专利名称：小分子RNA has-miR-29c在制备治疗肝癌的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉一个与HBV相关肝癌相关的小分子RNA has-miR-29c在抑制HBV感染和防止肝癌发生等方面的用途，属于生物技术研究领域。
背景技术：
microRNAs (miRNAs)是一类普遍存在于真核生物中的非编码的内源性小RNA分子，其长度通常为21-25nt。迄今为止在人体中已经发现了数百种microRNA分子。miRNAs 不编码蛋白质或多肽，而是通过与互补或部分互补的靶基因的mRNA的3’ -UTR(3’非编码区)相互作用，使mRNA降解或介导其转译抑制，从而在基因表达调控中发挥重要作用[1]。 研究表明，miRNA通过在转录或翻译水平调节相关基因表达，参与发育、增殖、分化、凋亡等多种生物学过程[2_3]。研究发现，miRNA的表达与多种肿瘤相关，如，miRNA通过调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌等高度相关。miRNA在肿瘤中的作用首次在B细胞慢性淋巴性白血病(CLL)中被证实，患者中有miR-15a和miR-16-l表达缺失或下调气另外miR-143和miR-145在结肠癌中表达下调[5]。miR-155在Burkitt，s淋巴瘤和其它几种淋巴瘤中表达上调[6]。Volinia等[7]通过分析540例取自肺、胸部、胃、前列腺、结肠和胰腺等处的肿瘤样品，发现这些实体瘤有着不同的miRNA表达谱，说明miRNAs在实体瘤的发病过程中发挥着重要作用。乙型肝炎病毒Q^patitis B virus, HBV)感染引起急性或慢性乙型病毒性肝炎 (简称乙肝)，是导致肝硬化、肝癌的重要原因。在我国HBV相关性肝细胞肝癌(HCC)发病率、死亡率均排名于疾病谱前列，严重危害人民健康[8_9]。因此，阐明HBV感染和肝癌发生过程中的机体免疫应答和损伤以及基因表达与调控机制，是非常重要的科学问题。microRNAs 的发现及其功能和调控机制的阐明为乙肝相关性肝癌的发生发展机制的研究提供一个新的方向。Murakami等_使用微阵列技术，对来自M个肝细胞癌(HCC)组织和22个临近正常组织(NT)的miRNAs表达谱进行分析，结果发现癌组织中miR-18、pre-miR-18和miR-224 较正常组织有更高水平的表达,而miR-199a、miR-199a*、miR-195、miR-200a和miR-12^i较正常组织有低水平表达。Meng等[11]研究结果显示肝癌组织中miR-21的浓度比正常肝细胞高出9倍。更重要的是，他们发现miR-21可以直接调控抑癌基因PTEN的表达，影响其下游的磷酸激酶及基质金属蛋白酶，从而影响肝癌的增殖、转移和侵袭。一项最新研究则证实 [12]，miR-12^i在HCC及其衍生的细胞系中表达下降约70%，miR-12^i表达下降导致细胞周期性蛋白Gl的过度表达是发病的重要病理机制。然而，这些报道以HCV感染相关肝癌或非肝炎患者标本为研究对象，涉及HBV相关肝癌的报道的研究目前较少，因此有待于进行相关方面的研究。有关miR-四在肿瘤中作用的研究报道还比较少。Fabbri等研究发现在肺癌细胞株中表达miR-四可以修复异常的DNA甲基化，诱导甲基化相关沉默肿瘤抑制基因的重新表
3达，抑制肿瘤生长[13]。miR-29在胆管癌[14]的发生发展中也具有调控作用，miR-29的表达上调会降低靶基因Mcl-I的表达，从而导致细胞耐药性的降低。另有研究发现，在慢性白血病患者的血样标本中,miR-四表达下调，miR-四作用于TCLlA(T-cellleukemia/lymphomalA) 基因，低表达miR49[15]与慢性淋巴性白血病预后差有关。但是这些研究均没有涉及miR-四在HBV相关肝癌中的研究，因此进行相关研究具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明对小分子RNA has-miR-29c在HBV相关肝癌中的调控作用及其用法进行了研究，研究发现，其可作为抑制HBV感染和防止肝癌发生的调控分子， 从而可以用于制备治疗肝癌的药物、抑制肝癌细胞生长的药物、抑制HBV感染的药物以及预防肝癌的药物或保健品。本发明所涉及的小分子RNA haS-miR-29c，其核苷酸序列如下5’ -UAGCACCAUUUGAAAUCG⑶UA-3 ’。本发明利用qRT-PCR技术发现与肝癌细胞系IfepG2相比，has_miR-29c在HBV肝癌细胞系H印G2. 2. 15中表达下调。本发明利用生物信息学方法确定了 haS-miRj9C的靶基因为Tnfaip3，并分别构建了 has-miR-29c与其靶基因iTnfaipS的表达载体，命名为pS_miR-29c和pGL3_tnfaip3。 双荧光检测结果表明Tnfaip3的确是has-miRj9C的靶基因。本发明体外转染haS-miR-29c表达载体，利用CCK8试剂盒观察到miR_29c可短期内抑制肿瘤细胞H印G2. 2. 15的生长。qRT-PCR技术和ELISA结果表明miR_29c对HBV DNA 复制和表达有一定的抑制作用。本发明体外转染haS-miR-29c表达载体后，对靶基因进行RT-PCR和Wstern检测， 其结果表明靶基因Tnfaip3在mRNA和蛋白水平均表达下调。因此，本发明miR-29c可能通过其靶基因Tnfaip3参与了 HBV相关肝癌的发生发展过程中，研究miR-四与HBV感染和肝癌的关系意义重大。
图1 :qRT_PCR检测has_miR-29c在肝癌细胞系H印G2和H印G2. 2. 15中的表达。图2 :miR-29c与其推测的靶基因Tnfaip3的双荧光报告检测。图3 :miR-29c抑制HBVDNA的复制和表达，其中，A 荧光定量PCR检测HBVDNA ；B ELISA法检测HBV HBeAg的表达；C =ELISA法检测HBV HBsAg的表达。图4 :CCK8检测miR_29c对肝癌细胞增殖的影响。图5 靶基因I^faip3表达差异的检测，其中，A =RT-PCR检测靶基因在mRNA水平上的表达差异；B =Western检测靶基因在蛋白水平上的表达差异；M :DL2000 ；1 :H印G2 ；2 HepG2. 2. 15 ；3 :pSilencer3. 1-control ；4 :pS-miR-29c。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 :haS-miR-29c在肝癌细胞系中表达水平的检测
Trizol法分别提取肝癌细胞系H印G2和H印G2. 2. 15细胞的总RNA。用PBS将细胞洗涤2遍，每瓶加入Iml Trizol，吹打混勻，室温孵育5min ；将细胞液转移入DEPC处理过的1. 5ml离心管中，每管加入0. 2ml氯仿，剧烈振荡1 混勻，冰上静置3 5min使分层；4°C，12000rpm，离心15min ；小心吸取上层液体，转移到另一个DEPC处理过的1. 5ml离心管中，加入等体积已在4°C预冷的异丙醇，上下颠倒轻轻混勻15 30s，冰上(室温)静置5 IOmin ；4°C，12000rpm，离心15min ；弃上清，加入Iml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀2次； 4°C，7500rpm离心lOmin，弃上清，EP管倒置晾干，加入DEPC水30ul溶解RNA。紫外吸收测定法和甲醛变性电泳检测总RNA的浓度和纯度。利用hvitrogen的miRNA cDNA合成试剂盒将上述所提总RNA进行cDNA的合成。 反应体系(20ul)如下总RNA 100pg-lug，5X逆转录反应缓冲液如1，lOXSuperScript 逆转录酶2ul，EDPC水补足到20ul。将上述体系混勻，PCR仪上进行逆转录，反应条件 370C 60min,95°C 5min，4°C保存。再以cDNA为模板，利用试剂盒自带的miRNA通用引物和根据试剂盒提供的方法设计的has-miRj9c的特异引物，在ABI7000仪上进行Real-time PCR0反应体系(20ul) 如下2X反应缓冲液10ul，10uM特异引物0. ^l，10uM通用引物0. ^l，25uM ROX 0. 4ul, cDNA2ul，EDPC 水 6. 8ul。反应条件:50°C 2min ；95°C 2min ；95°C 15s，60°C lmin，40 个循环。 以U6小RNA为内参对照，采用2_ΔΔα相对定量法处理数据。Real-time PCR结果表明，与肝癌细胞系H印G2相比，has_miR-29c在HBV肝癌细胞系H印G2. 2. 15中表达下调，下调2. 5倍左右(图1)。实施例2 :has-miR-29c靶基因的预测通过生物信息学方法，利用网上数据库(TargetScan ;http://www. tarRetscan. org/ ；Pictar :http//pictar. bio, nyu. edu/ ；miRanda :http//microrna. sanger. ac. uk/)预测has-miR-29c相关的靶基因，暂确定has-miRj9c的靶基因为tnfaip3。实施例3 :has-miR-29c表达载体的构建首先依据Sanger miRBase数据库收录的miRNA数据，根据pri_miR19序列设计引物(miRj9c-F和miRj9c-R)，并在miRj9c-F的5'端悬垂内切酶BamHI的酶切位点和保护碱基；在miRj9C-R 5'端悬垂另一内切酶HindIII的酶切位点和保护碱基。然后进行PCR扩增，PCR反应体系(50ul)如下:2X反应缓冲液25ul，IOuM上游引物lul, IOuM下游引物 Iul，DNA 2ul (小于 lug), ddH20 21ul。反应条件:94°C 3min ； 94 °C 30s, 55 °C 40s, 72°C 40s，32个循环；72°C延伸5min ；4°C保存。扩增后对PCR产物进行双酶切，酶切体系为 (50ul) ；10XK Buffer 5ul, BamHI 2. 5ul, HindIII 2. 5ul，PCR 产物 15ul，ddH20 25ul。酶切反应在37°C水浴中进行，池后酶切反应液经琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物，产物最终溶于IOuL Buffer EB中。再对载体pSilencer3. I-Hl neo进行双酶切，酶切体系为(50ul) :10XK Buffer 5ul, BamHI2. 5ul, HindIII 2. 5ul, pSilencer3. I-Hl neo IOul, ddH20 30ul。酶切反应在 37°C水浴中进行，池后利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物，产物最终溶于10 μ L Buffer EB 中。将上述酶切产物进行连接，连接体系为QOul) =IOX连接Buffe 2yL，载体片段 6 μ L，目的基因片段10 μ L，T4DNA连接酶2 μ L。连接反应在4°C下进行，16 20h后，70°C水浴IOmin灭活连接酶，终止连接反应。连接产物转化大肠杆菌DH5 α，涂菌平皿于37°C孵箱内培养12 16h。然后挑选阳性克隆，分别进行PCR扩增，酶切和测序验证，获得正确的haS-miR-29c表达载体，命名为 pS_miR-29c0实施例4 靶基因表达载体的构建依据GenBank中tnfaip3基因的序列，选取包含与has-miRj9c匹配的一段序列设计引物，(tnfaip3-F和tnfaip3_R)，并在tnfaip3_F的5'端悬垂内切酶KpnI的酶切位点和保护碱基，在tnfaip3-R 5'端悬垂另一内切酶BglIII的酶切位点和保护碱基。然后进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件同实施例3。扩增后对PCR产物进行双酶切，酶切体系为(50ul) :10XT Buffer5ul,KpnI 2. 5ul,BglIII 2. 5ul，PCR产物 15ul，ddH20 25ul。酶切反应在37°C水浴中进行，池后利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物，产物最终溶于IOyL Buffer EB 中。再对载体pGL3 control进行双酶切，酶切体系为(50ul) :10XT Buffer 5ul, KpnI 2. 5ul, BglIII 2. 5ul，pGL3 control IOul, ddH20 30ul。酶切反应在 37°C水浴中进行，池后利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物，产物最终溶于IOyL Buffer EB中。将上述酶切产物进行连接，连接体系和连接反应同实施例3。连接产物转化后挑选阳性克隆，也分别进行PCR扩增，酶切和测序验证，最后获得正确的表达载体，命名为 pGL3_tnfaip30实施例^as-miR_29c表达载体体外转染用hvitrogen公司的FuGENE. HD转染试剂将pS_miR-29c转染至H印G2. 2. 15细胞，转染步骤简述如下转染前一天，以每孔4X IO5个细胞的浓度接种于6孔板；常规培养20h后，细胞生长至对数增殖期，稀释适当体积的pS-miR-29c或pSilencerf. 1-control 于100ul0PTI-MEM培养基中，轻柔混合，使其终浓度为20ug/ml ；FuGENE. HD :pS_miR-29c或 pSilencer3. 1-control按4 2的比例在96孔板中配制转染混合物，剧烈震荡5-10s ；静置15min后，将转染混合物缓慢加到含H印G2. 2. 15细胞和OPTI-MEM培养基的培养孔中，轻摇30s;在37° °C 5%的CO2孵育6h后，更换成含10%新生小牛血清和380 μ g/ml G418的 MEM培养基，继续培养48-7 后检测转染水平以及后续试验。实施例6 双荧光报告的检测HepG2细胞接种M小时后，细胞长满培养孔面积的90%左右时进行转染。转染方法同实例5，然后进行双荧光报告的检测。双荧光素酶报告系统的检测，采用Promega 的Dual-luciferase荧光素酶报告基因检测系统，按试剂盒说明操作，简要过程如下转染 H印G2细胞4 后用PBS洗一遍细胞，然后每孔用被动裂解液IOOul裂解细胞，取15ul裂解产物加入50ul Luciferase反应底物，然后用荧光测量仪测定Firefly荧光，再加入Mop Glo试剂50ul，马上测量Renilla荧光。分析检查得到Firefly荧光素酶和Renilla荧光素酶的荧光值，用Renilla荧光素酶荧光值对Firefly荧光素酶荧光值进行归一化。每组实验至少重复3次，取平均值。双荧光报告检测结果显示，当haS-miR-29c表达载体pS-miR-29c与靶基因的表达载体pGL3-tnfaip3共转染H印G2细胞后，荧光素酶的荧光值降低了 5倍多，表明tnfaip3 的确是has-miRj9C的靶基因(图2)。
实施例7 :miR-29c抑制HBVDNA的复制和表达(1)对H印G2. 2. 15细胞培养上清中HBVDNA含量的影响H印G2. 2. 15细胞以每孔2X IO4个细胞的浓度接种于96孔板，常规培养20h后， 细胞生长至对数增殖期，进行转染，转染方法同实施例5。将预先配制好的lOOymol/L pS-miR-29c或pSilencer3. 1-control空质粒加入各孔，作用终浓度为ΙΟμπιοΙ/L，各组均设3个复孔。继续孵育24h或4 后，收集培养液上清lOOuL。利用试剂盒提取上述收集的血清的DNA，提取步骤简要如下取待测血清各 lOOul，分别加到0. 5ml离心管中；加入IOOul溶液A禾口 5ul内标，振荡混勻，13，OOOrpm离心IOmin ；吸弃上清(注意尽可能吸弃上清且不碰沉淀)，再加入25ul溶液B，剧烈震荡，尽可能使沉淀分散；100°C干浴；13，OOOrpm离心lOmin，吸取上清_20°C保存。以荧光定量PCR试剂盒检测HBV DNA的含量，检测方法严格按照说明书进行。简要如下按每个反应取HBV PCR反应液37. 7ul，Taq_0. !3ul，UDG酶0. Iul，分装于无菌PCR 反应管中，振荡混勻；用微量加样器在每一 PCR反应管内分别加入2ul标准品、阴性对照、临界对照、阳性对照和实验样品，混勻。进行qRT-PCR，PCR反应程序37°C 5min,94°C 2min, 95°C 5s,60°C 40s，40各循环，60°C时收集荧光信号。反应完毕，存储结果，进行数据处理。 每次试验均做标准曲线，将曲线相关系数控制在0. 99以上。结果为3次实验的平均值。实时定量PCR结果揭示，转染了 haS-miR-29c表达载体后，其HBV DNA拷贝数明显下降。表明haS-miR-29c对HBV DNA具有抑制作用。检测结果见(图3A)(2)对H印G2. 2. 15细胞培养上清中HBsAg、HBeAg表达的影响如同(1)所述的方法，终浓度为ΙΟμπιοΙ/L的pS-miR19c或 pSilencer3. 1-control空质粒转染H印G2. 2. 15细胞，转染方法同实施例5。转染后48h，收集培养液上清200 μ L，利用ELISA试剂盒检测HBV HbsAg和HbeAg。测步骤简要如下设空白对照1孔，阴、阳性对照各2孔，分别加阴、阳性对照各50ul和50ul待测样本于相应孔内； 除空白对照孔外，每孔加1滴(50ul)酶标记物，轻轻振荡，用透明胶条将板孔封好；37°C水浴30分钟；扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置20秒，扣去洗涤液，重复4次后在吸水纸上拍干；每孔加入底物液A，B各1滴，轻轻振荡封板后，置37°C水浴15分钟；每孔加终止液1滴，用酶标仪检测(波长450nm)各孔OD值(空白孔调零)。结果为3次实验的平均值。ELISA检测结果显示，与对照相比，转染了 has-miRj9C表达载体的H印G2. 2. 15细胞，其上清中HBsAg和HBeAg表达量明显下降(图!3B，3C)。实施例8 :CCK8检测细胞增殖H印G2. 2. 15细胞以每孔2 X IO4个细胞的浓度接种于96孔板，常规培养20h后，细胞生长至对数增殖期。每孔加入IOul CCK-8溶液，检测转染前细胞的吸光度值，弃去各孔原培养液，，进行转染，转染方法同实施例5。分别加入pS-miR-29c或pSilencerf. 1-control 空载体至各组细胞(同时设立未经处理的对照组细胞)，每孔终体积为100 μ L。各实验组均设三孔重复。继续培养Mh，48h，7ai后，各孔加入IOul CCK-8溶液孵育4h。酶标仪检测 450nm波长下各孔吸光值(A)。结果为三次实验的平均值。实验结果发现在H印G2. 2. 15中过表达miRj9C实验组，48h后细胞的生长被抑制率 2倍，而在7 后肿瘤细胞不再被抑制。说明miR-29c可以短期内抑制肿瘤细胞的生长(图4)。实施例9 靶基因表达差异的检测(1) RT-PCR检测靶基因在mRNA水平上的表达差异has-miRj9C表达载体转染H印G2. 2. 15细胞，转染方法同实施例5，转染后48h，利用Trizol法提取细胞的总RNA。提取方法同实施例1，紫外吸收测定法和甲醛变性电泳检测总RNA的浓度和纯度后，利用试剂盒将所提总RNA进行cDNA的合成。反应体系QOul)如下总RNA 100pg_lug，5X逆转录反应缓冲液如1，逆转录酶 lul, Oligo (dT) lul, DEPC水补足到20ul。将上述体系混勻，PCR仪上进行逆转录，反应条件:37°C 15min，98°C 5min，4°C 保存。再以cDNA为模板，对靶基因进行RT-PCR。反应体系QOul)如下2X反应缓冲液IOul，IOuM上游引物0. ^l，10uM下游引物Ojul，cDNA lul，EDPC水8. 2ul。反应条件 940C 2min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s，30 个循环；72°C 5min，4°C保存。以 β-actin 为靶基因的内参对照。RT-PCR结果表明，与对照相比，转染了 haS-miRj9C的靶基因在mRNA水平表达降低。检测结果见图5A。(2) Western检测靶基因在蛋白水平上的表达差异利用Western检测靶基因在蛋白水平上的表达差异，检测步骤简述如下收集实施例5中经处理的各组细胞至Ep管中，PBS洗涤两次。各管中加入100 μ L细胞蛋白裂解液，冰上孵育30min (每隔5min轻弹混勻)。12000rpm，4°C离心5min，取上清至新Ep管中 (20yL/管)，-80°C保存备用。用洗洁精清洗玻璃板，流水冲净，再用酒精棉球擦洗，晾干。 按照说明书安装好灌胶的装置，在IOOmL小烧杯内配制分离胶(10% )，沿高玻璃板倒胶至矮玻璃板的大约3/4(注意不要有气泡)，接着加满双蒸水。待30min后分离胶凝聚，用吸水纸吸净上层水，再灌积层胶(5% )，插入梳子。待积层胶凝聚后，将凝胶放入电泳槽中安装好，矮玻璃板在内，高玻璃板在外，加入IXSDS电泳缓冲液，液面超出矮玻璃。小心拔出梳子，注意不要有气泡。取各组细胞的裂解液100 μ L，各加入20 μ L 6XSDS上样缓冲液， 混勻。低分子量蛋白质Marker IOyL中加入2μ L 6 X SDS上样缓冲液，混勻。沸水中煮沸 3 5min，12000rpm离心lmin，冰上放置，上样。用缓冲液冲洗梳孔后，按顺序上样0fepG2 对照组、H印G2. 2. 15未处理组、pS-control组、pS_miR-29c组)每组样品设3个孔，7 μ L/ 孔。在胶的两侧分别加入3uL蛋白质分子量Marker(彩色)。稳压电泳，积层胶中电流为 60V，进入分离胶，电压增加至100V。电泳结束后，取出电泳装置，小心剥下凝胶，切下包含所有样品的三分之一胶，经考马斯亮兰染色，检测是否有目的蛋白条带，并切下剩余三分之二胶中各目的条带所在范围的凝胶。根据凝胶的大小剪4块Whatman滤纸和1块PVDF膜 (两者的大小不可超过凝胶)，将剪好的滤纸、PVDF膜(提前在甲醇中浸泡5-6min)、凝胶及转膜装置中的海绵置于转移缓冲液中浸泡3 5min。在海绵上依次放置两层滤纸、凝胶、 PVDF膜、两层滤纸。加紧海绵，放入转移槽内。(注意凝胶一侧靠近负极，PVDF膜一侧靠近正极)。电流400mA，稳流，4°C转移lh。转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，用铅笔在膜的上缘做好标记，切下Marker上样孔的所对应的膜的1/2，用丽春红染色3s，而后用水清洗，检查转膜是否完全。将其余的PVDF膜放在大小合适的杂交袋中，根据膜和袋的大小加入适量的封闭液，封口，室温封闭lh。在杂交袋上剪一小口，小心取出回收封闭液，不洗膜。在不同杂交袋内分别加入以封闭液按1 1000稀释的小鼠抗人Tnfaip3抗体和按 1 2000稀释的小鼠抗人β-actin抗体，37°C杂交lh，4°C杂交过夜。从杂交袋中小心取出PVDF膜，用洗膜液振荡洗涤3次，IOmin/次。再以TBS洗涤1次，lOmin。将PVDF膜分别与用TBST按1 10000稀释的羊抗鼠二抗室温孵育池。从杂交袋中小心取出PVDF膜，用洗膜液振荡洗涤3次，IOmin/次。在EP管中中加入适量ECL显色液A、B (1 1)配制好的溶液，均勻加到PVDF膜上，立即在暗室内显影。观察目的条带的变化趋势。Weatern结果表明，与对照相比，转染了 haS-miRj9C的靶基因在蛋白水平表达明显降低。检测结果见图5B。附参考文献1. V Ambros. The functions of animal microRNAs. Nature, 2004 ；431(7006) 350-355.2.Bartel DP. MicroRNAs :genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell,2004，116(2) :281-297.3. Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T.Identification of novel genes coding for smallexpressed RNAs. Science, 2001, 294 :853-858.4. Calin GA, Dumitru C D, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genesmiR15 and miR16 at 13ql4 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(24) :15524-15529.5. Michael M Z, Connor S M, van Hoist Pellekaan N G, et al. Reduced accumulation of specific microRNAs incolorectal neoplasia[J]. Mol Cancer Res, 2003,1(12) :882-891.6.Metzler M, WiIda M, Busch K, et al.High expression of precursor microRNA-155/BIC RNA in children withBurkitt lymphoma[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2004, 39(2) :167-169.7. Volinia S, Calin G A, Liu C G, Ambs S, Cimmino A, Petrocca F, et al. A microRNA expression sinature ofhuman solid tumors defines cancer gene targets[J], Proc Natl Acad Sci USA,2006,103 :2257-2261.8. Tang ZY. Hepatocellular carcinoma-cause, treatment and metastasis. World J Gastroenterol 2001 ；7 :445-454.9.Luo RH,Zhao ZX,Zhou XY,Gao ZL,Yao JL. Risk factors for primary liver carcinoma in chinesepopulation. World J Gastroenterol 2005 ；11 :4431-4434.10. Murakami Y, Yasuda T, Saigo K, Urashima T, Toyoda H, Okanoue T, et al. Comprehensive analysis ofmicroRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues[J] · Oncogene, 2006, 25 :2537-2545.11. Meng F, Henson R, Wehbe-Janek H, et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressorgene in human hepatocellular cancer[J]. Gastroenterology,2007，133 (2)，647-658.12. Gramantieri L, Ferracin Μ, Fornari F, et al. Cyclin Gl is a target of miR-122a, a microRNA frequentlydown-regulated in human hepatocellular
9carcinoma[J]· Cancer Res,2007,67(13) :6092-6099.13. Fabbri Μ, Garzon R, Cimmino A, et al. MicroRNA-29 family reverts aberrant methylation in lung cancer bytargeting DNA methyltransferases 3A and 3B.Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(40) :15805-15810.14. Mott JL,Kobayashi S,Bronk SF,Gores GJ. mir-29 regulates Mcl-I protein expression and apoptosis. Oncogene, 2007 ；26 :6133-6140.Pekarsky Y, Santanam U, Cimmino A, et al.Tcll expression in chronic lymphocytic leukemia is regulated bymiR-29 andmiR-181[J]. CancerRes,2006,66 11590-11593.
权利要求
1.小分子RNAhaS-miR-29c在制备治疗肝癌的药物中的应用。
2.小分子RNAhaS-miR-29c在制备抑制肝癌细胞生长的药物中的应用。
3.小分子RNAhaS-miR-29c在制备抑制HBV感染的药物中的应用。
4.小分子RNAhas-miR19C在制备预防肝癌的药物或保健品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个与HBV相关肝癌相关的小分子RNA has-miR-29c在抑制HBV感染和防止肝癌发生等方面的用途，属于生物技术研究领域。本研究利用qRT-PCR技术发现与肝细胞系HepG2相比，has-miR-29c在肝癌细胞系HepG2.2.15中表达下调。利用生物信息学方法和双荧光检测确定了has-miR-29c的靶基因为Tnfaip3。体外转染has-miR-29c表达载体，观察到miR-29c可短期内抑制肿瘤细胞的生长，并对HBV DNA复制和表达有一定的抑制作用，靶基因Tnfaip3在mRNA和蛋白水平均表达下调。研究结果表明miR-29c可能通过其靶基因Tnfaip3参与了HBV相关肝癌的发生发展过程中，它可作为抑制HBV感染和防止肝癌发生的调控分子，从而为临床预防和治疗提供理论和实验依据。
文档编号A61K31/7105GK102188718SQ20111005835
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者刘玉刚, 孙汶生, 王春梅, 王燕, 范春光 申请人:山东大学