专利名称：一种枯草芽孢杆菌制剂的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制品领域，具体的说是提供一种作为饲料添加剂的枯草芽孢杆菌 制剂的制备方法。
背景技术：
药物饲料添加剂的广泛运用，尤其是抗生素饲料添加剂的利用，在动物防病治病 等方面发挥重要作用的同时，也给畜牧生产和人类带来了一定的副作用。首先是抗生素在 杀灭致病菌的同时，也杀灭了对动物机体的有益菌，破坏肠道内微生物的微生态平衡，导致 动物，特别是幼畜禽对病原微生物的易感性。另外，长期饲喂抗生素会使动物机体内产生具 有耐药性的细菌，这些细菌对人畜均有害。为此，各国都在积极进行各种新型抗生素替代品 的研究开发，其中微生态制剂是目前研究的主要热点之一。微生态饲料添加剂是根据微生态学理论研制的含有对动物有益微生物的活菌制 剂，它们通过维持动物肠道内微生态平衡而发挥作用，具有促进动物生长发育，提高动物机 体免疫力等多种功能，且无污染、无残留、无耐药性和对环境无害等，是一类新型绿色环保 饲料添加剂。这些禽畜用的益生菌制剂含有芽孢杆菌，乳酸杆菌，粪链球菌，双歧杆菌，酵母 等，光合细菌和梭状芽胞杆菌属的部分菌株及噬菌蛭弧菌等也偶然被用做益生菌添加到仔 猪和仔鸡饲料中。微生态制剂的作用机理一般认为微生态制剂对促进畜禽健康的作用机理包括以 下几个方面1.生物夺氧，研究表明幼龄畜禽出生时，其消化道内通常是无菌的，出生后3h 在胃肠道中可发现入侵的细菌，12h后在大肠中检测到。芽孢杆菌为需氧菌，进入动物肠道 内消耗大量的游离氧，降低了肠内氧浓度和氧化还原电势，有利于厌氧菌的生长，保持肠道 微生态系统的稳衡。同时使肠道中原本存在的需氧菌肠杆菌等的生长因缺氧受到抑制，提 高动物机体抗病能力，减少胃肠道疾病发生几率；2.拮抗致病微生物，改善体内外生态环 境。动物饲喂芽孢杆菌后，能显著降低肠道大肠杆菌、产气荚膜梭菌沙门氏菌的数量，使机 体内的有益菌增加，潜在的致病菌减少，因而排泄物、分泌物中有益菌数量增多，致病性微 生物减少，从而净化了体内外环境，减少疾病的发生；3.增强动物体的免疫功能。促进动物 免疫功能是微生物添加剂作用机能的理论之一，乳酸菌类微生物添加剂促进动物免疫功能 报道较多，而芽孢杆菌的作用少见报道。有研究表明，芽孢杆菌能促进动物肠道相关淋巴组 织处于高度的“免疫准备状态”，同时使免疫器官发育加快，免疫系统成熟快而早，T、B淋巴 细胞数量增多，动物体液和细胞免疫水平提高；4.产生多种酶类，促进动物的消化酶活性。 目前研究表明，芽孢杆菌能产生多种酶类，促进动物对营养物的消化吸收；5.产生多种营 养物质。芽孢杆菌在动物肠道内生长繁殖，能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、有机酸、 促生长因子等，参与动物机体新陈代谢，为机体提供营养物质。活菌微生态制剂在动物养殖中的作用活菌制剂始于上世纪初，有人用酸牛奶来 调整幼畜腹泻出现的肠道微生物菌群失调。后来，在研究中人们发现用活菌制剂可防止畜 禽的腹泻和肠炎，继之又发现活菌制剂还可改善动物对饲料的利用，并有利于促进畜禽的
3生长发育和肠道健康，从而扩大了活菌制剂在畜牧生产中的作用和应用前景，概括起来，主 要有以下几个方面的作用。1、改善动物胃肠道微生态环境研究表明，动物自身及许多致病菌不会产生各种 有毒物质，如胺、氨、细菌毒素、氧自由基等代谢产物。有些有益菌可以阻止毒性胺和氨的合 成或把它们分解中和细菌毒素，从而避免这些有害物质对动物机体组织细胞的损害作用。 一些好氧菌则通过产生超氧化物歧化酶来消除氧自由基，减少或消除氧自由基对细胞及细 胞器膜质结构的损害。乳酸菌能够产生有机酸和抗菌物质，降低肠道内PH值和氧化还原电 位，有利于宿主生长发育和维持肠道健康。产生有益物质动物微生态活菌制剂能够在动物 体内产生各种消化酶，合成B族维生素、维生素K等动物所必需的营养物质；同时能促使动 物体增加对肠道内容物中钙、镁等营养物质的吸收。2、建立和维持肠道微生态平衡研究表明，动物肠道内寄居的微生物，主要为厌氧 菌。通常情况下，肠道内有益菌和致病菌会保持一定比例，当条件发生改变时，致病菌大量 繁殖引起平衡失调，从而导致动物体患病。当需氧型益生菌进入消化道后，生长繁殖消耗肠 道内大量氧气，通过“生物夺氧”使需氧型致病菌大幅度下降，因而起到防止动物患病的作 用。研究还发现，益生菌能够有秩序地定植于粘膜、皮肤等表面或细胞之间形成生物屏障， 这些屏障可以阻止病原微生物的定植，起着占位、争夺营养。互利共生或拮抗作用，形成保 护屏障，阻止病原菌的侵入，从而对致病菌的定植产生抑制作用。增强动物免疫能力和促进 动物生长微生态制剂可作为非特异性免疫调节因子，增强吞噬细胞的吞噬能力和细胞产 生抗体的能力，刺激动物产生干扰素，从而增强抗病能力。据报道，用活菌微生态制剂—— 益生素饲喂哺乳仔猪，添加组腹泻率明显比对照组减少(3.91%，P < 0.01)，成活率提高 79%。在10 28日龄的仔猪饲料中添加益生素，试验组采食量平均比对照组增加70g/d， 增重提高4. 2%。又有研究报道，在雏鸡中分别饲喂和不饲喂乳酸杆菌制剂两个组的基础 上，进行鸡的白痢沙门氏菌攻毒试验。结果表明，饲喂乳酸杆菌雏鸡组与对照组相比，死亡 率明显降低了 20%。还有报道称在鱼虾饲料中添加微生态制剂，可使鱼虾增重提高10% 20%。在畜牧生产中常用的微生态添加剂，乳酸菌和芽胞杆菌类益生菌为主要的微生态 添加剂。与乳酸菌、双歧杆菌等相比，芽孢杆菌的优点在于它对外界不良环境有很强的抵抗 力，能耐60°C以上高温，保存时间长(常温下1年以上)，培养容易，便于加工制成各种制 剂，效果稳定。本试验采用牛肉汤蛋白胨培养基为培养一级种子，用牛肉汤蛋白胨、生物素 培养基培养二级种子，用牛肉汤蛋白胨、豆芽汁发酵培养基进行连续补料分批发酵方式扩 增培养，发酵液经过离心，上清液即枯草芽孢杆菌代谢物稀释制备口服液，菌体用白色淀维 粉吸附，在干燥箱中40°C烘干成干粉。枯草芽孢杆菌培养基种类有多种，在牛肉汤培养基基础上，常采用玉米粉、豆饼、 米糠、麸皮、骨粉、鱼粉、贝壳粉等制备固体培养基进行发酵，虽然能保证菌体所需营养，但 是从固体发酵培养基中难以使菌体及其代谢产物分离，除菌体具有作用外，有研究表明菌 体代谢产物同样具有好的应用效果，因此利用制备的液体培养基牛肉膏蛋白胨、豆芽汁制 备的发酵培养基营养全面，含有菌体所需的氮源、碳源及无机盐，来源广泛，制备简单，最重 要是易于分离菌体及其代谢产物，利于工业化大量生产。因此，为了在最大限度利用枯草芽孢杆菌的作用，同时为了适用于工业化生产的需求，需要一种简单、实用、经济、高效的枯草芽孢杆菌培养制备制剂方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能促进畜禽类生长的枯草芽孢杆菌制剂方法。本发明的技术方案概述如下(1)用牛肉汤蛋白胨培养基为种子培养基，pH 7.0 7.5，28 371有氧条件下 培养枯草芽孢杆菌10 16h，成为一级种子；(2)将一级种子液接种在牛肉汤蛋白胨、生物素二级种子培养基中培养，pH 7. 0 7. 5，28 37°C有氧条件下培养枯草芽孢杆菌20 24h，成为二级种子；(3)将二级种子液接种在牛肉汤蛋白胨、豆芽汁发酵培养基中培养，pH 7.0 7. 5，28 37°C有氧条件下，采用连续补料分批发酵方式培养36 60h，培养结束后静置 24 48h使芽孢出芽率达到90%以上；(4)发酵液经常温SOOOrpm 20min离心，上清液即枯草芽孢杆菌代谢物稀释制备 口服液，菌体沉淀用白色淀维粉吸附，在干燥箱中40°C烘干成干粉。权利要求1所述的步骤 ⑴中种子培养时间为12h。所述的步骤(2)中所述生物素加量为0. 0. 01%。所述的步骤(3)中所述的牛肉汤蛋白胨与豆芽汁的比例为4 1 5 1。所述的步骤(3)中所述的发酵培养为补料分批式，每隔12h流出60% 80%发酵
菌液，并补加等量发酵培养基。所述的步骤(4)中所述的发酵液室温8000rpm 20min离心上清液用生理盐水10 倍稀释分装制备口服液。菌体沉淀与石粉以1 3比例混合，烘箱40°C干燥，分装干粉。所述的步骤(4)中所述干粉以1 5比例拌饲料使用。本发明的有益效果是本发明的方法能改善固体发酵难于分离菌体及其代谢物的难题，使枯草芽孢杆菌 及其代谢物被充分利用。采用补料式发酵方式使产菌量大大提高，利于工业化大量产生。用 本发明的方法制备的口服液及菌体饲料添加剂应用于禽类时，可不使用抗生素和激素，并 能促进禽类的生长。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述。实施例1 枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，包括下述步骤(1)用牛肉汤蛋白胨培养基为种子培养基，在37°C有氧条件下培养枯草芽孢杆菌 12h，成为一级种子；(2)将一级种子液接种在牛肉汤蛋白胨、0. 01%生物素二级种子培养基中扩大培 养，在37°C有氧条件下培养20h，成为二级种子；(3)将二级种子液接种在发酵罐中进行发酵培养，采用以4 1比例混勻的牛肉 汤蛋白胨、豆芽汁为发酵培养基，在37°C有氧条件下，采用连续补料分批发酵方式培养，每 隔12h流出60% 80%发酵菌液，并补加等量发酵培养基，连续培养60h，培养结束后静置 48h使芽孢出芽率达到90%以上；
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(4)发酵液在常温下进行SOOOrpm 20min离心，上清液即枯草芽孢杆菌代谢物，上 清液用生理盐水10倍稀释分装制备口服液，菌体沉淀用白色淀维粉吸附，在干燥箱中40°C 烘干成干粉，干粉以1 5比例拌饲料使用。实施例2 本发明的方法制备的干粉对单纯性鸡白痢的治疗某鸡场饲养蛋鸡3000只，曾于27日龄有50%左右的鸡发生鸡白痢病，并造成平 均约每天1 %的死亡率，直到40日龄就诊，其间曾用敌菌净、土霉素等口服治疗，连用一周 病程好转，但停药不久又复发，经粪涂片30份，无固定致病原，视野中大多数是革兰氏阴性 菌。通过枯草芽孢杆菌干粉1 5拌料饲喂，以每鸡每天0.2亿活菌剂量投服，7天内 全群恢复，采食量由每天每只95g增加至103g。粪涂片20份，视野中95%为革兰氏阳性杆 菌，90%杆菌为芽孢杆菌的状态。由此可见，本发明枯草芽孢杆菌制剂能够降低畜禽由于沙门氏菌等有害微生物造 成腹泻的发生率，提高成活率；提高机体免疫功能，提高饲料转化利用率。
权利要求
一种禽类枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1)用牛肉汤蛋白胨培养基为种子培养基，pH 7.0～7.5，28～37℃有氧条件下培养枯草芽孢杆菌10～16h，成为一级种子；(2)将一级种子液接种在牛肉汤蛋白胨、生物素二级种子培养基中培养，pH 7.0～7.5，28～37℃有氧条件下培养枯草芽孢杆菌20～24h，成为二级种子；(3)将二级种子液接种在牛肉汤蛋白胨、豆芽汁发酵培养基中培养，pH 7.0～7.5，28～37℃有氧条件下，采用连续补料分批发酵方式培养36～60h，培养结束后静置24～48h使芽孢出芽率达到90％以上；(4)发酵液经常温8000rpm 20min离心，上清液即枯草芽孢杆菌代谢物稀释制备口服液，菌体沉淀用白色淀维粉吸附，在干燥箱中40℃烘干成干粉。
2.权利要求1所述的步骤(1)中种子培养时间为优选12h。
3.权利要求1所述的步骤(2)中所述生物素添加量为0. 0. 01%。
4.权利要求1所述的步骤(3)中所述的牛肉汤蛋白胨与豆芽汁的比例为4 1 5 I0
5.权利要求1所述的步骤(3)中所述的发酵培养为补料分批式，每隔12h流出60% 80%发酵菌液，并补加等量发酵培养基。
6.权利要求1所述的步骤(4)中所述的发酵液室温SOOOrpm20min离心上清液用生理 盐水10倍稀释分装制备口服液。菌体沉淀与石粉以1 3比例混合，烘箱40°C干燥，分装 干粉。
7.权利要求1所述的步骤(4)中所述干粉以1 5比例拌料使用。
全文摘要
本发明公开了一种禽类枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，包括下述步骤(1)用牛肉汤蛋白胨培养基复活枯草芽孢杆菌，作为一级种子；(2)将复活的菌液进行扩大培养，采用牛肉汤蛋白胨培养基加生物素培养，作为二级种子；(3)将牛肉汤蛋白胨、豆芽汁与二级种子液均匀混合，发酵培养；(4)将发酵液过滤，滤液即细菌代谢物制备口服液，菌体沉淀用石粉作为载体吸附干燥制备干粉，作为饲料添加剂。本发明的方法能改善固体发酵难于分离菌体的问题，可极大地提高提纯化效率，能满足工业生产的需要。同时枯草芽孢杆菌代谢物的作用也被充分利用。本发明的菌体干粉饲料添加剂在应用于禽类时，能促进禽类的生长及免疫力提高。
文档编号A61P1/12GK101933946SQ20091006953
公开日2011年1月5日 申请日期2009年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者王小娥 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司