Cajal的间质细胞(ICC)和一些人类肿瘤中进行表达并且也被非造血细胞表达。
酪氨酸激酶是受体型或非受体型蛋白，其将ATP的末端磷酸根转移给蛋白的酪氨酸残基，从而活化或灭活信号转导途径。该干细胞因子受体c-kit是一种III型跨膜受体蛋白酪氨酸激酶，其发动细胞生长和响应于SCF结合的增殖信号转导级联。SCF对c-kit受体的结合诱导其二聚化，然后诱导其转磷酸化(transphorylation)，从而导致各种胞浆内底物的募集和活化。这些被活化的底物诱导许多负责细胞增殖和活化的细胞内信号传导途径。已知在许多细胞机制中都涉及这些蛋白，这些细胞机制发生紊乱会导致一些病症如异常细胞增殖和迁移以及炎症。本发明的化合物可以抑制涉及SCF的细胞过程，如抑制SCF受体自磷酸化和SCF-刺激的MAPK激酶(促细胞分裂剂-活化的蛋白激酶)的活化。
在正常细胞中，c-kit受体蛋白酪氨酸激酶的活性受到调控，并且c-kit基因产物的正常功能活性对于正常造血作用、黑素生成、配子形成以及肥大细胞的生长和分化的维持都是很重要的。除其在正常细胞生理学活性中的重要性外，c-kit还在一些人类癌症的生物学方面起效，并且在人癌症的发病机理中和一些类型的肿瘤中涉及不受调节的c-kit激酶活性。由c-kit介导的肿瘤细胞生长的增殖可通过导致配体非依赖性活化的c-kit多肽的特定突变或通过该受体的自分泌刺激而发生。在前一种情况中，在人恶性癌症(包括干细胞肿瘤、肥大细胞肿瘤、胃肠道间质瘤、小细胞肺癌、黑素瘤、乳癌、急性骨髓性白血病、成神经细胞瘤和肥大细胞增多症)中涉及一些在缺乏SCF结合的情况下造成c-kit激酶活性的组成活化的突变。
患者组织中的肥大细胞参与或有助于一些疾病的发生，所述疾病如自身免疫性疾病(多发性硬化、类风湿性关节炎、炎性肠病(IBD))、过敏性疾病、肿瘤血管生成、炎性疾病和间质性膀胱炎。过敏性疾病包括过敏性鼻炎、过敏性鼻窦炎、过敏性综合征、荨麻疹、血管性水肿、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、结节性红斑、多形性红斑、皮肤坏死性静脉炎、昆虫叮咬皮肤炎症和哮喘。哮喘的特征在于气道阻塞、支气管高反应性和气道炎症，包括支气管哮喘和过敏性哮喘。
在这些疾病中，肥大细胞通过释放不同蛋白酶和介质如组胺、中性蛋白酶、脂质衍生的介质(前列腺素类、血栓烷类和白三烯类)和各种细胞因子(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-A、GM-CSF、MIP-LA、MIP-lb、MIP-2和IFN-y)的混合物来参与组织的破坏。肥大细胞活化诱导不同的效应器响应，如分泌过敏性介质、蛋白酶、趋化因子如MCP-1和RANTES、白三烯类、前列腺素和神经营养因子类；和诱导细胞因子基因转录(IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、TNFA和GM-CSF)。这些介质通过其对内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的作用和对细胞外基质的作用和通过募集其它炎症细胞而有助于产生哮喘表型。
如通过人源化抗-IgE单克隆抗体治疗所表明的那样，肥大细胞可能在哮喘中起一定的作用。抗-IgE治疗的原理是特异性靶向IgE，从而导致游离抗-IgE的灭活和阻止IgE的进一步产生。此外，因为IgE水平是IgE受体FceRI表达水平的主要调节剂，因此这一治疗的一个目标就是降低肥大细胞和嗜碱细胞上的FceRI表达，并因此降低这些细胞被活化的能力。已经在嗜碱细胞上证明了抗-IgE疗法降低FceRI表达的能力。嗜碱细胞上FceRI表达的降低与嗜碱细胞在活化时分泌介质的能力降低有关。
C-kit抑制剂也可用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病(NLDDM)，也称为II型糖尿病，是一种其中胰岛素不能有效促进细胞吸收葡萄糖，从而导致血糖水平增加的慢性疾病。全世界有约1亿人罹患此病，其中75％在确诊时也伴有肥胖。在多年中不能调节葡萄糖吸收导致形成II型糖尿病，并需要用药品来调节血糖水平。最后，未受调节的血糖水平造成血管、肾和眼睛损害以及心血管疾病。这种组织损害是造成糖尿病死亡率的原因。
此外，不同刺激如应激、创伤、感染以及神经递质对肥大细胞的活化也会加剧造成CNS病症的化学物质失衡。更具体地讲，肥大细胞的脱粒受常见的神经递质如神经降压素、生长抑素、P物质和乙酰胆碱的刺激，以及生长或存活因子，特别是如NGF、TGFβL的刺激。参与对该刺激的响应的肥大细胞可以是脑肥大细胞，但是也可以是在血流中释放其颗粒内含物(最终到达感觉、运动或脑神经元)的其它肥大细胞。脑肥大细胞染色类似CTMC染色，但是其表现出MMC的分泌模式，暗示其组成了肥大细胞呈递特异性的一个特定子集。
在肥大细胞活化后，被释放出来的颗粒释放各种能调节和改变神经传递和神经元存活的因子。因为在抑郁患者中已经观察到游离血清素水平的增加，因此在该类因子中，血清素很重要。或者，血清素的突释后可能是一段血清素不足的时期，从而导致疼痛和偏头痛。因此，认为肥大细胞以自分泌或旁分泌的方式加剧神经传递的失控。例如，焦虑或应激诱导的神经递质如血清素释放激活肥大细胞，肥大细胞又释放其颗粒内含物，从而进一步在脑中促进导致CNS病症的化学失衡。
肥大细胞释放的其它介质可分成作用于血管的神经递质、感受伤害的神经递质、促炎症反应的神经递质和其它神经递质。这些因子结合起来能诱导神经元(不管其是感觉神经元、运动神经元、还是CNS神经元)活性严重紊乱。此外，罹患肥大细胞增多症的患者比正常群体更容易形成CNS病症。可以用在c-kit受体中存在活化突变来解释这一点，这些突变诱导肥大细胞脱粒，诱导各因子突释，造成化学失衡和神经传递改变。
在一些情况中，活化的肥大细胞也可通过释放不同蛋白酶和介质的混合物来参与神经元组织的破坏，所述蛋白酶和介质可分成三组预先形成的颗粒相关介质(组胺、蛋白聚糖类和中性蛋白酶)、脂质衍生的介质(前列腺素类、血栓烷类和白三烯类)和各种细胞因子(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-A、GM-CSF、MIP-LA、MIP-lb、MIP-2和IFN-y)。活化的肥大细胞释放介质(TNF-A、组胺、白三烯类、前列腺素等)以及蛋白酶可以i)诱导炎症和血管舒张和ii)参与神经元组织破坏过程。c-kit活性的抑制降低细胞增生、耗竭引起疾病和/或情况的肥大细胞，从而表明可以用c-kit抑制剂来治疗c-kit依赖性疾病和/或情况，如CNS病症。
还确定肥大细胞参与或有助于药物依赖性和戒断症状。药物依赖性是一种被称为耐受性的现象和生理依赖性的结果，耐受现象需要增加药物的剂量以维持其完整的作用，生理依赖性是机体对药物的习惯性。当停止使用药物时，个体可能经历令人不愉快的戒断综合征。
不同药物(非限制性地包括水杨酸衍生物、吗啡衍生物、阿片样物质、海洛因、苯丙胺类、酒精、尼古丁、镇痛药、麻醉剂和抗焦虑药)对肥大细胞的活化导致肥大细胞脱粒，加剧造成药物习惯性和戒断综合征的化学失衡。在肥大细胞活化后，释放的颗粒释放出各种能调节和改变神经传递的因子。该类因子中有吗啡，其在肥大细胞颗粒中结合或储存。烟草烟雾也诱导犬科肥大细胞释放介质并调节导致哮喘的前列腺素的产生。此外，罹患肥大细胞增多症的患者比正常群体更容易形成物质使用障碍。这一点可以用在c-kit受体中存在活化突变来解释，这些突变诱导肥大细胞脱粒，诱导各因子突释，造成化学失衡和神经传递改变。
目前还没有治疗方法能够缓解和帮助个体由其成瘾的物质脱瘾。C-kit抑制剂可用于治疗物质滥用，特别是药物成瘾、药物滥用、药物习惯性、药物依赖性、戒断综合征和超剂量用药，其包括给需要该类治疗的人施用能耗竭肥大细胞的化合物。
c-Kit与PDGF受体和CSF-1受体(c-Fms)具有相当高的同源性。对各种红系细胞和骨髓细胞系进行的研究表明c-Kit基因在分化早期进行表达(Andre等人，Oncogene 198941047-1049)。某些肿瘤如成胶质细胞瘤细胞同样显著地表达c-Kit基因。
PDGF(血小板衍生生长因子) PDGF(血小板衍生生长因子)在正常生长中起重要作用，在病理学细胞增殖中也起重要作用。本发明的化合物可抑制PDGF受体(PDGFR)活性，因此适于治疗非恶性增生性病症例如硬皮病和其它纤维变性病症、动脉粥样硬化、血栓形成或银屑病。本发明的化合物还可用作抑制肿瘤的物质，例如用于小细胞肺癌、神经胶质瘤、肉瘤、前列腺肿瘤、以及结肠、乳房和卵巢的肿瘤。
在一个实施方案中，本发明的化合物可用于治疗和预防纤维变性病症或疾病、与细胞外基质组分在内部器官、包括肾脏、心脏、肺脏、肝脏、皮肤和关节中形成和沉积有关的情况。多项研究表明PDGFR在针对组织损伤的纤维化响应中发挥中心作用，例如 i)罹患特发性肺纤维化(IPF)的患者中肺泡巨噬细胞中PDGF上调； ii)肝星形细胞被激活成为肌成纤维细胞、即肝脏纤维化发展的中心步骤之后，PDGFRβ是首先被上调的基因之一； iii)在硬皮病中，PDGF及其受体显著上调，与此相似，肾纤维发生过程中PDGF上调； iv)损伤和/或促炎性细胞因子可诱导PDGF，或者以自分泌方式驱动肌成纤维细胞的增殖、分化和迁移。然后这些肌成纤维细胞分泌细胞外基质蛋白和胶原蛋白，导致疤痕形成和进行性器官损伤。TGFβ分泌在纤维形成过程中也显著导致胶原蛋白生成； v)PDGF-C转基因在小鼠中诱导肝纤维化，而PDGFRβ的可溶性显性失活型变体在大鼠中预防肝纤维化；和 vi)向肾脏施用PDGF-B在大鼠中促进肾纤维形成的迹象。
使用本发明化合物可治疗的纤维变性病症或疾病包括肺纤维化疾病例如肺纤维化(或间质性肺病或间质性肺纤维化)、特发性肺纤维化、原发性肺高血压、特发性肺动脉高血压、尘肺的纤维化元素(与暴露于环境危险因素有关，例如吸烟、石棉、棉绒、石尘、矿尘和其它颗粒)、肺结节病、纤维化肺泡炎、囊性纤维化的纤维化元素或增生性元素、慢性阻塞性肺病、成人呼吸窘迫综合征和肺气肿。本发明的化合物还可用于治疗和预防表现为肾脏(肾纤维化)、肝脏(肝纤维化)、心脏(心脏纤维化)、前列腺(例如良性前列腺增生(BPH))、胸膜(例如胸膜炎、胸膜纤维化)、胰腺、皮肤和/或肌肉组织纤维化肥大的疾病例如硬皮病、嗜酸性筋膜炎、与狼疮或盘状狼疮有关的盘状损伤或手术粘连。
使用本发明化合物可治疗的其它纤维变性病症或疾病包括但不限于系统性硬化症、混合结缔组织病、纤维发育不良、纤维囊肿病、结节病、肌炎(例如多发性肌炎、原发性特发性多发性肌炎、儿童多发性肌炎、皮肌炎、儿童皮肌炎、成人原发性特发性皮肌炎、内涵体肌炎、与恶性肿瘤有关的多发性肌炎或皮肌炎；表现为纤维化血管内膜增生的疾病例如血管炎(包括冠状动脉血管炎)、结节性多动脉炎或颞动脉炎；表现为神经组织纤维化增生的疾病例如脑硬化、环状硬化、弥漫性硬化和脑叶硬化；表现为肠壁纤维化增生或纤维化的疾病例如炎性肠病，包括克罗恩病。
此外，本发明的化合物还可用于保护干细胞，例如用于对抗化疗剂例如5-氟尿嘧啶的血液毒性；还可用于治疗哮喘和嗜酸粒细胞增多症。本发明化合物可特别用于治疗对PDGF受体激酶抑制产生响应的疾病。
本发明的化合物可在由移植例如同种异体移植导致的病症的治疗中表现出有用的作用，所述病症特别是组织排斥，如闭塞性细支气管炎(OB)，即同种异体肺移植物的慢性排斥。与未患OB的患者相反，患有OB的患者常常表现出支气管肺泡灌洗液中的PDGF浓度升高。
本发明的化合物还可有效对抗与血管平滑肌细胞迁移和增殖有关的疾病(在这些疾病中，PDGF和PDGFR也常常起一定作用)，如再狭窄和动脉粥样硬化。可以通过施用本发明的化合物在体外和体内证实对于血管平滑肌细胞增殖或迁移的这些作用及其后果，还可以通过研究其对体内机械损伤后血管内膜增厚的作用来证明这一点。
CSF1R(FMS) 由这种基因编码的蛋白是集落刺激因子1的受体，集落刺激因子1控制巨噬细胞的产生、分化和功能。CSFR1即使不是介导着集落刺激因子1的全部生物学作用，也介导着它的大部分生物学作用。其所编码的蛋白是酪氨酸激酶跨膜受体和酪氨酸-蛋白激酶CSF1/PDGF受体族的成员。已经表明该基因的突变与恶性骨髓瘤易感性有关。(见例如，Casas等人，Leuk.Lymphoma 2003，441935-41)。
Abl、Trk、Syk、Ras、Raf、MAPK、TGFβ、FGFR3、c-Src、SAPK、Lck、Fes、Csk Abelson酪氨酸激酶(即Abl，c-Abl)参与细胞周期的调节、对遗传毒性应激的细胞响应、和通过整联蛋白信号传导来传递关于细胞环境的信息。Abl蛋白似乎起作为细胞模块的复杂作用，该细胞模块整合来自各种细胞外和细胞内来源的信号并影响关于细胞周期和细胞凋亡的决定。Abelson酪氨酸激酶包括一些亚型衍生物如具有失调的酪氨酸激酶活性的嵌合体融合(癌蛋白)BCR-Abl或v-Abl。
融合蛋白BCR-Abl是融合Abl原癌基因与Bcr基因的相互易位的结果。然后，BCR-Abl能通过增加促有丝分裂活性来转化B-细胞。这种增加导致对细胞凋亡的敏感性降低并改变CML祖细胞的粘附和归巢。
BCR-Abl在95％的慢性髓细胞性白血病(CML)和10％的急性淋巴细胞性白血病的发病中都是重要的。STI-571(GLEEVEC
)是致癌的BCR-Abl酪氨酸激酶的抑制剂并且可用于治疗慢性髓细胞白血病(CML)。但是，在CML的急性发作阶段，一些患者由于BCR-Abl激酶的突变而耐受STI-571。迄今为止，已经报告了超过22种突变，如G250E、E255V、T315I、F317L和M351T。
本发明的化合物可抑制abl激酶，例如，v-abl激酶。本发明的化合物还可抑制野生型BCR-Abl激酶和BCR-Abl激酶的突变型，并且因此适用于治疗Bcr-abl-阳性的癌症和肿瘤疾病，如白血病(尤其是慢性髓细胞白血病和急性成淋巴细胞性白血病，其中尤其是发现了作用的细胞凋亡机理)。本发明的化合物也可有效对抗白血病干细胞，并且在将所述细胞取出(例如抽取骨髓)后，可将本发明的化合物用于这些细胞的体外纯化，并且一旦清除了这些细胞中的癌细胞，可将这些细胞再植入(例如，进行了纯化的骨髓细胞的再植入)。
神经营养因子受体的Trk族(trkA、trkB、trkC)促进神经元和非神经元组织的存活、生长和分化。TrkB蛋白表达于小肠和结肠的神经内分泌型细胞中、胰腺的α细胞中、淋巴结和脾脏的单核细胞和巨噬细胞中以及表皮颗粒层中(Shibayama and Koizumi，1996)。TrkB蛋白的表达与Wilms肿瘤和神经母细胞瘤的不良进展有关。此外，前列腺癌细胞表达TrkB但正常细胞不表达TrkB。Trk受体的信号传导途径下游涉及贯穿Shc、活化的Ras、ERK-1和ERK-2基因的MAPK活化的级联、和PLC-γ转导途径(Sugimoto等，2001)。
Syk是一种在肥大细胞脱粒和嗜曙红细胞活化中起重要作用的酪氨酸激酶。因此，Syk激酶参与许多过敏性病症，特别是哮喘。已经表明Syk通过N-末端SH2结构域与FcεR1受体被磷酸化的γ链结合，对于下游信号传导而言很重要。
Ras-Raf-MEK-ERK信号转导途径介导对生长信号的细胞响应。在约15％的人类癌症中，Ras突变成致癌形式。Raf族属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶并且包括三个成员——A-Raf、B-Raf和c-Raf(或Raf-1)。B-Raf在不需要活化的Ras等位基因的某些肿瘤的形成中有重要作用(Nature 417949-954(2002))。在很大百分比的恶性黑素瘤中已经探测到B-Raf突变。
现有的黑素瘤的医学治疗的效力有限，对于晚期黑素瘤而言尤其如此。本发明的化合物还抑制涉及b-Raf激酶的细胞过程，为治疗人类癌症，尤其是黑素瘤提供了新治疗机遇。
细胞分裂素-活化蛋白激酶(MAPK)是活化转录因子、翻译因子和对许多细胞外信号发生响应的其它目标分子的保守信号传导途径的成员。MAPK通过细胞分裂素-活化蛋白激酶激酶(MKK)在具有Thr-X-Tyr序列的双重磷酸化基序上磷酸化而被活化。在高级真核生物中，已经将MAPK信号传导的生理学作用与一些细胞事件如增殖、肿瘤生成、发展和分化联系起来。因此，调节通过这些途径(特别是通过MKK4和MKK6)的信号传导的能力使得可以开发出用于与MAPK信号传导有关的人类疾病如炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症的治疗和预防性疗法。
p38 MAPK的多重形式(α、β、γ、δ)(其各自由独立的基因编码)形成了参与许多刺激的细胞响应的激酶级联的一部分，所述刺激包括渗透性应激、UV线和细胞因子介导的事件。认为p38的这四种亚型调节细胞内信号传导的不同方面。它的活化是导致致炎细胞因子如TNFα的合成和产生的信号传导事件级联的一部分。P38通过磷酸化下游底物(包括其它激酶和转录因子)来发挥作用。已经表明抑制p38激酶的活性剂阻断了细胞因子(非限制性地包括TNFα、IL-6、IL-8和IL-1β)的产生。
当在体外用脂多糖(LPS)进行刺激时，已证实外周血单核细胞(PBMC)表达和分泌致炎细胞因子。当在用LPS刺激前用该化合物预处理PBMC时，P38抑制剂有效地阻断了这种作用。P38抑制剂在炎性疾病的动物模型中有效。许多疾病状态的破坏性作用都是由致炎细胞因子的过度产生造成的。p38抑制剂调节这种过度产生的能力使其可用作疾病改善剂。
已经表明阻断p38功能的分子可有效抑制骨再吸收、炎症以及其它基于免疫和炎症的疾病。因此，安全和有效的p38抑制剂将提供一种治疗方法，可以用该方法来治疗可通过调节p38信号传导来进行控制的使人虚弱的疾病。因此，抑制p38活性的本发明的化合物可用于治疗炎症、骨关节炎、类风湿性关节炎、癌症、自身免疫性疾病和用于治疗其它细胞因子介导的疾病。
转化生长因子-β(TGFβ)表示一种包括例如GFβ1、TGFβ2和TGFβ3的蛋白的超家族，其是细胞生长和分化、胚胎和骨发育、细胞外基质形成、血细胞生成、免疫和炎性响应的多效调节剂。TGFβ族的成员引发一些细胞内信号传导途径，这些信号传导途径最终导致一些基因的表达，这些基因调节细胞周期、控制增殖响应或与介导细胞外信号内传、细胞粘附、迁移和细胞间通讯的细胞外基质蛋白有关。
因此，作为TGFβ细胞内信号传导途径抑制剂的本发明化合物是纤维增生性疾病的有用治疗剂，所述疾病包括与TGFβ活性失调有关的肾病症和过度纤维化，包括肾小球肾炎(GN)，如肾小球系膜增殖性GN、免疫性GN和新月体性GN。另一些肾情况包括糖尿病性肾病、肾间质纤维化、接受环孢菌素的移植患者的肾纤维化和与HIV有关的肾病。胶原血管病症包括进行性全身性硬化症、多发性肌炎、硬皮病、皮肌炎、嗜曙红细胞筋膜炎、局限性硬皮病或那些与雷诺氏综合征的发生有关的疾病。由TGFβ活性过度造成的肺纤维化包括成人呼吸窘迫综合征、COPD、特发性肺纤维化和常常与自身免疫性病症如全身性红斑狼疮和硬皮病、化学品接触或变态反应有关的间质性肺纤维化。另一种伴有纤维增殖特性的自身免疫性病症是类风湿性关节炎。纤维增殖性情况可能与眼睛手术操作有关。这些操作包括伴有增殖性玻璃体视网膜病的视网膜复置术、伴有人工晶状体植入的白内障摘除术和青光眼后的引流术。
已证实成纤维细胞生长因子受体3对骨生长发挥负调节作用并对软骨细胞增殖发挥抑制作用。致死性骨发育不全是由成纤维细胞生长因子受体3的不同突变造成的。一种突变——TDII FGFR3具有活化转录因子Stat1的组成酪氨酸激酶活性，从而导致了细胞周期抑制剂的表达、生长抑制和骨发育异常(Su等人，Nature 1997，386288-292)。FGFR3也常常在多发性骨髓瘤型癌症中表达。
激酶c-Src传递许多受体的致癌信号。例如，EGFR或HER2/neu在肿瘤中的过表达导致了c-src的组成活化，其是恶性细胞的特征，正常细胞并不具有该特征。另一方面，c-src表达不足的小鼠表现出一种骨硬化表型，表明c-src在破骨细胞功能中起关键作用并且可能在相关病症中被涉及。
人核蛋白体S6蛋白激酶族由至少8个成员(RSK1、RSK2、RSK3、RSK4、MSK1、MSK2、p70S6K和p70S6Kb)组成。核蛋白体蛋白S6蛋白激酶发挥重要的多效性功能，其中，一种关键作用是在蛋白生物合成期间调节mRNA翻译(Eur.J.Biochem 2000，267(21)6321-30；Exp Cell Res.1999，253(1)100-9；Mol Cell Endocrinol.1999，151(1-2)65-77)。已经表明在细胞活力的调节(Immunol.Cell Biol.2000，78(4)447-51)和细胞生长(Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.2000，65101-27)中涉及p70S6对S6核蛋白体蛋白的磷酸化，因此，其在肿瘤转移、免疫应答和组织修复以及其它一些疾病情况中可能很重要。
SAPK′s(也被称为“jun N-末端激酶”或“JNK′s”)是代表了一些信号传导途径中的次末级步骤的蛋白激酶族，所述信号传导途径导致了c-jun转录因子的活化和c-jun调节的基因的表达。具体地讲，c-jun参与基因的转录，所述基因编码因遗传毒性损伤而被损害的DNA的修复中所涉及的蛋白。抑制细胞中SAPK活性的物质阻止了DNA修复并使细胞对那些通过诱导DNA损害来起作用的癌症治疗药物敏感。
Lck在T-细胞信号传导中起作用。缺乏Lck基因的小鼠形成胸腺细胞的能力差。Lck作为T-细胞信号传导的正性活化剂的功能表明Lck抑制剂可以用于治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎。
Fes在骨髓造血细胞中强烈表达并参与骨髓粒细胞的分化和存活信号传导途径。在癌症，特别是结肠直肠癌和乳癌中涉及CSK。
根据前述，本发明进一步提供了一种预防或治疗需要该类治疗的个体的任何上述疾病或病症的方法，该方法包括给所述个体施用治疗有效量(参见下文的“给药和药物组合物”)的式(1)、(2A)、(2B)或(C)的化合物或其可药用的盐。对于任何上面的应用而言，所需剂量将根据给药方式、所治疗的特定情况和所需作用来进行变化。
施用和药物组合物 本文所用的药物组合物是指本发明的化合物与其它化学组分例如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。药物组合物有利于化合物向有机体的施用。含有本发明化合物的药物组合物可以以治疗有效量的药物组合物形式、以本领域已知的常规形式和途径施用，包括但不限于静脉内、口服、经直肠、气雾剂、非胃肠途径、经眼、经肺、透皮、经阴道、经耳、经鼻和局部施用。
化合物可以以局部方式施用，而不以系统方式施用。例如通常以缓释制剂或持续释放制剂的形式将化合物直接注射至器官内。此外，含有本发明化合物的药物组合物可以在靶向药物递送系统中施用，例如在用器官特异性抗体包衣的脂质体中递送。所述脂质体将靶向所述器官并被该器官选择性摄取。此外，含有本发明化合物的药物组合物可以以快速释放制剂、延时释放制剂或即时释放制剂的形式提供。
对于口服施用，本发明化合物可以通过将活性化合物与本领域熟知的可药用载体或赋形剂混合而容易地进行配制。这种载体使本文所述化合物可配制成片剂、散剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体剂型、凝胶剂、糖浆剂、酏剂、浆剂、混悬剂等供待治疗患者口服服用。
可通过将一种或多种固体赋形剂与一种或多种本文描述的化合物混合来制备口服药物制剂，任选将所得混合物研磨，并在需要时在加入合适的辅剂之后将颗粒混合物加工成片剂或糖衣片芯。合适的赋形剂具体而言有填充剂例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄耆胶、甲基纤维素、微晶纤维素、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠；或其它赋形剂例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮)或磷酸钙。若期望，可加入崩解剂例如交联纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或其盐例如藻酸钠。
可为糖衣片芯提供合适的包衣。为此，可使用浓糖溶液，其中可任选含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。片剂或糖衣片剂包衣中可加入染料物质或色素用于鉴别或标记不同活性化合物剂量的组合。
可口服的药物制剂包括用明胶制备的推合胶囊以及用明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制备的密封软胶囊。推合胶囊可含有活性成分与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，活性化合物可以溶解于或混悬于合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，还可以加入稳定剂。
对于口腔或舌下施用，所述组合物可以是根据常规方法制备的片剂、锭剂或凝胶剂。非胃肠途径注射剂可包括推注或连续输注。本发明化合物的药物组合物可以是适合于非胃肠途径注射的形式，是无菌混悬剂、溶液剂或以油或水为载体的乳剂形式，并且可以含有配方佐剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。用于非胃肠途径施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，还可以将活性化合物制备为适当的油性注射用混悬剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。水性注射用混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。所述混悬剂还任选含有合适的稳定剂或允许制备高浓度溶液的增加化合物溶解度的活性剂。或者，活性成分可以是用于在临用前溶解于合适的载体例如无菌无热源的水中的粉末形式。
本发明的化合物可以局部施用，可以制备为各种可供局部施用的组合物例如溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂、含药条剂(medicated stick)、膏剂(balm)、乳膏剂或软膏剂。这种药用复合物可含有助溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
适用于透皮施用的制剂可利用透皮递送装置和透皮递送贴剂，可以是亲脂性乳剂或缓冲的水溶液、可以溶解于和/或分散于聚合物或粘合剂中。这种贴剂可以设计为连续递送、脉冲递送或按需递送药物活性剂。本发明化合物的透皮递送还可以通过离子导入贴剂等实现。此外，透皮贴剂可以以可控的方式递送本发明的化合物。可以使用速控膜或者将化合物包封在聚合物基质或凝胶中使吸收速率减慢。相反，也可以使用吸收促进剂加强吸收。吸收促进剂或载体可包含可吸收的可药用溶剂以辅助药物穿过皮肤。例如绷带形式的透皮装置，其包含背衬组件(backing member)、含有化合物并任选含有载体的储药库、任选含有以预定速率在较长一段时间内将化合物递送至宿主皮肤的速控屏障，以及将装置固定于皮肤的工具。
对于吸入施用，本发明的化合物可以是气溶胶、气雾剂或粉末形式。本发明化合物的药物组合物可以方便地以气溶胶喷雾剂形式递送，所述气溶胶喷雾剂可以装在压力容器或雾化器中，使用合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在压力气溶胶的情况下，剂量单位可以通过阀门进行确定以递送计量量。例如，以胶囊剂和药筒为例，用于吸入器或吹药器的明胶可以制备为含有所述化合物与适当粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本发明化合物还可以制备为直肠组合物例如灌肠剂、直肠凝胶剂、直肠泡沫剂、直肠气溶胶、栓剂、凝胶栓剂(jelly suppository)或保留灌肠剂(retention enema)，其中含有常规的栓剂基质例如可可脂或其它甘油酯以及合成聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮、PEG等。在组合物的栓剂形式中，低熔点蜡例如但不限于脂肪酸甘油酯任选与可可脂的混合物首先被熔化。
可以根据常规方式用一种或多种生理学可接受的载体制备药物组合物，其中包括可帮助将活性化合物加工为可药用制剂的赋形剂和辅剂。所选择的施用途径决定适当的剂型。任何熟知的技术、载体和赋形剂都可以根据现有技术中的理解适当的使用。含有本发明化合物的药物组合物可以根据常规方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包囊、包封或压制过程制备。
药物组合物将包含至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂和游离酸、游离碱或可药用盐形式的本文所述的式(1)、(2A)或(2B)的化合物作为活性成分。此外，本文所述的方法和药物组合物包括使用这些化合物的具有同类活性的N-氧化物、晶型(也称为多晶型物)和活性代谢物。在有些情况下，化合物可以以互变异构体存在。所有互变异构体均包括在本文所述的化合物范围之内。此外，本文所述的化合物可以以非溶剂化的形式或与可药用溶剂例如水、乙醇等的溶剂化物的形式存在。本文所述的化合物的溶剂化物形式也包括在本文公开内容范围之内。此外，药物组合物还可包括其它医学或药学活性剂、载体、辅剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，药物组合物还可含有其它有治疗价值的物质。
含有本文所述化合物的组合物的制备方法包括将化合物与一种或多种惰性的可药用赋形剂或载体一起制备为固体、半固体或液体形式。固体组合物包括但不限于散剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。液体组合物包括其中溶解有化合物的溶液剂、含有化合物的乳剂、含有包含本文公开化合物的脂质体、胶团或纳米粒子的溶液剂。半固体组合物包括但不限于凝胶剂、混悬剂和乳膏剂。组合物可以是液体溶液剂或混悬剂形式、适合于在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式或乳剂形式。这些组合物还可以含有少量无毒的辅剂，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等。
本文所述药物组合物的概述可在例如RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，19版，(Easton，Pa.Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.，Eds.，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，(Lippincott Williams & Wilkins 1999)中找到，其全部内容都引入本文作为参考。
施用方法和治疗方法 含有本文所述化合物的组合物可用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，将所述组合物以足够治疗的量或至少部分停止所述疾病或情况的症状的量施用于已罹患疾病或情况的患者。认为本领域技术人员完全能够通过常规实验(包括但不限于剂量递增临床试验)确定这种治疗有效量。
本发明的化合物可以与第二种治疗活性剂联合使用。例如，如果患者接受本文化合物之一后的副作用之一是炎症，那么本发明化合物可以与抗炎药联合施用。本文所述化合物的治疗有效性也可通过施用佐剂来提高。当本发明化合物与其它疗法联合施用时，共同施用化合物的剂量将取决于共同施用药物的类型、所使用的具体药物、被治疗的疾病或情况等。此外，当与一种或多种生物学活性剂共同施用时，本发明化合物可以与所述的生物学活性剂同时或相继施用。本发明化合物与第二种治疗活性剂的联合施用可能产生加合或协同效果。
在一些实例中，本发明化合物可以与抗纤维化药物例如干扰或调节纤维变性疾病进程的活性剂联合使用，所述疾病例如硬皮病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、原发性肺高血压(PPH)、原发性肺动脉高血压(PPAH)、特发性动脉高血压(IPAH)、肝纤维化、肾纤维化和心脏纤维化。可以与本发明化合物联合使用的抗纤维化药物包括但不限于吡非尼酮(Nakazoto等，Eur.J.Pharmacol.446177-185(2002)、他克莫司(Nagano等，Eur.Respir.J.27460-469(2006)或5-氯-2-{(1E)-3-[2-(4-甲氧基苯甲酰基)-4-甲基-1H-吡咯-1-基]丙-1-烯-1-基}-N-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(SMP-534)(Sugaru等，Am.J.Nephrology 2650-58(2006))。本发明化合物还可以与抗炎剂联合使用，所述抗炎剂包括但不限于皮质类固醇、色甘酸钠、白三烯拮抗剂、IgE阻滞剂例如Omalizumab。在其它实例中，本发明化合物可以与治疗哮喘的药物联合使用，例如支气管扩张药例如β2-激动剂、黄嘌呤(例如甲基黄嘌呤)和抗胆碱药；以及上述的抗炎药。
本发明化合物还可以与化疗剂联合使用来治疗细胞增殖性病症，包括但不限于淋巴瘤、骨肉瘤、黑素瘤或乳腺癌、肾癌、前列腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、神经癌、肺癌、子宫癌或胃肠道癌。可以用于本发明的组合物和方法的化疗剂的实例包括但不限于蒽环类、烷化剂类(例如丝裂霉素C)、烷基磺酸酯类、吖丙啶类、乙烯亚胺类、甲基三聚氰胺类、氮芥类、亚硝基脲类、抗生素类、抗代谢物类、叶酸类似物(二氢叶酸还原酶抑制剂例如甲氨蝶呤)、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素类、含铂活性剂、干扰素和白介素。可用于本发明组合物和方法的已知化疗剂的具体实例包括但不限于白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三甲醇三聚氰胺、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、氧化甲二氯二乙胺盐酸盐、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥胆甾醇酯(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司丁、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、阿克拉霉素、放线菌素F(1)、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、Carzinophilin、色霉素、更生霉素、柔红霉素、红比霉素、6-重氮-5-氧代-1-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、普卡霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、链黑菌素、链唑霉素、结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、Denopterin、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟脲嘧啶脱氧核苷、氟尿嘧啶、替加氟、L-门冬酰胺酶、链道酶、醋葡醛内酯、醛磷酰胺苷、氨基酮戊酸、安吖啶、Bestrabucil、比生群、卡铂、顺铂、Defofamide、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、依托格鲁、依托泊苷、氟他胺、硝酸镓、羟脲、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、香菇多糖、氯尼达明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、硝氨丙吖啶、喷司他丁、Phenamet、吡柔比星、鬼臼酸2-乙肼、丙卡巴肼、雷佐生、西佐喃、锗螺胺、紫杉醇、他莫昔芬、替尼泊苷、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2，2′，2″-三氯三乙胺、乌拉坦、长春碱、长春新碱和长春地辛。
本发明的化合物通常通过本领域已知的任何常规和可接受的方式、单独地或与一种或多种治疗药物组合来以治疗有效量进行给药。治疗有效量可随疾病的严重程度、个体的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力和其它因素而在宽范围内进行变化。一般以每日每公斤体重约0.03至2.5mg的日剂量系统给药通常可获得满意结果。对于大型哺乳动物例如人而言，每日推荐剂量为约0.5mg至约100mg，例如方便地以每日最多4次的分次剂量或以缓释剂型进行给药。口服给药的适宜单位剂型包含大约1至50mg活性成分。
这种治疗方案的毒性和治疗效果可通过标准药学程序通过细胞培养或实验动物确定，包括但不限于确定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％取得治疗效果的剂量)。毒性剂量与取得治疗效果剂量之间的比例为治疗指数，其可以表达为LD50与ED50的比例。细胞培养实验和动物实验获得的数据可用于确定人类使用的剂量范围。化合物的剂量优选使循环中药物浓度包含ED50同时使毒性最低。取决于使用的剂型和施用途径，剂量可在该范围内浮动。
制备本发明化合物的方法 在下文的实施例中描述了制备本发明化合物的一般操作。在所述反应中，可能有必要保护在终产物中所需的反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、巯基或羧基，以避免它们不必要地参与反应。可按照标准操作使用常规的保护基团，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“有机化学中的保护基团(Protective Groups in Organic Chemistry)”，John Wiley和Sons，1991。
可通过将游离碱形式的化合物与可药用的无机或有机酸反应来将本发明化合物制备为可药用酸加成盐的形式。或者，可通过将游离酸形式的化合物与可药用的无机或有机碱反应来制备本发明化合物的可药用的碱加成盐。或者，盐形式的本发明化合物可利用起始材料或中间体的盐来进行制备。
游离酸或游离碱形式的本发明化合物可分别从相应的碱加成盐或酸加成盐制备。例如可通过用合适的碱(例如，氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)进行处理来将酸加成盐形式的本发明化合物转化为相应的游离碱。可通过用合适的酸(例如，盐酸等)进行处理来将碱加成盐形式的本发明化合物转化为相应的游离酸。
非氧化形式的本发明化合物可通过在适宜的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二恶烷水溶液等)中，于0至80℃下，用还原剂(例如，硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化磷等)处理本发明化合物的N-氧化物而制备。
本发明化合物的前药衍生物可用本领域普通技术人员已知的方法(例如，详情见Saulnier等人(1994)，Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters，第4卷，第1985页)来进行制备。例如，合适的前药可通过将未衍生化的本发明化合物与适宜的氨基甲酰化试剂(例如，1，1-酰氧基烷基羰基氯(carbanochloridate)、对硝基苯基碳酸酯等)反应来制备。
本发明化合物的被保护衍生物可用本领域普通技术人员已知的方法进行制备。用于产生保护基团和除去保护基团的技术的详细描述可见于T.W.Greene，“有机化学中的保护基团(Protecting Groups in OrganicChemistry)”，第3版，John Wiley和Sons，Inc.，1999。
在本发明化合物的制备过程中，本发明化合物可方便地被制备为或形成溶剂化物(例如水合物)。本发明化合物的水合物可通过采用有机溶剂如二恶英、四氢呋喃或甲醇，在水/有机溶剂混合物中重结晶来方便地制备。
本发明化合物可通过将化合物的外消旋混合物与光学活性的拆分剂反应以形成一对非对映异构体化合物、分离非对映异构体并回收光学纯的对映异构体来制备其单个的立体异构体。对映异构体的拆分可利用本发明化合物的共价非对映异构体衍生物来进行，或者可以用易于解离的复合物(例如，结晶的非对映异构体盐)来进行。非对映异构体具有不同的物理性质(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性等)并且可以很容易地利用这些差异进行分离。非对映异构体可以通过色谱法分离，或者可以通过基于溶解度差异的分离/拆分技术进行分离。然后通过任何不会导致消旋化的操作方法回收光学纯的对映异构体与拆分剂。用于从外消旋混合物中拆分化合物的立体异构体的技术的更详细描述可见于Jean Jacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“对映异构体，外消旋体和拆分(Enantiomers，Racemates andResolutions)”，John Wiley And Sons，Inc.，1981。
总之，式(1)、(2A)、(2B)或(2C)的化合物可通过下述方法制备，其包括 (a)下面实施例中所述的一般操作；和 (b)任选地将本发明化合物转化为可药用盐； (c)任选地将盐形式的本发明化合物转化为非盐形式； (d)任选地将非氧化形式的本发明化合物转化为可药用的N-氧化物； (e)任选地将N-氧化物形式的本发明化合物转化为其非氧化物形式； (f)任选地从异构体混合物拆分本发明化合物的单个异构体； (g)任选地将未衍生化的本发明化合物转化为可药用的前药衍生物；和 (h)任选地将本发明化合物的前药衍生物转化为其未衍生化的形式。
只要没有对起始材料的制备进行特别描述，则该化合物是已知的或者可以用与本领域已知的方法或下文实施例中所公开的方法类似的方法来进行制备。本领域技术人员将意识到，下面的实施例仅仅是本发明化合物制备方法的代表，也可以类似地使用其它众所周知的方法。
以下实施例用于举例说明但不限制本发明。
中间体的制备 5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-甲酸5
将5-氨基-吡啶-2-甲酸1(5.4mmol)溶解于苯∶MeOH＝3∶1(40mL)中，在冰浴中降温至0℃。向该溶液中缓缓加入2M TMSCH2N2在Et2O中的溶液(6.5mmol)。加入完毕后，将反应混合物温至室温，搅拌6小时。真空除去溶剂后，得到5-氨基吡啶甲酸甲酯2，其未经纯化即用于下步。MS(m/z)(M+1)+153.1。
向小瓶中加入5-氨基吡啶甲酸甲酯2(0.83mmol)、2-氯-5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶3(0.83mmol)、Pd(OAc)2(0.124mmol)、Xanthphos(0.124mmol)、Cs2CO3(0.83mmol)和无水1，4-二恶烷(5mL)。排空小瓶中气体，重新用氮气填充两次，将混合物在微波炉中在130℃下加热20分钟。将小瓶冷却至室温，用DCM稀释反应混合物，用10％NH4Cl溶液、盐水洗涤并用Na2SO4干燥。真空除去溶剂，粗产物用EtOAc研磨得到5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-甲酸甲酯4，为淡棕色固体。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.62(s，1H)，8.93(s，2H)，8.83(bs，1H)，8.46(d，J＝8.0Hz，1H)，8.27(d，J＝8.0Hz，1H)，7.72-7.70(m，2H)，7.08-7.06(m，2H)，3.86(s，3H)，3.81(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+337.1。
向5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-甲酸甲酯4(0.3mmol)在THF∶MeOH∶H2O＝3∶2∶1(5mL)中的混悬液中加入6M LiOH(1.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。然后真空除去溶剂，残余物用水(6mL)稀释，用6M HCl中和pH。收集沉淀的固体，用水洗涤，用真空烘箱干燥12小时得到5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-甲酸5，为黄色固体，其未经纯化即用于下步。MS(m/z)(M+1)+323.2。
5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-烟酸10
向2-甲基-5-硝基-烟酸乙酯7(1.43mmol)在MeOH(15mL)中的溶液中加入Pd(5％碳钯，50％湿润；10％重量)。除气后，将反应混合物在氢气气氛中搅拌3小时。将溶剂滤过硅藻土，用甲醇洗涤硅藻土滤饼。真空除去溶剂得到5-氨基-2-甲基-烟酸乙酯8，为黄色固体，其未经纯化即用于下步。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ7.19(d，J＝4.0Hz，1H)，6.78(d，J＝4.0Hz，2H)，4.10(s，2H)，3.56(q，J＝8.0Hz，2H)，1.80(s，3H)，0.59(t，J＝8.0Hz，3H)。MS(m/z)(M+1)+182.0。
向小瓶中加入5-氨基-2-甲基-烟酸乙酯8(1.25mmol)、2-氯-5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶3(1.25mmol)、Pd(OAc)2(0.187mmol)、Xanthphos(0.187mmol)、Cs2CO3(1.25mmol)和无水1，4-二恶烷(8mL)。排空小瓶中气体，重新用氮气填充两次，将混合物在油浴中在100℃下加热2小时。将小瓶冷却至室温，用DCM稀释反应混合物，用10％NH4Cl溶液、盐水洗涤并用Na2SO4干燥。真空除去溶剂，粗产物用短硅胶色谱法纯化，用DCM∶MeCN∶MeOH＝8∶2.5∶0.5洗脱，得到5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-烟酸乙酯9，为淡黄色固体。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.13(s，1H)，9.10(d，J＝4.0Hz，1H)，8.94(s，2H)，8.78(d，J＝4.0Hz，1H)，7.79-7.77(m，2H)，7.16-7.14(m，2H)，4.45(q，J＝8.0Hz，2H)，3.90(s，3H)，2.75(s，3H)，1.45(t，J＝8.0Hz，3H)。MS(m/z)(M+1)+365.1。
向5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-烟酸乙酯9(0.9mmol)在THF∶MeOH∶H2O＝3∶2∶1(7mL)中的混悬液中加入6M LiOH(2.7mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。然后真空除去溶剂，残余物用水(6mL)稀释，用6M HCl中和pH。收集沉淀的固体，用水洗涤，用真空烘箱干燥12小时得到5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-烟酸10，为灰白色固体，其未经纯化即用于下步。MS(m/z)(M+1)+337.2。
N-5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-2-甲基-吡啶-3，5-二胺12
向5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-烟酸10(0.59mmol)在无水tBuOH(15mL)中的混悬液中加入TEA(8.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后滴入DPPA(8.3mmol)。加入完毕后，回流4小时。然后减压除去溶剂，粘稠油状残余物经制备型HPLC纯化(MeCN梯度20-90％)得到{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-吡啶-3-基}-氨基甲酸叔丁酯11。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.22(bs，1H)9.17(bs，1H)，8.87(s，2H)，8.50(bs，1H)，7.70-7.68(m，2H)，7.07-7.05(m，2H)，3.81(s，3H)，2.46(s，3H)，1.58(s，9H)。MS(m/z)(M+1)+408.1。
将{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-吡啶-3-基}-氨基甲酸叔丁酯11(0.33mmol)溶于DCM(2mL)并用TFA(3mL)处理。将反应混合物在室温下搅拌2小时。除去溶剂得到灰白色固体残余物。向残余物中加入水，用5％Na2CO3中和pH，用DCM∶IPA＝3∶1(3x40mL)萃取。有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥。减压除去有机溶剂得到N-5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-2-甲基-吡啶-3，5-二胺12，其未经纯化即用于下步。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.37(s，1H)，8.90(s，2H)，8.47(bs，1H)，7.79(bs，1H)，7.71-7.69(m，2H)，7.08-7.06(m，2H)，6.36(bs，2H)，3.81(s，3H)，2.43(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+308.2。
2-氯-5-(4-(二氟甲氧基)苯基)嘧啶17
将溴-4-(二氟甲氧基)苯13(10mmol)、醋酸钾(30.0mmol)、4，4，5，5-四甲基-2-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷14(11.0mmol)和Pd(PPh3)4(0.5mmol)加至装有搅拌棒的40-mLSchlenk烧瓶中。排空烧瓶中气体，重新用氮气填充数次。用注射器加入1，4-二恶烷(10mL)。将Schlenk烧瓶密封，在微波炉中在150℃下加热20分钟。反应结束后，真空除去溶剂。将残余物溶于DCM(200mL)，用水洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到粗产物。经硅胶柱色谱法纯化(EtOAc、己烷梯度0-20％)得到2-(4-(二氟甲氧基)苯基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷15。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.74(d，J＝8.4Hz，2H)，7.02(d，J＝8.4Hz，2H)，6.48(t，J＝73.6Hz，1H)，1.27(s，12H)。MS(m/z)(M+1)+271.1。
向5-溴-2-氯嘧啶16(7.7mmol)在1，4-二恶烷(1.5mL)中的溶液中加入2-(4-(二氟甲氧基)苯基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷15(8.9mmol)、1.8M K2CO3(16.2mmol)和Pd(PPh3)4(0.38mmol)。排空烧瓶中气体，重新用氮气填充两次，然后在微波炉中在150℃下加热10分钟。然后将反应混合物用NH4Cl溶液稀释，用DCM萃取(3x50mL)。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩。经短硅胶柱色谱法纯化，使用己烷∶EtOAc＝3∶1作为洗脱剂，得到2-氯-5-(4-(二氟甲氧基)苯基)嘧啶17。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.73(s，2H)，7.47-7.52(m，2H)，7.20-7.24(m，2H)，6.52(t，J＝72Hz，1H)。MS(m/z)(M+1)+257.0。
终产物的制备 A型化合物
{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-基}-哌嗪-1-基-甲酮A1
在室温下，向5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-甲酸5(0.12mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中加入HATU(0.13mmol)和DIEA(0.36mmol)。将所得混合物搅拌2分钟，然后加入哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.12mmol)在DMF(1mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时，直接经制备型LCMS纯化得到4-{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-羰基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯6，为白色固体。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.32(s，1H)，8.89(s，2H)，8.39-8.37(m.，2H)，7.86(dd，J＝4.0和8.0Hz，1H)，7.71-7.69(m，2H)，7.08-7.06(m，2H)，3.81(s，3H)，3.55-3.51(bm，4H)，3.96-3.94(bs，4H)，1.42(s，9H)。MS(m/z)(M+1)+491.1。
将4-{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-羰基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯6(0.03mmol)溶解于DCM(2mL)，用TFA(2mL)处理。将反应混合物在室温下搅拌2小时。除去溶剂得到灰白色固体残余物，用EtOAc洗涤数次得到期望的5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-基}-哌嗪-1-基-甲酮A1，为白色固体。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.30(s，1H)，9.13(bs，2H)，8.98(d，J＝4.0Hz，2H)，8.88(s，1H)，8.43(dd，J＝4.0和8.0Hz，1H)，7.73(d，J＝8.0Hz，1H)，7.71-7.69(m，2H)，7.08-7.06(m，2H)，3.81(s，3H)，3.73(bs，4H)，3.20(bs，4H)。MS(m/z)(M+1)+391.1。
4-{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-羰基}-哌嗪-2-酮A2
在室温下，向5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-甲酸5(0.05mmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入HATU(0.06mmol)和DIEA(0.14mmol)。将所得混合物搅拌2分钟，然后加入哌嗪-2-酮(0.05mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h，然后直接经制备型LCMS纯化得到4-{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-羰基}-哌嗪-2-酮A2，为白色固体。1HNMR(400MHz，d4-CH3OH)δ8.98(d，J＝4.0Hz，1H)，8.77(s，1H)，8.53-8.52(m，，2H)，7.74-7.73(m，2H)，7.58-7.56(m，2H)，7.07-7.05(m，2H)，3.94(bs，2H)，3.81(s，3H)，3.46(bs，2H)，3.45(bs，2H)。MS(m/z)(M+1)+405.2。
(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基)-{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-吡啶-2-基}-甲酮A4
根据关于A2所述的制备方法制备。1H NMR(400MHz，d4-CH3OH)δ9.00(d，J＝4.0Hz，1H)，8.77(s，2H)，8.52(dd，J＝4.0和8.0Hz，1H)，7.68(d，J＝8.0Hz，1H)，7.59-7.57(m，2H)，7.08-7.06(m，2H)，3.90(bs，4H)，3.83(s，3H)，7.79(bs，4H)，2.89(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+469.2。
B型化合物
(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基)-{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-吡啶-3-基}-甲酮B1
在室温下，向5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-烟酸10(0.05mm0l)在DMF(1mL)中的溶液中加入HATU(0.06mmol)和DIEA(0.14mmol)。将所得混合物搅拌2分钟，然后加入1-甲磺酰基-哌嗪(0.05mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4h，然后直接经制备型LCMS纯化得到(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基)-{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-吡啶-3-基}-甲酮B1。1H NMR(400MHz，d4-CH3OH)δ9.30(d，J＝4.0Hz，1H)，8.81(s，2H)，8.50(d，J＝4.0Hz，1H)，7.60-7.758(m，2H)，7.07-7.05(m，2H)，3.96-3.94(m，2H)，3.85(s，3H)，3.54-352(m，2H)，3.42-3.39(m，2H)，3.27(bs，2H)，2.91(s，3H)，2.62(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+483.1。
(5-(5-(4-甲氧基苯基)嘧啶-2-基氨基)-2-甲基吡啶-3-基)(吡咯烷-1-基)甲酮B2
根据关于B1所述的制备方法制备。1H NMR(400MHz，d4-CH3OH)δ9.44(bs，1H)，8.84(s，2H)，8.58(bs，1H)，7.60-7.58(m，2H)，7.08-7.05(m，2H)，3.85(s，3H)，3.86(t，J＝4.0Hz，2H)，3.38(t，J＝4.0Hz，2H)，2.66(s，3H)，2.06-2.00(m，4H)。MS(m/z)(M+1)+490.1。
(5-(5-(4-(二氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-基氨基)吡啶-3-基)(哌嗪-1-基)甲酮B3
向小瓶中加入5-氨基烟酸甲酯18(1.45mmol)、2-氯-5-(4-(二氟甲氧基)苯基)嘧啶17(1.45mmol)、Pd(OAc)2(0.22mmol)、Xanthphos(0.22mmol)、Cs2CO3(1.45mmol)和无水1，4-二恶烷(5mL)。排空小瓶中气体，重新用氮气填充两次，将混合物在油浴中在100℃下加热3小时。将小瓶冷却至室温，用水(20mL)稀释反应混合物，用10％Na2CO3溶液中和pH。所得混悬液用DCM∶IPA＝3∶1(3x50mL)萃取。将有机层用盐水洗涤一次并用硫酸钠干燥。真空除去溶剂，橙色粗产物经制备型HPLC(MeCN梯度20-70％)纯化得到5-(5-(4-(二氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-基氨基)烟酸19。MS(m/z)(M+1)+359.1。
在室温下，向5-(5-(4-(二氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-基氨基)烟酸19(0.028mmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入HATU(0.033mmol)和DIEA(0.084mmol)。将所得混合物搅拌2分钟，然后加入N-boc-哌嗪(0.03mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h，然后直接经制备型LCMS纯化得到4-(5-(5-(4-(二氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-基氨基)烟酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。在室温下用TFA(1mL)处理残余物1小时，真空浓缩，直接经制备型LCMS纯化得到(5-(5-(4-(二氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-基氨基)吡啶-3-基)(哌嗪-1-基)甲酮B3。1H NMR(400MHz，d3-CH3CN)δ9.32(bs，1H)，8.86(s，2H)，8.67(bs，1H)，8.41(bs，1H)，7.75(d，J＝12.0Hz，2H)，7.33(d，J＝12.0Hz，2H)，6.87(t，J＝73Hz，1H)，4.20(bs，4H)，3.30(bs，4H)。MS(m/z)(M+1)+427.1。
C型化合物
哌啶-2-甲酸{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-吡啶-3-基}-酰胺C1
向哌啶-1，2-二甲酸1-叔丁酯(0.04mmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入HATU(0.05mmol)和DIEA(20.12mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2分钟，然后加入N5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基]-2-甲基-吡啶-3，5-二胺12(0.032mmol)。将反应混合物在45℃下搅拌12小时。将混合物冷却，直接经制备型LCMS纯化得到2-{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-吡啶-3-基氨基甲酰基}-哌啶-1-甲酸叔丁酯20。MS(m/z)(M+1)+519.1。
将2-{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-吡啶-3-基氨基甲酰基}-哌啶-1-甲酸叔丁酯20溶于DCM(1mL)，加入TFA(2mL)。将黄色溶液在室温下搅拌2小时。真空下除去溶剂和过量的TFA，残余物经制备型LCMS纯化得到哌啶-2-甲酸{5-[5-(4-甲氧基-苯基)-嘧啶-2-基氨基]-2-甲基-吡啶-3-基}-酰胺C1。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1H NMR(400MHz，d4-CH3OH)δ9.27(d，J＝4.0Hz，1H)，8.85(d，J＝4.0Hz，1H)，8.80(s，2H)，7.59-7.57(m，2H)，7.06-7.06(m，2H)，4.14(dd，J＝4.0和12.0Hz，1H)，3.86(s，3H)，3.52-3.48(m，1H)，3.15-3.12(m，1H)，2.62(s，3H)，2.45-2.44(m，1H)，2.07-2.06(m，1H)，1.98-1.95(m，1H)，1.89-1.85(m，1H)，1.79-1.75(m，2H)。MS(m/z)(M+1)+419.2。
1-(5-(5-(4-甲氧基苯基)嘧啶-2-基氨基)-2-甲基吡啶-3-基)-3-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲C2
向N-(5-(4-甲氧基苯基)嘧啶-2-基)-6-甲基吡啶-3，5-二胺12(0.06mmol)在THF(2mL)中的溶液中加入三光气(0.02mmol)和DIEA(0.01mmol)。将反应液在室温下搅拌15分钟，然后加入1-甲基-1H-吡唑-5-胺(0.1mmol)，继续搅拌2小时。将反应蒸发至干，经硅胶色谱法纯化，用DCM∶MeOH＝95∶5洗脱，得到1-(5-(5-(4-甲氧基苯基)嘧啶-2-基氨基)-2-甲基吡啶-3-基)-3-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲C2，为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.72(d，J＝2.0Hz，1H)，8.70(s，2H)，8.60(d，J＝2.0Hz，1H)，7.54(d，J＝6.5Hz，2H)，7.40(d，J＝2.0Hz，1H)，7.03(d，J＝6.5Hz，2H)，6.28(d，J＝2.0Hz，1H)，3.84(s，3H)，3.79(s，3H)，2.49(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+431.2。
表1描述了根据以上所述方法制备的本发明的代表性化合物。表1中的化合物在c-kit Mo7e试验和/或PDGFR TG-HA-VSMC试验中的活性＜2.5μM。
表1
表2给出了可根据实施例中所述的一般方法制备的本发明的其它代表性化合物。
试验 对本发明的化合物进行测定以测量其选择性抑制野生型Ba/F3细胞和用Tel c-kit激酶和Tel PDGFR融合的酪氨酸激酶转化的Ba/F3细胞增殖的能力。此外，本发明化合物可选择性抑制Mo7e细胞的SCF依赖性增殖。此外，对本发明的化合物进行测定以测量其抑制Abl、ARG、BCR-Abl、BRK、EphB、Fms、Fyn、KDR、c-Kit、LCK、PDGF-R、b-Raf、c-Raf、SAPK2、Src、Tie2和TrkB激酶的能力。
增殖试验BaF3文库-Bright glo读数方案 对化合物抑制野生型Ba/F3细胞和用Tel融合的酪氨酸激酶转化的Ba/F3细胞增殖的能力进行分析。将未转化的Ba/F3细胞维持在含有重组IL3的培养基中。将细胞以每孔50μL培养基中5,000个细胞的密度涂到384-孔TC板中，并以0.06nM至10μM的浓度向其中加入测试化合物。然后，将这些细胞在37℃、5％CO2下培养48小时。在对细胞进行培养后，按照制造商的说明书向各孔中加入25μL BRIGHT GLO
(Promega)，并用Analyst GT-发光模式-50000积分时间在RLU中对这些板进行读数。由剂量响应曲线确定IC50值。
Mo7e试验 用内源性表达c-kit的Mo7e细胞在96-孔板中对本文所述化合物抑制SCF依赖性增殖的作用进行测试。对两倍系列稀释的测试化合物(Cmax＝10μM)对于用人重组SCF刺激的Mo7e细胞的抗增殖活性进行评估。将其在37℃下培养48小时后，用得自Promega的MTT比色测定测量细胞活力。
c-kit HTRF试验方案 将等份(5μL)的2倍浓度的c-kit酶混合物25ng c-kit(5ng/μL)和2μM生物素-EEEPQYEEIPIYLELLP-NH2肽在激酶缓冲液(20mM Tris pH 7.5，10mM MgCl2，0.01％BSA，0.1％Brij35，1mM DTT，5％甘油，0.05mMNa3VO4)中的溶液加至384孔Proxiplate板(Packard)中。Proxiplate板的最后一行每个孔中含有5μL不含c-kit的c-kit酶混合物以确定背景水平。向每孔中加入本发明化合物，在室温下培养30分钟。向每孔中加入2x ATP(40μM)在激酶缓冲液(5μL)中的溶液，在室温下培养3小时。向每孔中加入检测混合物(50％KF，40％激酶缓冲液，10％EDTA，1∶100稀释的MabPT66-K(cat#61T66KLB)和1∶100稀释的链霉抗生物素-XL(cat#611SAXLB)0(10μL)，继续在室温下培养1至2小时，然后在检测器中读取HTRF信号强度。
人TG-HA-VSMC增殖试验 使人TG-HA-VSMC细胞(ATCC)在补加了10％FBS的DMEM中生长至80-90％的融合，然后将其以6e4个细胞/mL的数量重新混悬于补加了1％FBS和30ng/mL重组人PDGF-BB的DMEM中。然后，将这些细胞以50μL/孔的数量等分至384-孔板中，将其在37℃下培养20小时，然后用0.5μL 100x化合物将其在37℃下处理48小时。在处理后，向各孔中加入25μL CellTiter-Glo处理15分钟，然后在CLIPR(Molecular Devices)上对这些板进行读数。
PDGFRα&βLance试验方案 将等份的(2.5μL)2倍浓度的PDGFRβ肽和ATP混合物(4μM生物素-βA-βA-βA-AEEEEYVFIEAKKK肽，20μM ATP在分析缓冲液(20mMHepes，54mM MgCl2，0.01％BSA，0.05％吐温-20，1mM DTT，10％甘油，50μM Na3VO4)中的溶液)加至384孔Proxiplate板(Packard)中。将板离心，用针式加样器(pintool dispenser)向每孔中加入(2.5μL)2倍浓度的酶混合物(PDGFRα，浓度为4.5ng/μL(cat#PV4117)或PDGFRβ，浓度为1.5ng/μL(cat#PV3591)，均为在分析缓冲液中的溶液)或不含PDGFRα/β酶的分析缓冲液。在室温下培养1.5小时。向每孔中加入检测混合物(5μL；50％1MKF，40％激酶缓冲液，10％EDTA，1∶100稀释的Mab PT66-K(cat#61T66KLB)和1∶100稀释的链霉抗生物素-XL(cat#611SAXLB)，将板在室温下培育1小时，然后在检测器上读取HTRF信号。
Ba/F3FL FLT3增殖试验 所用鼠科动物细胞系是过表达全长FLT3构建体的Ba/F3鼠科动物pro-B细胞系。将这些细胞维持在补加了青霉素50μg/mL、链霉素50μg/mL和L-谷酰胺200mM的RPMI 1640/10％胎牛血清(RPMI/FBS)中，同时加入鼠科动物重组IL3。Ba/F3全长FLT3细胞经历16小时的IL3饥饿，然后以每孔25μL培养基中5,000个细胞的密度将其涂到384-孔TC板中；并以0.06nM至10μM的浓度向其中加入测试化合物。在加入化合物后，以适宜的浓度向各孔中加入在25μL培养基中的FLT3配体或IL3来进行细胞毒性控制。然后，将这些细胞在37℃、5％CO2下培养48小时。在对细胞进行培养后，按照制造商的说明书向各孔中加入25μL BRIGHTGLO
(Promega)并用Analyst GT-发光模式-50000积分时间在RLU中对这些板进行读数。
对细胞BCR-Abl依赖性增殖的抑制(高通量方法) 所用的鼠细胞系32D造血祖细胞系用BCR-Abl cDNA转化(32D-p210)。将这些细胞保持在补充有青霉素(50μg/mL)、链霉素(50μg/mL)和L-谷酰胺(200mM)的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。将未转化的32D细胞保持在类似条件下并添加15％WEHI条件培养基作为IL3源。
将50μl 32D或32D-p210细胞混悬液以每孔5000个细胞的密度接种于Greiner 384孔微孔板(黑色)中。向各孔中加入50nl测试化合物(1mM在DMSO中的储备液)(包含STI571作为阳性对照)。在37℃、5％CO2下将细胞培养72小时。向各孔中加入10μl 60％的Alamar BlueTM溶液(Tek诊断试剂)并将细胞再培养24小时。使用AcquestTM系统(Molecular Devices)测定荧光强度(530nm激发，580nm发射)。
对细胞BCR-Abl依赖性增殖的抑制 将32D-p210细胞以每孔15,000个细胞的密度接种于96孔TC板中。向各孔中加入50μL测试化合物的两倍系列稀释液(Cmax为40μM)(包含STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％CO2下培养48小时后，向各孔中加入15μL MTT(Promega)并将细胞再培养5小时。通过分光光度法定量测定570nm处的光密度并通过量效曲线确定IC50值。
对细胞周期分布的影响 将32D和32D-p210细胞以每孔5mL培养基中2.5x106个细胞的数量接种于6孔TC板中并加入1或10μM的测试化合物(包含STI571作为对照)。然后，将细胞在37℃、5％CO2下培养24或48小时。用PBS洗涤2ml细胞混悬液，在70％EtOH中固定1小时并用PBS/EDTA/RNase A处理30分钟。加入碘化丙锭(Cf＝10μg/ml)并用流式细胞仪在FACScaliburTM系统(BD Biosciences)上测定荧光强度。本发明的测试化合物显示对32D-p210细胞具有细胞凋亡作用但不在32D母本细胞中诱导细胞凋亡。
对细胞BCR-Abl自身磷酸化的影响 使用c-abl特异性捕获抗体和抗磷酸酪氨酸抗体通过捕获ELISA定量BCR-Abl的自身磷酸化作用。将32D-p210细胞以每孔50μL培养基中2x105个细胞的数量加入96孔TC板中。每孔加入50μL测试化合物的两倍系列稀释液(Cmax为10μM)(包含STI571作为阳性对照)。在37℃、5％CO2下培养细胞90分钟。然后，将细胞在冰上用150μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，5mM EDTA，1mM EGTA和1％NP-40)处理1小时。将50μL细胞溶胞产物加到96孔光学板中，该板预先用抗-abl特异性抗体涂覆和封闭。在4℃下培养该板4小时。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入50μL结合有碱性磷酸酶的抗-磷酸酪氨酸抗体并将该板在4℃下培养过夜。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入90μL发光底物并用AcquestTM体系(Molecular Devices)定量测定发光情况。本发明受试化合物中抑制表达BCR-Abl的细胞增殖的化合物以剂量依赖的方式抑制细胞的BCR-Abl自身磷酸化作用。
对表达突变型BCR-Abl的细胞增殖的影响 测试本发明化合物对表达野生型或突变型BCR-Abl(G250E、E255V、T315I、F317L、M351T)的Ba/F3细胞的抗增殖作用，所述BCR-Abl可以引起对STI571耐受或对其敏感性降低。以10、3.3、1.1和0.37μM的浓度如上所述(培养基中不含IL3)测试这些化合物对表达突变型-BCR-Abl的细胞和未转化的细胞的抗增殖作用。由如上所述获得的量效曲线确定对未转化的细胞没有毒性的化合物的IC50值。
FGFR3(酶试验) 在终体积为10μL的含有0.25μg/mL酶的激酶缓冲液(30mM Tris-HClpH7.5，15mM MgCl2，4.5mM MnCl2，15μM Na3VO4和50μg/mL BSA)溶液、底物(5μg/mL生物素-聚-EY(Glu，Tyr)(CIS-US，Inc.)和3μM ATP的溶液中，使用纯化的FGFR3(Upstate)进行激酶活性试验。制备两种溶液首先将含有位于激酶缓冲液中的FGFR3酶的5μL的第一种溶液分配到384-型ProxiPlate
(Perkin-Elmer)中，随后加入溶于DMSO中的50nL化合物。然后，向各孔中加入含有位于激酶缓冲液中的底物(聚-EY)和ATP的第二种溶液(5μl)。将该反应在室温下培养1小时，通过加入10μL HTRF检测混合物来终止该反应，所述混合物含有30mM Tris-HCl pH7.5、0.5MKF、50mM ETDA、0.2mg/mL BSA、15μg/mL链霉抗生物素-XL665(CIS-US，Inc.)和150ng/mL结合有抗磷酸酪氨酸抗体的穴合物(CIS-US，Inc.)。于室温下培养1小时使链霉抗生物素-生物素相互作用后，在AnalystGT(Molecular Devices Corp.)上读取随时间改变的荧光信号。根据每一化合物在12个浓度下(从50μM到0.28nM的1∶3稀释液)的抑制百分比的线性回归分析计算IC50值。在该试验中，本发明化合物的IC50值在10nM至2μM之间。
FGFR3(细胞试验) 测试本发明化合物抑制转化的Ba/F3-TEL-FGFR3细胞增殖(其依赖于FGFR3细胞激酶的活性)的能力。将Ba/F3-TEL-FGFR3在混悬液中培养至多达800,000个细胞/mL，用补充有10％胎牛血清的RPMI1640作为培养基。将细胞以每孔5000个细胞分配于384-孔板中的50μL培养基中。将本发明化合物在二甲基亚砜(DMSO)中溶解和稀释。用DMSO制备12个1∶3的系列稀释液以产生范围通常在10mM到0.05μM的浓度梯度。将50nL的稀释化合物加到细胞中，在细胞培养箱中培养48小时。向细胞中加入AlamarBlue
(TREK Diagnostic Systems)(可用于监测由增殖细胞产生的还原性环境)，终浓度达到10％。在37℃的细胞培养器中再培养4小时后，在Analyst GT(Molecular Devices Corp.)上定量测定被还原的AlamarBlue
的荧光信号(于530nm激发，于580nm发射)。根据每个化合物12个浓度的抑制百分比的线性回归分析来计算IC50值。
b-Raf(酶试验) 测试本发明化合物抑制b-Raf活性的能力。在黑色壁和透明底的384孔MaxiSorp板(NUNC)中进行测定。将底物IκBα在DPBS中稀释(1∶750)并向各孔中加入15μL。将这些板在4℃下培养过夜并用EMBLA板清洗器以TBST(25mM Tris、pH8.0、150mM NaCl和0.05％吐温-20)洗涤3次。在室温下用Superblock(15μL/孔)封闭板3小时，用TBST洗涤3次并轻拍干燥。将含有20μM ATP(10μL)的测试缓冲液加入各孔，然后加入100nL或500nL化合物。将B-Raf在测试缓冲液中稀释(1μL稀释至25μL)并将10μL稀释的b-Raf加入各孔(0.4μg/孔)。将这些板在室温下培养2.5小时。用TBST洗涤该板6次以终止激酶反应。以Superblock稀释Phosph-IκBα(Ser32/36)抗体(1∶10,000)并将15μL加入各孔。将这些板在4℃下培养过夜并用TBST洗涤6次。用Superblock稀释结合有AP的山羊-抗-小鼠IgG(1∶1,500)并将15μL加到各孔中。将这些板在室温下培养1小时并用TBST洗涤6次。在各孔中加入15μL Attophos AP底物(Promega)并将这些板在室温下培养15分钟。在Acquest或Analyst GT上使用FluorescenceIntensity Program(激发455nm，发射580nm)对这些板进行读数。
b-Raf(细胞试验) 在A375细胞中测试本发明化合物抑制MEK磷酸化的能力。A375细胞系(ATCC)得自人类黑色素瘤患者，它在B-Raf基因上具有V599E突变。由于B-Raf突变使得磷酸化的MEK水平上升。在无血清培养基中，在37℃下将接近汇合至汇合的A375细胞与化合物一起培养2小时。然后用冷PBS洗涤细胞一次并用含有1％TritonX100的裂解缓冲液裂解细胞。离心后，上清液进行SDS-PAGE，接着将其转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜用抗-磷酸MEK抗体(ser217/221)(Cell Signaling)进行蛋白质印迹分析。通过磷酸化MEK在硝酸纤维素膜上的条带密度考察磷酸化MEK的量。
UPSTATE KINASE PROFILERTM-放射-酶促滤纸结合试验 对本发明化合物抑制激酶小组各成员的能力进行评价。按照该一般方法一式两份地测定终浓度为10μM的化合物。在置于冰上的微量离心管中混合激酶缓冲液(2.5μL，10x，需要时可含有MnCl2)、活化的激酶(0.001-0.01单位；2.5μL)、在激酶缓冲液中的特异性或多聚(Glu4-Tyr)肽(5-500μM或0.01mg/ml)和激酶缓冲液(50μM；5μL)。加入Mg/ATP混合物(10μL；67.5(或33.75)mM MgCl2、450或225μM ATP和1μCi/μl[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol))并在约30℃下将反应培养约10分钟。将反应混合物(20μl)点在2cm×2cm P81(磷酸纤维素，用于带正电的肽底物)或Whatman No.1(用于多聚(Glu4-Tyr)肽底物)方形纸上。用0.75％磷酸洗涤该方形纸4次，每次5分钟，并用丙酮洗涤一次，洗涤5分钟。将该方形纸转移到闪烁小瓶中，加入闪烁混合液(5ml)并用Beckman闪烁计数器定量掺入肽底物中的32P(cpm)。计算每个反应的抑制百分比。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅仅是出于举例说明的目的，本领域技术人员可以据此进行各种修饰或改变，并且这些修饰和改变均包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的保护范围之内。本文所引用的所有公开出版物、专利和专利申请均引入本文作为参考并用于所有目的。
权利要求
1.式(1)化合物或其可药用盐
其中
1-4个X1、X2、X3、X4、X5和X6是N且其余的是CR3，且E环通过碳原子与NR、R2和R3连接；
Ar是任选被取代的5-6元芳基或杂芳基，条件是Ar不是咪唑基；
R1和R2独立的是C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基或羟基取代；或是卤素、氰基、硝基、(CR2)kOR7、(CR2)kO(CR2)1-4R7、(CR2)kSR7、(CR2)kNR9R10、(CR2)kC(O)O0-1R7、OC(O)R7、(CR2)kC(S)R7、(CR2)kC(O)NR9R10、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)kNRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR9R10、(CR2)kS(O)1-2R8、(CR2)kNRS(O)1-2R8或(CR2)kR6；或任意两个相邻的R2基团与其连接的原子一起可形成任选取代的5-8元碳环、杂环、芳基或杂芳基环；
R3是-L-NR4R5、-X-NR-C(O)R8或-X-NR-C(O)NR4R5，其中L是-X-C(O)、-X-OC(O)、-SO0-2(CR2)j、(CR2)1-4、-O(CR2)1-4或
且X是(CR2)j或[C(R)(CR2OR)]；
R4、R5、R9和R10独立的是H；C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6取代；或是(CR2)kCN、(CR2)1-6NR7R7、(CR2)1-6OR7、(CR2)kC(O)O0-1R7、(CR2)kC(O)NR7R7或(CR2)k-R6；
R6是任选取代的C3-7环烷基、C6-10芳基或者5-10元杂芳基或5-7元杂环；
R7和R8独立的是(CR2)k-R6或C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、酰胺基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6取代；或R7是H；
或者R4和R5与NR4R5中的N一起、R7和R7与NR7R7中的N一起或R9和R10与NR9R10中的N一起，可形成4-7元杂环，所述杂环任选被1-3个R11基团取代且任选含有NR12、O、S、＝O或双键；
R11是R8、(CR2)k-OR7、CO2R7、(CR2)k-C(O)-(CR2)k-R8、(CR2)kC(O)NR7R7、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)kNRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR7R7、(CR2)kS(O)1-2R8或(CR2)kNRS(O)1-2R8；
R12是H、R8、-(CR2)1-4CO2R7、(CR2)k-C(O)-(CR2)k-R8、(CR2)kC(O)NR7R7、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)1-4NRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR7R7、(CR2)kS(O)1-2R8或(CR2)kNRS(O)1-2R8；
R是H或C1-6烷基；
k是0-6；
j和m独立的是0-4；
条件是Ar是苯基且X是(CR2)0时，-X-NR-C(O)R8中的R8不是苯基。
2.权利要求1的化合物，其中E环是吡啶基。
3.权利要求1或2的化合物，其中Ar是苯基。
4.权利要求1-3之任一项的化合物，其中R1为C1-6烷氧基或含有1-6个氟原子的卤代烷基。
5.权利要求4的化合物，其中R1是OCH3、OCHF2、OCF3、OCH2CF3、OCF2CH3或OCH2CF3。
6.权利要求1-5之任一项的化合物，其中若R2存在则为卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基或CO2R7且R7是H或C1-6烷基。
7.权利要求1-6之任一项的化合物，其中R3是-L-NR4R5、-X-NR-C(O)R8或-X-NR-C(O)NR4R5；
L是-X-C(O)；
X是(CR2)j；且
j是0。
8.权利要求1-6之任一项的化合物，其中R3选自于
9.权利要求1-6之任一项的化合物，其中R3选自于
其中RA是-NH2、-NEt2或-NH(CH2)1-6OH。
10.权利要求1的化合物，其中所述化合物选自于式(2A)、(2B)和(2C)
其中
R1是C1-6烷氧基或含有1-6个氟原子的卤代烷基；
R2若存在则是C1-6烷基；
R3是-L-NR4R5、-X-NR-C(O)R8或-X-NR-C(O)NR4R5；
L是-X-C(O)；
X是(CR2)j；
R4和R5独立的是H；C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6取代；或R4和R5与N一起形成哌嗪基、吡咯烷基或哌啶基，其中每个基团都任选被＝O或1-2个R11基团取代；
R11是R8、(CR2)kOR7、CO2R7、(CR2)k-C(O)-(CR2)k-R8、(CR2)kC(O)NR7R7、(CR2)kC(O)NR(CR2)0-6C(O)O0-1R7、(CR2)kNRC(O)O0-1R7、(CR2)kS(O)1-2NR7R7、(CR2)kS(O)1-2R8或(CR2)kNRS(O)1-2R8；
R7和R8独立的是(CR2)k-R6或C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基，其中每个基团都可任选地被卤素、氨基、酰胺基、羟基、烷氧基、氰基、羧基或R6取代；或R7是H；
R6是任选取代的5-6元杂芳基或5-7元杂环；
R是H或C1-6烷基；
j是0；
k是0-4；且
m是0-1。
11.权利要求1的化合物，其中所述化合物选自于
12.含有治疗有效量的权利要求1-11之任一项的化合物和可药用载体的药物组合物。
13.权利要求1-11之任一项的化合物或其药物组合物任选地与第二种治疗剂联合用于制备治疗由PDGFRα、PDGFRβ和/或c-kit介导的情况的药物的用途，其中所述情况是哮喘、特应性皮炎、荨麻疹、肠易激综合征(IBS)或纤维变性疾病。
14.权利要求13的用途，其中所述纤维变性疾病是硬皮病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、原发性肺高血压(PPH)、原发性肺动脉高血压(PPAH)、特发性动脉高血压(IPAH)、肝纤维化、肾纤维化和心脏纤维化。
15.权利要求13的用途，其中第二种治疗剂是抗纤维化药、吡非尼酮、他克莫司、5-氯-2-{(1E)-3-[2-(4-甲氧基苯甲酰基)-4-甲基-1H-吡咯-1-基]丙-1-烯-1-基}-N-(甲基磺酰基)苯甲酰胺、抗炎药、皮质类固醇、色甘酸钠、白三烯拮抗剂、IgE阻滞剂、支气管扩张药、β2-激动剂、黄嘌呤类、抗胆碱药或化疗药。
16.权利要求13的用途，其中所述的权利要求1-11之任一项的化合物在第二种治疗剂之前、与其同时或在其之后施用。
17.一种调节激酶活性的方法，其包括向细胞或组织系统或哺乳动物主体施用治疗有效量的权利要求1-11之任一项的化合物或其可药用盐，从而调节所述激酶活性，其中所述激酶是c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6、SAPK2β、BRK、Fms、KDR、c-raf或b-raf激酶。
18.权利要求17的方法，其中所述激酶是c-kit、PDGFRα或PDGFRβ。
19.权利要求17的方法，其中所述的权利要求1-11之任一项的化合物直接在体外或体内接触c-kit、PDGFRα或PDGFRβ。
全文摘要
本发明提供了式(I)化合物及其药物组合物，其可用作蛋白激酶抑制剂，本发明还提供使用这种化合物治疗、缓解或预防与激酶活性异常或失调有关的情况的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用这些化合物治疗、缓解或预防与c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6、SAPK2β、BRK、Fms、KDR、c-raf或b-raf激酶异常激活有关的疾病或病症的方法。
文档编号A61P35/00GK101784539SQ200880103912
公开日2010年7月21日 申请日期2008年8月18日 优先权日2007年8月22日
发明者D·基亚内利, V·莫尔泰尼, 李小林, 刘晓东, J·纳巴卡, J·洛伦 申请人:Irm责任有限公司