专利名称：β抑制蛋白1、其片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及0抑制蛋白I或其片段或变异体，它们的编码核酸、重组载体、宿主细胞，以及包含它们的药物组合物。本发明还涉及制备本发明3抑制蛋白I或其片段或变异体的方法。另一方面，本发明涉及P抑制蛋白I或其片段或变异体在治疗或预防PPARY介导的疾病中的应用，以及P抑制蛋白I或其片段或变异体在制备治疗或预防PPAR Y介导的疾病的药物中的应用，所述疾病具体是肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症。本发明还涉及一种筛选治疗或预防肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症的药物的方法。
背景技术：
肥胖症的发病率的不断增加是一个严重的世界性问题。在美国，只有约三分之一的成年人被认为是正常的体重，并且可以观察到类似的趋势正在全球范围内蔓延。肥胖被 认为是胰岛素抵抗，2型糖尿病和心血管疾病的主要危险因素。据统计，2009年全世界约有2. 85亿人患有糖尿病，而到了 2030年这一数字预计将增加至4. 35亿。脂肪组织的异常积累，脂肪组织中的巨噬细胞浸润和炎症反应是肥胖的主要病理特征。此外，许多研究表明，脂肪组织控制体脂平衡，从而调节全身葡萄糖和脂质代谢平衡。肥胖引起的炎症反应被认为是一个潜在的机制将肥胖与相关疾病如胰岛素抵抗，心血管疾病，2型糖尿病和其他免疫系统疾病联系起来。然而，肥胖发生的细胞和分子机制是非常复杂，目前的研究还没有完全揭示清楚。脂肪组织是一个重要的代谢器官，对整个人体胰岛素敏感性和能量平衡至关重要。脂肪细胞的发育对人类疾病有许多影响。目前最大的一类健康问题与肥胖相关，其中大部分是由过多的脂肪细胞堆积引起的。脂肪细胞的发育生成是一个多步骤的过程，大量标志性基因的表达调控着脂肪细胞的生成。在脂肪细胞生成的过程中，成纤维细胞样的前体脂肪细胞分化成包涵脂滴和具有胰岛素敏感性的脂肪细胞。这一过程发生在几个阶段，并且涉及到一系列的转录因子级联反应，其中过氧化物酶体增殖物激活受体Y (PPARy)被认为是脂肪细胞发育生成的重要决定因素。在肥胖的小鼠模型和人类患者中，白色脂肪组织是巨噬细胞浸润的一个重要目标，而这一浸润会导致体质指数(BMI)比例上升和脂肪细胞的肥大。在脂肪组织中的这一群巨噬细胞可能会提高“低水平”慢性炎症与肥胖的发生。巨噬细胞在脂肪组织中积累也确实增加了循环系统中一些炎症细胞因子的浓度。而炎症分子可能正是分子水平联系脂肪组织和整体代谢，心血管，肝脏方面的肥胖并发症的‘链接’。特别是，激活的巨噬细胞会增加肿瘤坏死因子a (TNF-a)、白介素6(IL_6)和抗胰岛素蛋白的水平进而直接造成脂肪堆积导致的胰岛素敏感性的变化。过氧化物酶体增殖物激活受体Y (PPARy)作为一个有转录调控功能的核受体，是调控脂肪细胞分化和巨噬细胞的功能的关键分子。PPARy与9顺式维甲酸(9-cis-RA)受体(RXR)可以形成二聚化的复合体，结合在PPAR Y反应元件上，招募各种不同的辅助因子介导下游基因的转录调控。PPARy的激活可以介导一系列PPARy的下游靶基因，包括脂肪细胞的蛋白质、脂肪酸转运蛋白、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂肪酶、甘油激酶等基因的表达(1，2)。这些脂肪细胞的特异性基因的表达导致游离的脂肪酸进入脂肪细胞和其他组织
(3)。在活化的巨噬细胞中，激活的PPARy可以通过调节免疫反应基因的转录来抑制炎症反应(4)。通过这些方式，PPARy调控着脂肪细胞和巨噬细胞功能，有助于实现整个人体能量平衡，并已成为研究肥胖和糖尿病的中心焦点。传统上，^抑制蛋白分为P抑制蛋白I和P抑制蛋白2，它们是G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路中重要的负调控因子，可以介导G蛋白偶联受体的脱敏和内吞。最近的研究表明，P抑制蛋白除了对GPCR的那些经典功能之外，还可以结合不同的信号通路分子，作为一个多功能的蛋白质复合物(5-8)行使功能。我们最近的研究发现，主要定位于细胞质中的P抑制蛋白2，在胰岛素刺激下，可以作为一个不可缺少的支架，链接Akt和Src以及胰岛素受体(IR)，介导胰岛素信号通路 中的信号复合物(IR/Akt/P-抑制蛋白2/Src)的形成，而这一复合物对胰岛素信号的传递以及胰岛素代谢功能的行使起了至关重要的作用。并且P抑制蛋白2的敲除增加了胰岛素的抵抗(9)。而P抑制蛋白1和P抑制蛋白2显不不冋的亚细胞定位。刺激后，@抑制蛋白I可以转运到细胞核，调节基因转录(10)。
发明内容
在本发明中，我们发现在细胞核内，@抑制蛋白I与PPARy的相互作用负调控PPARy的转录活性，从而抑制PPAR Y下游的基因，特别是脂肪细胞生成相关基因和炎症反应基因的表达，从而抑制脂肪细胞形成和炎症反应。在动物中敲除P抑制蛋白I会影响PPAR y介导的脂代谢相关基因和炎症反应相关基因的表达，进而促进饮食引起的肥胖症的发生；而在动物体内过表达3抑制蛋白I可以抑制脂肪细胞生成和巨噬细胞的侵入，进而防止食物引发的肥胖症以及改善葡萄糖耐受和整体胰岛素的敏感性。同时，不结合PPAR Y的3抑制蛋白I的突变体不能抑制PPAR Y介导的脂肪细胞生成相关基因和炎症反应基因的表达，因而无法防止发生饮食诱导的肥胖。另外，本发明还令人惊讶地发现了一系列短肽TS1、TS3、Parr2M、T18、T16、T14、Tll 和 MD6，TSl 由 ^ 抑制蛋白 I 上与 PPAR Y 结合结构域结合的20个氨基酸(氨基酸残基246-265)组成，TS3由P抑制蛋白I上TSl内的12个氨基酸(氨基酸残基253-264)组成，P arr2M为P抑制蛋白2的Q256、L257、Q259、Q262和S264氨基酸残基用P抑制蛋白I的M255、E256、A258、T261和A263替代产生的突变体，T18由P抑制蛋白I上TS I内的18个氨基酸(氨基酸残基248-265)组成，T16由@抑制蛋白I上TS I内的16个氨基酸(氨基酸残基250-265)组成，T14由P抑制蛋白I上TS I内的14个氨基酸(氨基酸残基252-265)组成，Tll由P抑制蛋白I上TSl内的11个氨基酸(氨基酸残基255-265)组成，MD6由P抑制蛋白I上TSl内的6个氨基酸(氨基酸残基255-260)组成。这些短肽与PPAR Y的相互作用能够负调控PPAR Y的转录活性，从而抑制PPAR y下游的基因，特别是脂肪细胞生成相关基因和炎症反应基因的表达，从而抑制脂肪细胞形成和炎症反应。这种短肽的发现使得在产业上能够更方便地制备并且在临床上能够更方便地使用这种治疗/预防性肽或其编码核酸、重组载体或宿主细胞，并且能更有效地实现与PPAR Y的相互作用。
基于以上发现，本发明提供一种分离多肽。在一个优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ ID NO :3或由其组成。在另一个优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ IDN0:13或由其组成。在另一优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ ID NO :1或由其组成。在另一优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ ID NO: 10或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明分离多肽包含SEQ ID NO :67-71中任一项所述序列或由其组成。在优选实施方式中，本发明提供一种多肽，其包含与SEQ ID NO :3的序列相同性为约99. 8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99. 5%的氨基酸序列，所述多肽中与SEQ ID NO 3的253-264相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO 3的246-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO 3的248-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO 3的250-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨 基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO 3的252-265相对应的位置上包含与SEQ IDNO 3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO 3的255-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO :3的255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基。例如，本发明提供一种多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :10或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽能够与PPAR Y特异性结合，优选抑制PPAR Y的活性。在一个实施方式中，本发明多肽可以包含或不包含本领域已知的标签或信号肽，例如HA标签或Flag标签或TAT标签。本发明多肽还包括3抑制蛋白I或其片段、衍生物和类似物。本发明多肽的长度可以是6个氨基酸残基、9个氨基酸残基、12个氨基酸残基、15个氨基酸残基、20个氨基酸残基、30个氨基酸残基、50个氨基酸残基、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或更多个氨基酸残基，或其间任何范围。在一个实施方式中，本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID N0:14所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID NO :5所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID NO :7所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID NO :12所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。本发明多肽包含在严谨条件下与SEQ ID NO :73-77中任一项所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的部分或由其组成。在另一个实施方式中，本发明多肽由SEQ IDNO :14所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO :5所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO :7所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO: 12所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO :73-77中任一项所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在另一个实施方式中，本发明多肽由包含SEQ ID NO 14所示多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由包含SEQ ID NO :5所示多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由包含SEQ ID NO :7所示多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。在另一个优选实施方式中，本发明多肽由包含SEQ ID N0:12所不多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。在另一个实施方式中，本发明多肽由包含SEQ IDNO 73-77中任一项所示多核苷酸的等位基因或天然突变体的核酸所编码。在一个实施方式中，本发明多肽包含由SEQ ID NO :1、10、13、67_71中任一项所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生的氨基酸序列，或由其组成的多肽。在一个优选实施方式中，本发明多肽包含由SEQ ID NO :3所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生的氨基酸序列，或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明多肽能够与PPARy特异性结合，优选抑制PPAR y的活性。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码本发明所述的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO :1的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码氨基酸序列为SEQID NO 3,10或13的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO :67-71中任一项的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码包含与SEQ ID NO :3的序列相同性为约 99. 8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99. 5%的氨基酸序列的多肽，所述多肽中与SEQ ID NO 3的氨基酸255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基，优选地，所述多肽中与SEQ ID NO :3的氨基酸246-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO 3的248-265相对应的位置上包含与SEQ IDNO 3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO 3的250-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO :3的252-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO 3的255-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基；优选地，所述多肽中与SEQ ID NO :3的255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基；例如，所述多肽可以包含氨基酸序列SEQ ID N0:10或由其组成。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其包含与SEQ ID NO 7的序列相同性为约99. 8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99. 5%的核苷酸序列。例如,本发明提供一种核酸,其包含核苷酸序列SEQ ID NO 120在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其在严谨条件下与SEQ ID NO :7或12杂交，且与SEQID NO 7或12的互补性为约99. 8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99. 5%。在一个优选实施方式中，本发明提供一种核酸，其包含SEQ ID N0:14或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明核酸包含SEQ ID NO :5或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明提供一种核酸，其包含SEQ ID NO :7或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明核酸包含SEQ ID N0:12或由其组成。在一个优选实施方式中，本发明核酸包含SEQ IDNO 73-77中任一项或由其组成。在一个实施方式中，本发明核酸可以包含或不包含本领域已知的标签或信号肽的编码序列，例如HA标签或Flag标签或TAT标签的编码序列。本发明核酸的长度可以是18个、27个、36个、45个、60个、90个、150个、300个、450个、600个、750个、900个、1050个、1200个、1350个或更多个核苷酸残基，或其间任何范围。
在一个实施方式中，本发明提供一种重组载体，其包含本发明的核酸。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在原核细胞中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在真核细胞中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在大肠杆菌中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在酵母中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在动物细胞中表达的载体，例如杆状病毒载体。更优选地，本发明提供的重组载体可以包含适合在高等动物细胞，例如鸡细胞、牛细胞、猪细胞、犬细胞、猫细胞、马细胞、羊细胞或人细胞中表达的载体，例如腺病毒载体。具体说，本发明提供的重组载体可以包含腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、HIV病毒载体或pShuttIe-CMV 载体。在一个实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的重组载体，所述重组载体可以整合或不整合到所述宿主细胞的基因组内。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是原核细胞。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是真核细胞。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。在另一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是酵母细胞。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是昆虫细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞；具体可以是草地贪夜蛾(Spodoptera fruRiperda)细胞、鸡细胞、牛细胞、猪细胞、犬细胞、猫细胞、马细胞或人细胞。在一个优选实施方式中，本发明提供的宿主细胞是人细胞系，例如J1EK293细胞系。另一方面，本发明还提供一种制备本发明多肽的方法，其依次包括以下步骤i)培养本发明宿主细胞，ii)诱导其表达，iii)收获表达产物，和iv)任选地，纯化表达产物。在一个实施方式中，本发明方法还包括用本发明重组载体转化或转导宿主细胞的步骤。在另一个实施方式中，本发明方法还包括将本发明核酸可操作地连接到载体中的步骤。另一方面，本发明还提供一种在对象中治疗或预防PPARy介导的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明多肽给予对象。本发明还提供一种在对象中治疗或预防PPARy介导的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明核酸给予对象。本发明还提供 一种在对象中治疗或预防PPARy介导的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明重组载体给予对象。另一方面，本发明还提供一种药物组合物，其含有有效量的本发明多肽以及药学上可接受的运载体或赋形剂。另一方面，本发明还提供一种药物组合物，其含有有效量的本发明核酸以及药学上可接受的运载体或赋形剂。另一方面，本发明还提供一种药物组合物，其含有有效量的本发明重组载体以及药学上可接受的运载体或赋形剂。本发明的药物组合物可用于预防或治疗PPAR Y介导的疾病。另一方面，本发明还提供本发明多肽、核酸或重组载体在制备用于治疗或预防PPARy介导的疾病的药物中的应用。又一方面，本发明还提供P抑制蛋白I、其编码核酸或重组载体在制备用于治疗或预防PPARy介导的疾病的药物中的应用。
具体说，本发明所述的PPAR Y介导的疾病可以是肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症，例如II型胰岛素抵抗性糖尿病。本发明提供一种在体外或体内抑制PPARy活性的方法，所述方法包括应用本发明所述的多肽、核酸或重组载体。本发明还提供一种筛选治疗或预防肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症的药物的方法，所述方法包括待筛药物与PPAR Y相接触和测定PPAR y活性的步骤，如果接触后PPAR Y活性降低则将该待筛药物鉴定为治疗或预防肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症的药物。此外，文发明还提供一种筛选特异影响PPAR Y和RXRa相互作用的小分子化合物的方法，所述方法包括步骤i)构建表达全长的PPAR Y或PPAR S与转录激活结构域的融合蛋白，产生含转录激活结构域的PPAR Y和PPARS质粒；ii)构建全长的RXRa与另一转录调控因子的DNA结合结构域的融合蛋白，产生含所述DNA结合结构域的RXRa质粒；iii)构建含报告基因的质粒，所述报告基因含ii)中所述转录调控因子的结合元件；iv)将i)、ii)、iii)中所述质粒转染进宿主细胞；v)转染后检测iv)中所述细胞中报告基因的表达；vi)以PPAR S与RXR a的相互作用作为对照，筛选特异影响PPAR Y和RXR a相互作用的 小分子化合物。在一个实施方式中，步骤i)中所述转录激活结构域为VP16转录激活结构域。在一个实施方式中，步骤ii)和iii)中所述转录调控因子是Gal4。在一个实施方式中，步骤iii)中所述报告基因为荧光素酶。在一个实施方式中，步骤iv)中所述细胞为293细胞。
图I.喂食正常饲料(RD)或高脂饲料(HFD) 18周的@ arrl-tg小鼠(Tg)、3arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的体重变化(每组n=10)。图2.喂食正常饲料(RD)或高脂饲料(HFD) 14周的@ arrl-tg小鼠(Tg)、3arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的体重增加值(每组n=10)。图3.喂食正常饲料(RD)或高脂饲料(HFD) 14周的@ arrl-tg小鼠(Tg)、3arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的体长值(每组n=10)。图4.喂食RD或HFD的^ arrl-tg小鼠(Tg)、^ arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的血液中甘油三酯(TG)(左)和游离脂肪酸(NEFA)(右)的含量(每组n=10)。图5.喂食RD或HFD 14周后，核磁共振分析的P arrl-tg小鼠(Tg)、P arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的瘦体重和脂肪含量(每组n=10)。图6.喂食RD或HFD的^ arrl-tg小鼠(Tg)、^ arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的白色脂肪组织的H & E染色石蜡包埋切片的显微照片(图例，200微米)。图7.喂食RD或HFD的^ arrl-tg小鼠(Tg)、^ arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的白色脂肪组织的脂肪细胞直径。图8.在葡萄糖耐受试验(GTT)(左)和胰岛素耐受试验(ITT)(右)中，正常饲料喂养时P arrl-tg小鼠(KO)与野生型小鼠(WT)的血糖水平的时程变化。图9.在葡萄糖耐受试验(GTT)(左)和胰岛素耐受试验(ITT)(右)中，正常饲料喂养时P arrl-ko小鼠(KO)与野生型小鼠(WT)的的血糖水平的时程变化。
图10.在 RD 和 HFD 处理 14 周之后，P arrl-tg 小鼠(Tg)、P arrl-ko 小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的血糖水平。图11.在 RD 和 HFD 处理 14 周之后，P arrl-tg 小鼠(Tg)、P arrl-ko 小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的血液胰岛素水平。图12.在葡萄糖耐受试验(GTT)中，高脂饮食饲养的P arrl-tg小鼠(Tg)和野生型小鼠(WT)的血糖水平(左)和血液胰岛素水平(右)的时程变化。图13.在胰岛素耐受试验(ITT)中，高脂饮食饲养的P arrl-tg小鼠(Tg)和野生型小鼠(WT)的血糖水平的时程变化。图14.在葡萄糖耐受试验(GTT)中，高脂饮食饲养的P arrl-ko小鼠(KO)和野生 型小鼠(WT)的血糖水平(左)和血液胰岛素水平(右)的时程变化。图15.在胰岛素耐受试验(ITT)中，高脂饮食饲养的P arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的血糖水平的时程变化。图16.在高胰岛素-正糖钳夹实验中，在基础状态(A)和钳夹状态(B)时正常饮食或高脂饮食处理的@ arrl-ko小鼠(KO)与野生型小鼠(WT)的肝糖输出水平；以及KO小鼠与WT小鼠在正常饮食和高脂饮食处理后整体葡萄糖清除率(GDR) (C)和葡萄糖输注率(GIR) (D)的变化。图17.喂食HFD的^ arrl-tg小鼠(Tg)、^ arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)白色脂肪组织的石蜡切片，用抗F4/80抗体做免疫组化(图例，200微米)。图18. ELISA 法测定喂食 RD 或 HFD 的 ^ arrl-tg (Tg)小鼠、^ arrl-ko (KO)小鼠和野生型小鼠(WT)的血清中炎症细胞因子TNF- a (左)、IL-6 (中)和MCP-I (右)的分泌水平(每组n=10)。数据与相应的野生型比较，并显示为平均值土平均标准误，*表示P〈0.05。图19.在 3 arrl-tg 小鼠(Tg)、@arrl_ko 小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的 MEF在向脂肪细胞分化第4天，用RT-qPCR检测细胞中多种基因的mRNA水平。数据与相应的野生型比较，并显示为平均值土平均标准误。图20. RT - qPCR检测@ arrl-ko小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的原代培养巨噬细胞中几种炎症因子的mRNA水平(LPS :内毒素；Ro :罗格列酮)。数据与相应的野生型比较，并显示为平均值土平均标准误。图21.用输入DNA的百分比表示的PPAR Y、RXR a和NCoR在Nos2和CD36基因启动子上的结合。数据显示为平均值土平均标准误，*表示P〈0. 05。图22.在C57BL/6小鼠白色脂肪组织(WAT)细胞裂解液中用抗P抑制蛋白I和抗RXR a的抗体进行的免疫沉淀后，用PPAR Y、RXR a和0 arr的抗体杂交获得的Western印迹图。图23.在@抑制蛋白I转基因小鼠arrl-tg，Tg)、^抑制蛋白I基因敲除小鼠(@arrl-ko，K0)和野生型小鼠(WT)白色脂肪组织(WAT)细胞裂解液中用抗PPAR Y抗体进行免疫沉淀后，用RXRa和PPAR Y的抗体杂交获得的Western印迹图。图24.在共表达Flag标签的PPAR y或RXR a和HA标签的@抑制蛋白I或3抑制蛋白2的HEK293T细胞裂解液中免疫沉淀Flag标签，然后通过免疫印迹显示沉淀的复合体中的PPAR Y、RXR a和P抑制蛋白。
图25.通过体外拉下实验显示的P抑制蛋白I和P抑制蛋白2与PPARy和PPAR 6的相互作用。图26PPARY不同部分的图示(上)，以及通过拉下实验显示的P抑制蛋白I和^抑制蛋白2与PPARy不同部分的相互作用(下)。图27. —系列P抑制蛋白I的截短突变体的图示(上)，以及使用这些P抑制蛋白I的截短突变体与PPAR Y的免疫共沉淀实验结果。图28. PPARy与@抑制蛋白I、^抑制蛋白2及其突变体的相互作用。在共表达Flag标签的PPAR Y和HA标签的P抑制蛋白I或P抑制蛋白2的HEK293T细胞裂解液中用抗Flag的抗体做免疫沉淀。PPARy和P抑制蛋白通过免疫印迹显示。P抑制蛋白I相互作用发生的核心位置与P抑制蛋白2对应的位置显示在图上方。图29.从 mRNA 水平上看，^ arrl> ^ arr2M> ^ arr2 或 0 arr IM 的表达对 LPS 刺激后罗格列酮对Nos2、IL-6、TNF- a和⑶36的转录抑制作用的影响。 图30. PPARy、RXR a和NCoR在Nos2和CD36基因启动子上的结合。使用抗PPAR Y，抗RXR a或抗NCoR的抗体做染色质免疫沉淀，分析过表达P抑制蛋白1，^抑制蛋白2或它们突变体的原代培养的巨噬细胞。沉淀得到的DNA用RT - qPCR检测，结果用输入DNA的百分比表示，并显示为平均值土平均标准误，*表示P〈0. 05。图31.核磁共振分析注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠经高脂饮食处理后的脂肪含量(左)和体重(右)的变化(每组ri=6)。图32.对注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料(每组n=6)后，白色脂肪组织和肝脏的H&E染色照片，以及白色脂肪组织石蜡切片后用抗F4/80抗体得到的免疫组化照片(图例，200微米)。图33.对注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料(每组n=6)后，脂肪细胞的直径变化。图34.注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料后，肝脏的甘油三酯含量(表示为每克肝组织重量所含的甘油三酯的量)(左)和脂肪组织中巨噬细胞浸润(ATM)比例(由多张图片中F4/80染色阳性细胞与总细胞数的比值表示)(右)(每组n=6)。数据显示为平均值土平均标准误，*表示P〈0. 05。图35.注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料后，血清中甘油三酯(左)、游离脂肪酸(中)及总胆固醇(右)的含量。图36.注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料后，血清中瘦素(左)和脂连蛋白(右)的含量。图37.注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠喂食高脂饲料后，血清中炎症因子TNF- a (左)、IL-6 (中)和MCP-I (右)的分泌水平。图38. RT-qPCR检测注射相应腺病毒的C57BL/6小鼠(每组n=6)白色脂肪组织中多种蛋白的mRNA水平。数据与相应的对照小鼠比较，并显示为平均值土平均标准误，*表示 P〈0. 05。图39.注射0抑制蛋白I、P arrlM、^抑制蛋白2、P arr2M对血糖和胰岛素水平的影响。图40.通过GTT实验(I. 5克每公斤体重)和ITT实验(I. 5单位每公斤体重)测定，注射P抑制蛋白I、P arrlM、^抑制蛋白2、P arr2M对血糖水平的影响。图41.在册1(2931'细胞中共表达？1&8标签的？ 41 ￥和HA标签的P抑制蛋白1，在细胞裂解液中加入不同浓度的人工合成短肽TSl和TS3处理后免疫沉淀Flag标签，然后通过免疫印迹显示的沉淀复合体中的PPARy和P抑制蛋白I。图42. TSl和TS2在荧光素报告基因实验中对PPARy转录活性的影响。图43.在共表达Flag标签的PPAR Y和HA标签的@抑制蛋白I的HEK293T细胞中加入不同浓度的TSl或TS2处理后，在细胞裂解液中免疫沉淀Flag标签，然后通过免疫印迹显示的沉淀复合体中的PPARy和P抑制蛋白I。图44.通过[35S] RXR a的放射性自显影表明，TSl和TS2对PPAR y和RXR a结合的影响。
图45.用编码TSl或TS2的两次重复的慢病毒载体感染细胞后，细胞内脂肪含量的变化。图46.用编码TSl或TS2的两次重复的慢病毒载体感染细胞后，PPAR Y/RXR a复合物在DNA上的结合。图47.用编码TSl或TS2的两次重复的慢病毒载体感染细胞后，脂肪细胞分化基因的表达。图48. LPS刺激后罗格列酮的处理引起过表达TSl或TS2的原代培养的巨噬细胞中Nos2和⑶36表达水平的变化。图49. Fabp4启动子驱动的编码核定位序列(NLS)和TSl或TS2的重复序列的融合蛋白的腺病毒载体的结构(左图)和转染后P arrU TSl和TS2的mRNA表达水平(右图)。图50.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSI和TS2和空载体对照的小鼠的体重。图51.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSl和TS2和空载体对照的小鼠的脂肪量。图52.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSI和TS2和空载体对照的小鼠的脂肪细胞大小。图53.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSl和TS2和空载体对照的小鼠的白色脂肪组织和肝脏的H&E染色照片，以及白色脂肪组织石蜡切片后用抗F4/80抗体得到的免疫组化照片。图54.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSl和TS2和空载体对照的小鼠肝脏中的甘油三酯水平。图55.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSl和TS2和空载体对照的小鼠脂肪组织中巨噬细胞的浸润(ATM)比例。图56.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSl和TS2和空载体对照的小鼠血清中TNF- a、IL-6和MCP-I的水平。图57.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSl和TS2和空载体对照的小鼠血清中甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(NEFA)及总胆固醇的含量。
图58.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSl和TS2和空载体对照的小鼠血清中的瘦素水平。图59.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSl和TS2和空载体对照的小鼠血清中PPAR y及其下游基因和脂肪细胞免疫反应基因的表达水平。图60.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，表达TSl和TS2和空载体对照的小鼠血液中胰岛素(上)和葡萄糖的水平(下)。图61.将相应腺病毒载体静脉注射入野生型小鼠体内并饲喂高脂饮食后，通过GTT实验(中)和ITT实验(右)测定表达TS I和TS2和空载体对照的小鼠的血糖水平的时程变化。图62.通过光学表面等离子共振(SPR)实验检测多肽TSl对PPARy-LBD与 RXR a -LBD相互作用的影响。将PPAR y -LBD与多肽TSl或TS2室温孵育后注射通过标记有RXRa-LBD的芯片表面，未与多肽孵育过的为对照。图63.筛选与PPAR y -LBD结合的不同多肽(图A)，以及不同浓度MD6对PPAR y -LBD与RXR a -LBD相互作用的影响(图B)。以HA多肽为对照，通过光学表面等离子共振(SPR)实验分析不同多肽与PPARy-LBD结合的性质。不同的多肽序列排列在图A的右边。图64.用Tat标签的多肽Tat-HA，Tat-TSl或Tat_MD6孵育培养细胞后，细胞内脂肪含量的变化。图65.用Tat标签的多肽Tat-HA，Tat-TSl或Tat_MD6孵育培养细胞后，PPAR y(A)jRXRa (B)和NCoR (C)在DNA上的结合，D显示用Tat标签的多肽Tat-HA，Tat_TSl或Tat-MD6孵育培养细胞后，细胞中脂肪细胞分化基因的表达。
具体实施例方式I.定义如本文所用，术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……组成”的含义，例如“包含” X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。如本文所用，术语“分离”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离的。如本文所用，术语“疾病”和“病症”可互换使用，它们均反映损害正常功能、通常通过体征和症状表现、并引起人或动物的寿命或生活质量降低的人或动物体或其部分之一的异常状态。本文所用术语“PPARY相关的疾病或病症”指有关PPAR Y的任何疾病状态，包括但不限于代谢紊乱导致的疾病，炎症或癌症，例如糖尿病、肥胖症等(11，12)。如本文所用，术语“ P抑制蛋白”是G蛋白偶联受体(GPCR)信号通路中重要的负调控因子，分为P抑制蛋白I (其氨基酸序列为SEQ ID NO 3)和P抑制蛋白2 (其氨基酸序列为SEQ ID NO 4)。根据BlastP的计算，这两种蛋白质的氨基酸序列相似性为88%，且集中在蛋白质的氮端结构域上。如本文所用，提到多肽时，术语“片段”指基本上保持与本发明天然P抑制蛋白I相同的生物学功能或活性(例如与PPAR Y相互作用)的肽，例如天然P抑制蛋白I的一部分。所述片段优选包含SEQ ID N0:l、3、10、13或67-71中任一项，例如，包含与SEQ IDNO :3全长相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO 3的氨基酸253-264相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO 3的氨基酸246-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO 3的氨基酸248-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO 3的氨基酸250-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO 3的氨基酸252-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基，优选在与SEQID NO 3的氨基酸255-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO :3的氨基酸255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基。本发明优选的多肽选自(I) SEQ ID NO:3的长6-409个，优选6-70、6-60、6-50、6-40或6-30个氨基酸残基的片段，所述片段含有SEQ ID N0:l、3、10、13和67-71中任一项所示的氨基酸序列；(2)在(I)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且
保留SEQ ID NO :3的生物学活性的由(I)衍生的多肽，其中，所述取代、缺失或添加不出现在 SEQ ID NO 71 中，优选不出现在 SEQ ID NO :1、13、67_70 中。如本文所用，提到核酸时，术语“片段”指其翻译产物基本上保持与本发明天然3抑制蛋白I相同的生物学功能或活性(例如与PPAR Y相互作用)的核酸，例如天然P抑制蛋白I编码核酸的一部分。所述片段的翻译产物优选包含SEQ ID NO :1、3，10、13或67-71中任一项，例如，包含与SEQ ID NO 3全长相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO 3的氨基酸253-264相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ IDNO 3的氨基酸246-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO :3的氨基酸248-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO :3的氨基酸250-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO :3的氨基酸252-265相对应的位置上包含与SEQ ID NO 3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO :3的氨基酸255-265相对应的位置上包含与SEQID NO :3相同的氨基酸残基，优选在与SEQ ID NO :3的氨基酸255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基。所述片段的翻译产物优选自(1)SEQID N0:3的长6-409个，优选6-70、6-60、6-50、6-40或6_30个氨基酸残基的片段，所述片段含有SEQ IDNO :1、3、10、13和67-71中任一项所示的氨基酸序列；(2)在(I)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO 3的生物学活性的由(I)衍生的多肽，其中，所述取代、缺失或添加不出现在SEQ ID NO :71中，优选不出现在SEQ ID N0:l、13、67-70 中。本文所用术语“变异体”可以是天然P抑制蛋白I或其编码核酸的功能性类似物、衍生物、突变体、遗传变异体、简并变异体、在严谨条件下杂交的变异体等，还包括通过本领域已知方法获得的本发明多肽或核酸的变化形式。本文所用术语“衍生物”可以是基本上保持与本发明天然P抑制蛋白I相同的生物学功能或活性(例如与PPARy相互作用)的天然P抑制蛋白I的衍生蛋白，其中(i)一个或多个保守或非保守性氨基酸残基被取代(优选保守性取代)，(ii) 一个或多个氨基酸残基缺失(优选保守性缺失)；或(iv)在原有氨基酸序列内或序列外添加一个或多个氨基酸残基(优选保守性添加)。优选的，发生改变的氨基酸残基数目有至多10个、较佳地至多8个、更佳地至多5个、最佳地至多3个，最佳地至多I个。“保守性取代”是利用具有相似侧链的一种氨基酸残基替代另一种氨基酸残基。具有相似侧链的家族在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(也称为碱性氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(也称为酸性氨基酸，例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(也称为非极性氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有3 -分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸 (也称为芳族氨基酸，例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如HA或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。本文所用术语“类似物”可以是基本上保持与本发明天然P抑制蛋白I相同的生物学功能或活性(例如与PPAR Y相互作用)的肽的类似物，例如天然P抑制蛋白I的类似物，例如，它可包含与SEQ ID NO 3的序列相同性为约99. 8%以下，例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99. 5%的氨基酸序列。这些类似物与天然P抑制蛋白I的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导的遗传变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术得到。这种类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y -氨基酸)的类似物。本文所用术语“核酸”可以指DNA或RNA。DNA包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。例如，编码区序列可以是SEQ ID NO :5、12、14或73-77中任一项所示的编码序列的简并变异体。此处所用的“简并变异体”指与参比核酸编码相同氨基酸序列、但核酸序列不同于参比核酸的核酸变异体。例如，本发明核酸的“简并变异体”可以指编码SEQ ID NO :I的氨基酸序列，但与SEQID NO :5所示编码序列有差别的核酸序列；或可以指编码SEQ ID NO :13的氨基酸序列，但与SEQ ID NO : 14所不编码序列有差别的核酸序列。如本文所用，术语“在严谨条件下杂交”是用来描述典型的相互间至少60%同源的核苷酸序列仍可相互杂交的杂交和清洗条件。优选的，严谨条件为这样的条件，在此条件下相互间有至少65%、更优的至少70%、且甚至更优选的至少80%或更高同源性的序列一般仍可相互杂交。此严谨条件为本领域普通技术人员所公知。严谨条件的一个优选，非限制性实例为(I)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0. 2 XSSC,0. 1%SDS, O0C ;或
(2)杂交时加有变性剂，50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. I %Fi Co 11, 42 0C ^ ;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的核酸编码的蛋白与本发明蛋白有相同的生物学功能和活性。本文所用的术语“表达载体”和“载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，这些载体能够在宿主体内复制和稳定，这些载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件，在本发明中适用的载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、HI V病毒载体或pShutt Ie-CMV载体。本文所用术语“重组表达载体”和“重组载体”指包含目标核酸的表达载体。例如本发明的重组表达载体包含以适于核酸在宿主细胞中表达形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一个或多个基于用于表达的宿主细胞而选择的条件序列，其与表达的核酸可操作的连接。在重组表达载体中，“可操作的连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的Iac或trp启动子；\噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体 还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。此外，“重组表达载体”优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。II.筛选小分子化合物的方法在另一实施方式中，文发明还提供一种筛选特异影响PPAR Y和RXRa相互作用的小分子化合物的方法，所述方法包括步骤i)构建表达全长的PPAR Y或PPAR S与转录激活结构域的融合蛋白，产生含转录激活结构域的PPARY和PPARS质粒；ii)构建全长的RXRa与另一转录调控因子的DNA结合结构域的融合蛋白，产生含所述DNA结合结构域的RXRa质粒；iii)构建含报告基因的质粒，所述报告基因含ii)中所述转录调控因子的结合元件；iv)将i)、ii)、iii)中所述质粒转染进宿主细胞；v)转染后检测iv)中所述细胞中报告基因的表达；vi)以PPAR S与RXR a的相互作用作为对照，筛选特异影响PPAR Y和RXR a相互作用的小分子化合物。在一个实施方式中，步骤i)中所述转录激活结构域为VP16转录激活结构域。在一个实施方式中，步骤ii)和iii)中所述的转录调控因子是Gal4。在一个实施方式中，步骤iii)中所述报告基因为荧光素酶。在一个实施方式中，步骤iv)中所述细胞为293细胞。III.本发明多肽及其制备方法本发明中的多肽和核酸优选以分离的形式提供，更优选地被纯化至均质。本发明的多肽并不仅限于上述列举的多肽及其片段、类似物和衍生物。修饰(通常不改变一级结构)形式还包括体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。本发明核酸也包括变异体，其编码与本发明有相同氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此核酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。编码本发明多肽的全长核酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备 的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的核酸，就可以用重组法来大批量地获得有关多肽。这通常是将核酸可操作地连接到载体中，再转入宿主细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关多肽。此外，还可用人工合成的方法来合成有关多肽，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段、衍生物或类似物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的重组载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本文在所用术语“宿主细胞”又称为受体细胞，是指能够接收和容纳重组DNA分子的细胞，是重组基因扩增的场所，理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞，特别是草地贪夜蛾细胞、鸡细胞、牛细胞、猪细胞、犬细胞、猫细胞、马细胞或人细胞；优选人细胞。通过常规的重组DNA技术，本发明的核酸序列可用来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤(I)用编码本发明多肽的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。用重组载体转化宿主细胞可用转化或转染等本领域技术人员熟知的常规技术进行。如此处所用，术语“转化”和“转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸或载体形式的核酸导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移、病毒介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主细胞是真核细胞时，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。宿主细胞是真核细胞时，也常常使用病毒载体来转移核酸，常用的病毒载体如上所述。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 o 在一个实施方式中，通过培养包含本发明重组载体的HEM293细胞生产本发明多肽，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯形式的目的多肽。IV.药物组合物和给药方法在其它实施方式中，描述了包含有效量的本发明多肽和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。这些组合物适用于兽医或人类给药。本发明药物组合物可以是给予患者的任何组合物形式。例如，该组合物可以是固体、液体或气体(气雾剂)形式。一般的给药途径包括但不限于口服、局部、胃肠道外、舌下、直肠、阴道、眼部、肿瘤内和鼻内。胃肠道外给药包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸内注射或输注。在一个方面，胃肠道外给予该组合物。在又一方面，静脉内给予所述药物组合物。在又一方面，口服给予所述药物组合物。可配制药物组合物，使得在给予患者该组合物后其有效成分，即本发明多肽可被生物利用。药物组合物可采取单一或多剂量单位的形式，例如，片剂可以是单剂量单位，气雾剂的容器可容纳一个或多个多个剂量单位。用于制备该药物组合物的材料在其用量下应无毒。本领域普通技术人员将明白该药物组合物中活性成分的最佳剂量取决于各种因素。相关因素包括但不限于动物类型(如人)、本发明多肽的具体形式、给药方式和具体的组成。药学上可接受的载体可为颗粒状，因此该组合物可以是，例如片剂或粉末形式。载体是液体时，该组合物可以是，例如口服糖浆或注射液。此外，载体可以是气态或微粒，以提供用于(例如)吸入给药的气雾剂组合物。当口服给药时，该组合物优选固体或液体形式，半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式也包括在本文所考虑的固体或液体形式中。作为口服给药的固体组合物，可将该组合物制成粉剂、颗粒剂、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、糯米纸囊剂等。这种固体组合物一般含有一种或多种惰性稀释剂。此外，可存在一种或多种以下物质粘合剂如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂如淀粉、乳糖或糊精、崩解剂如藻酸、藻酸钠、原始凝胶(Primogel)、玉米淀粉等；润滑剂如硬脂酸镁；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精、调味剂如薄荷、甲基水杨酸或橙味剂；以及着色剂。当组合物是胶囊，如明胶胶囊形式时，除上述类型的材料外，它还可含有液态载体如聚乙二醇、环式糊精或脂肪油。该组合物可以是液体形式，如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮剂。液体可用于口服给药或注射递送。当口服给药时，组合物可含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和味道增强剂中的一种或多种。注射给药的组合物中，也可包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。无论是溶液、悬浮液或其它类似形式的液体组合物也可包含一种或多种以下物质无菌稀释剂如注射用水，盐溶液，优选生理盐水、林格溶液、等渗氯化钠，可用作溶剂或悬浮介质的不挥发性油如合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、环式糊精、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苄基醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液，以及调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。可将胃肠道外组合物包装在由玻璃、塑料或其它材料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是示范性辅佐剂。注射组合物优选无菌。在治疗或预防具体疾病或病症中本发明多肽的有效量取决于疾病或病症的性质， 可用标准临床技术测定有效量。此外，可任选地进行体外或体内试验以帮助鉴定最佳剂量范围。用于组合物的准确剂量也取决于给药途径，和疾病或失调的严重性，应根据医生的判断和各个患者的情况来决定。该组合物含有治疗有效量的本发明多肽，以获得合适剂量。该治疗有效量一般至少约为该组合物重量的0.01%。当口服给药时，该治疗有效量可约为该组合物重量的
0.1%-80%。在一个方面，口服组合物可含有约占该组合物重量4%-50%的本发明多肽。在又一方面，制备本发明组合物，以使胃肠道外单位剂量含有约0. 01重量％-2重量％的本发明多肽。该药物组合物可含有每千克体重约0. Ol-IOOOmg的本发明多肽。在一个方面，该药物组合物可包含约每千克体重0. I-IOOmg的本发明多肽。在一个方面，该药物组合物可包含约每千克体重I-IOOmg的本发明多肽。在另一方面，给药量约为0. l-25mg/kg体重的本发明多肽。在另一方面，给药量约为l-10mg/kg体重的本发明多肽。在治疗方案中，每天给予该药物组合物的剂量可以是约0. Ol-IOOOmg本发明多肽/kg体重,优选0. I-IOOmg本发明多肽/kg体重,更优选I-IOmg本发明多肽/kg体重,最优选2-5mg本发明多肽/kg体重。本发明多肽或药物组合物可通过任何方便的途径，例如通过输液或推注给药，通过上皮或粘膜层(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收。可以全身或局部给药。已知各种递送系统，如包裹在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中，它们可用于给予本发明多肽或药物组合物。在某些实施方式中，将一种以上的本发明多肽或药物组合物给予患者。例如也可通过使用吸入器或喷雾器，与促气雾剂一起配制，或通过碳氟化合物或合成肺部表面活性剂灌注进行肺部给药。在又一实施方式中，本发明多肽或组合物可以控释系统递送，例如但不限于使用泵或各种聚合材料。在又一实施方式中，可将控释系统置于本发明多肽或组合物的靶(如脑)的附近，因而仅需要全身给药剂量的一部分(参见例如Goodson，《控释的医学应用》(Medical Applications of Controlled Release),同上，第 2 卷，第 115-138 页(1984))。可用Langer综述(Science 249:1527-1533(1990))中讨论的其它控释系统。
药学上可接受的载体可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的液体，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药学上可接受的载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体氧化硅、尿素等。此外，可使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方式中，当给予患者时，本发明多肽或组合物和药学上可接受的载体无菌。当静脉内给予本发明多肽时，水是示范性载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油的水溶液也可用作液体载体，尤其是注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明组合物也可含有少量湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。本发明组合物可采取溶液，悬液，乳液，片剂，丸剂，微型片剂，胶囊，含有液体、粉剂、缓释剂、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、悬浮剂的胶囊形式或其它适合使用的形式。其它合适的药物载体的其它例子见E. W. Martin的《雷明顿药物科学》(Remington’ sPharmaceutical Sciences)。
在一个实施方式中，根据常规方法将本发明多肽配成适合静脉内给予动物，尤其是人的药物组合物。用于静脉内给药的载体一般是无菌等渗缓冲水溶液。需要时，该组合物也可包含增溶剂。用于静脉内给药的组合物可任选地包含局部麻醉剂如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，在标明活性物质用量的密封容器如安瓿或药囊中以单位剂型单独或混合形式，例如，作为冻干粉末或无水浓缩物提供。当通过输注给予本发明多肽时，可用，例如含有药物级无菌水或盐水的输液瓶配药。当通过注射给予本发明多肽时，可提供装有注射用无菌水或盐水的安瓿，以便在给药前混合这些成分。该组合物可用于局部给药，此时载体可以是溶液、乳液、软膏或凝胶基质形式。如果用于透皮给药，该组合物可以是透皮贴剂或离子电渗装置形式。局部剂型可包含浓度约为0. 05%-50%w/v(每单位体积组合物中的重量)，另一方面为0. 1%-10%w/v的本发明多肽。这可通过，例如但不限于手术期间局部输注；局部施用，如术后与创伤敷料联用；注射 ’导管方式；栓剂方式；或植入方式(植入物为多孔性、非多孔性或明胶材料，包括膜如硅塑(sialastic)膜或纤维)来实现。该组合物可用于直肠给药，其形式为，例如在直肠中融化并释放本发明多肽的栓剂。该组合物可包含改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。例如，该组合物可包含在活性成分周围形成包衣外壳的材料。形成包衣外壳的材料一般是惰性的，可选自例如糖、虫胶和其它肠溶包衣物质。或者，可将活性成分包装在明胶胶囊中。 该组合物可由气态剂量单位组成，例如，可以是气雾剂形式。术语气雾剂用来指各种系统，从胶体性质系统到由密封包装组成的系统。可通过液化气或压缩气体或通过适合地分散活性成分的泵系统进行递送。无论是固体、液体或气体形式，本发明药物组合物均可包括用于治疗纤维化病的其它药物。V.本发明多肽的用途本发明人通过实验证明，本发明多肽通过与PPARy的相互作用负调控PPARy的转录活性，从而抑制PPAR Y下游的基因，特别是脂肪细胞生成相关基因和炎症反应基因的表达，从而抑制脂肪细胞形成和炎症反应。因此，本发明多肽可用于防止或逆转PPAR Y介导的炎症、肥胖症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合征等疾病。因此，本发明包括本发明多肽、其编码核酸或含有其编码核酸的重组载体在制备抑制PPARy活性用的组合物中的应用。该组合物可以是本文所述的药物组合物。本发明也包括本发明多肽、其编码核酸或含有其编码核酸的重组载体在预防或治疗PPARy介导的疾病中的应用。以下通过实施例来证明本发明多肽的这种用途。本领域技术人员应理解，以下提供的实施例仅为说明目的，不以任何方式限制本发明的保护范围。实施例下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等， 《分子克隆实验室指南》(美国纽约州冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press), 1989)所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，百分比和份数均按重量计算。I.实验材料I. I哺乳动物细胞株HEK293 :人胚胎肾细胞系，上皮细胞。购自ATCC并用MEM培养液培养。HEK293用磷酸钙方法转染。3T3-L1 :小鼠成纤维细胞系，购自ATCC并用DMEM培养液培养。3T3-L1用脂质体转染或病毒感染。MEF:小鼠成纤维细胞。本文中使用的缺失内源￠-抑制蛋白的MEF以及其对照野生型细胞由美国杜克大学医学中心Robert J. Lefkowitz教授惠赠。MEF用脂质体转染或病毒感染。I. 2 质粒PAdEasy-I :33. 4kb长的质粒，包含大部分5型腺病毒基因组(除了 El和E3)，能感染并在含有El基因组成分的细胞如HEK293中复制。pcDNA3_HA，pcDNA3_FLAG :真核表达载体，用于分别表达HA，FLAG融合蛋白。pShuttle-CMV :真核表达载体，用于构建腺病毒载体。包含CMV启动子和多克隆位点，用来克隆目的基因片段。I. 3酶等主要试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶为中国上海的英杰公司(Invitrogen)产品；质粒抽提试剂盒购自中国上海的凯杰公司(Qiagen) ;MEM、DMEM培养液以及胎牛血清购自中国上海的吉布科公司(Gibco BRL)。脂质体转染胺试剂(LipofectAMINE2000)为中国上海的英杰公司产品。蛋白 A琼脂糖 4 快流(Protein A Sepharose 4Fast Flow) (17-5280-04)及蛋白 G 琼脂糖 4 快流(Protein G epharose4 Fast Flow) (17-0618-02)、放射性同位素[35S]甲硫氨酸为中国上海的珀金埃尔默公司(PerkinElmer)产品。胰岛素购自中国上海的西格玛公司(Sigma)。I. 4 抗体肌动蛋白兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号A-2066。P -抑制蛋白兔源多抗(AlCT)由美国杜克大学的R. J. Lefkowitz教授惠赠。FLAG鼠源单抗(M2)为中国上海的西格玛公司产品，目录号F3165。FLAG兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号F7425。HA鼠源单抗(12CA5)为中国上海的罗氏公司(Roche)产品，目录号1666606。
HA兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号H-6908。Spl兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号S-8909。肌动蛋白兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号A-2066。P -抑制蛋白兔源多抗(AlCT)由美国杜克大学的R. J. Lefkowitz教授惠赠。PPARy兔源多抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz)产品，目录号sc-7196。PPARy鼠源单抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号sc_7273。 RXRa兔源多抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号sc_5530RXRa鼠源单抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号sc-46659。NCoR兔源多抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号sc_89940SMRT兔源多抗为美国加州圣克鲁兹市的圣克鲁兹生物技术公司产品，目录号SC-20778。SRC-I鼠源单抗为美国马萨诸塞州贝尔福德的密理博公司(Millipore)产品，目录号 05-522。FLAG鼠源单抗(M2)为中国上海的西格玛公司产品，目录号F3165。FLAG兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号F7425。HA鼠源单抗(12CA5)为中国上海的罗氏(Roche)产品，目录号1666606。HA兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号H-6908。Spl兔源多抗为中国上海的西格玛公司产品，目录号S-8909。I. 5小鼠品系和词养条件C57BL/6小鼠、db/db2型糖尿病模型小鼠购于上海斯莱克实验动物公司(SLAC)。3 -抑制蛋白I和2缺失和野生型小鼠由美国杜克大学的R. J. Lefkowitz教授惠赠。
抑制蛋白I过表达和野生型小鼠由本实验室做成并与C57BL/6回交九代以上(如Shi等，2007) (13)。动物的饲养和操作均按照中科院上海生命科学院实验动物委员会的条例进行。所有其他小鼠从中国科学院上海实验动物中心提供。所有动物均在无病原体的环境下饲养，饲养和实验方法符合国家实验动物护理和使用健康指南。正常小鼠喂养普通饲料(Formulab 5008，Labdiet5053)，高脂小鼠喂养高脂饲料(55%脂肪卡路里)(Harlan-Teklad 93075)，并自由获得水和食物。2.实验方法2. I细胞转染和质粒野生型和￠-抑制蛋白缺失的鼠胚胎成纤维细胞系(MEFs)由美国杜克大学医学中心Robert J. Lefkowitz博士赠与，瞬转采用脂质体转染法。每盘DNA转染总量通过补 加表达P -gal的载体质粒(表达)保持一致。全长人的PPAR y I、PPAR 6 cDNA都构建到pcDNA3 (中国上海的英杰公司)载体中，并在其N端加上HA或FLAG序列。全长人的P -抑制蛋白I、P -抑制蛋白2和缺失突变体的构建见引文(14)。所有的序列都经过测序确证。
2. 2 实时定量 RT-PCR总RNA按照中国上海的英杰公司使用指南用TRIzoI试剂提取。逆转录采用寡聚(dT)和超转录II (superscript II)系统。实时定量PCR反应在中国上海的司查塔基公司(Stratagene)的Mx3000p中完成。P -肌动蛋白的mRNA水平被用来归一化实验样品。所
用引物为
权利要求
1.ー种用于调节PPAR Y活性以预防或治疗PPARy相关的疾病或病症的多肽，所述多妝包含SEQ ID NO 71所不氣基酸序列。
2.如权I所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO :1、3、10、13和67-70中任一项所示的氨基酸序列的多肽。
3.如权利要求1-2中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含与SEQIDNO:3的序列相同性为约99. 8%以下的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽中与SEQID NO :3的氨基酸255-260相对应的位置上包含与SEQ ID NO :3相同的氨基酸残基。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述多肽为如SEQID N0:l、3、10、13和67-71中任一项所不的氨基酸序列。
6.—种分离的多肽,所述多肽选自 Cl)如SEQ ID NO :1、3、10、13和67-71中任一项所示的氨基酸序列的多肽； (2)在(I)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ IDNO :3的生物学活性的由(I)衍生的多肽，其中，所述取代、缺失或添加不出现在SEQ ID NO71中。
7.—种核酸，其编码权利要求1-6中任一项所述的多肽。
8.—种重组载体，其包含权利要求7所述的核酸。
9.ー种宿主细胞,其包含权利要求8所述的重组载体。
10.ー种制备权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法，其包括以下步骤 i)培养权利要求9所述的宿主细胞， )诱导其表达， iii)收获表达产物，和 iv)任选地，纯化表达产物。
11.ー种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体，以及药学上可接受的运载体或赋形剂。
12.权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体在制备用于治疗或预防PPARy相关的疾病或病症的药物中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疾病或病症括肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症。
14.ー种抑制PPAR Y活性的方法，所述方法包括应用权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体。
15.权利要求1-5中任一项所述的多肽、权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的重组载体在制备抑制PPAR Y活性的组合物中的应用。
16.一种降低罗格列酮引起的脂肪细胞分化和生成的方法，所述方法包括应用权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体。
17.权利要求1-6中任一项所述的多肽、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的重组载体在制备降低罗格列酮引起的脂肪分化和生成的组合物中的应用。
18.—种筛选特异影响PPAR Y和RXRa相互作用的小分子化合物的方法，所述方法包括步骤i)构建表达全长的PPAR Y或PPARS与转录激活结构域的融合蛋白，产生含转录激活结构域的PPAR Y和PPAR δ质粒； )构建全长的RXRa与另ー转录调控因子的DNA结合结构域的融合蛋白，产生含所述DNA结合结构域的RXRa质粒； iii)构建含报告基因的质粒，所述报告基因含ii)中所述转录调控因子的结合元件； iv)将i)、ii)、iii)中所述质粒转染进宿主细胞； V)转染后检测iv)中所述细胞中报告基因的表达； vi)以PPARS与RXR a的相互作用作为对照，筛选特异影响PPAR Y和RXR a相互作用的小分子化合物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤i)中所述转录激活结构域为VP16转录激活结构域。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤ii)和iii)中所述的转录调控因子是 Gal4。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤iii)中所述报告基因为荧光素酶。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤iv)中所述细胞为293细胞。
全文摘要
本发明涉及β抑制蛋白1或其片段或变异体，它们的编码核酸、重组载体、宿主细胞，以及包含它们的药物组合物。本发明还涉及制备本发明β抑制蛋白1或其片段或变异体的方法。另一方面，本发明涉及β抑制蛋白1或其片段或变异体在治疗或预防PPARγ介导的疾病中的应用，以及β抑制蛋白1或其片段或变异体在制备治疗或预防PPARγ介导的疾病的药物中的应用，所述疾病具体是肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症。本发明还涉及一种筛选治疗或预防肥胖症、炎症、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化或代谢综合症的药物的方法。
文档编号A61P3/04GK102816205SQ20121018955
公开日2012年12月12日 申请日期2012年6月8日 优先权日2011年6月9日
发明者裴钢, 赵简, 庄乐南 申请人:中国科学院上海生命科学研究院