抑制大脑eIF6基因表达的核酸抑制分子、其筛选方法和用途

抑制大脑eIF6基因表达的核酸抑制分子、其筛选方法和用途
【专利摘要】本发明基于eIF6对记忆力的负调控和增强谷氨酸受体表达的作用，提供了一种在体外培养细胞中筛选有效抑制大脑eIF6基因表达的核酸抑制分子的方法，通过该方法筛选的核酸抑制分子，以及所述核酸抑制分子预防和/或治疗运动性疲劳和/或记忆力减退及其相关疾病的用途。
【专利说明】抑制大脑elF6基因表达的核酸抑制分子、其筛选方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种筛选有效抑制大脑eIF6基因表达的核酸抑制分子的方法，通过该方法筛选的核酸抑制分子，以及所述核酸抑制分子预防和/或治疗运动性疲劳和/或记忆力减退及其相关疾病的用途。
【背景技术】
[0002]一、运动性疲劳
[0003]运动性疲劳主要是指由运动引起身体能力下降的现象。1982年第五届国际运动生化会议将疲劳的定义统一，运动性疲劳是“机体生理过程不能持续其机能在一定水平或和各器官不能维持预定的运动强度”。
[0004]目前，按疲劳发生的部位，习惯上把运动性疲劳分为中枢疲劳和外周疲劳两部分。其中中枢疲劳产生的机制包括:
[0005]I) 5-羟色胺(5-HT):5-HT是中枢神经系统的一种抑制性递质，研究也证实，动物进行长时间运动过程中大脑5-HT含量明显增加[1，2]。
[0006]2)多巴胺(DA)和去甲肾上腺素(NE):研究结果显示，在运动过程中中脑、海马、纹状体和下丘脑的DA代谢增强[3]。Bailey等发现大鼠的疲劳与脑干和中脑中多巴胺的合成和代谢的减少有关，当脑DA合成和代谢得以维持时，疲劳就会延迟。
[0007]3)乙酰胆碱(Ach) :近年来，有推测认为耐力运动中疲劳可能是由于运动中胆碱利用的衰竭、排空降低了胆碱能系统的活动而引发的[4]。实验发现，运动员马拉松跑后，血浆胆碱水平下降约40%，与进食无胆碱的食物有同样效果[4]，暗示当中枢Ach浓度下降时，中枢疲劳就会发生。
[0008]4)谷氨酸，r-氨基丁酸(GABA) =GABA是中枢神经系统中主要的抑制性氨基酸，谷氨酸(Glu)是主要的兴奋性氨基酸。Coiix)研究发现GABA可抑制腺垂体对运动的反应，减弱机体对运动的应激，降低机体的运动能力[5]。在正常生理情况下，脑内兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸保持平衡。当脑内谷氨酸含量升高时，表示大脑皮层兴奋过程占优势；当脑内Y-氨基丁酸含量升高时，表示大脑皮层抑制过程占优势，此时易出现疲劳。
[0009]5)氨浓度:运动时，肌肉可产生氨并释放到血液。氨可通过血脑屏障，具有毒害作用。脑氨增多可引起多种酶活性及ATP再合成速率下降。氨还可改变脑膜对氨基酸的通透性，影响各种神经递质的代谢，因此氨可能是中枢疲劳的重要原因之一。
[0010]二、学习记忆
[0011]学习记忆是大脑最基本、最重要的高级神经功能之一，是衡量人类智能发育的重要指标。多年来人们对学习与记忆在脑内的定位问题进行了大量的研究，目前认为边缘系统中的海马是学习、记忆等高级神经活动的重要部位，海马与学习记忆有着密切的联系[6，7]。
[0012]研究发现给予海马短暂重复的刺激，会引起突触传递增强，在无损伤的动物体实验中，增强效应将维持数小时，甚至数周，这种突触传递的增强被称作突触传递长时程增强(Long-term potentiation, LTP)。海马内三条主要的兴奋性突触都能产生长时程增强(LTP) ο Richard Morris 于 1986 年首次证明长时程增强(Long-term potentiation, LTP)是体内记忆形成所必需的[8]。Susumu Tonegawa于1996年证明海马CAl区是活体老鼠空间记忆形成的关键[9]，海马NMDA受体活性的增强能产生增强的LTP和空间学习的整体提高。2001年，Joe Tsien培育了海马中高表达NR2B亚基而具有NMDA受体功能增强品系的Doogie小鼠[10] ,Doogie小鼠不仅长时程增强(Long-term potentiation,LTP)较强而且在空间学习任务中也表现出色，进一步加强了 LTP对海马依赖性记忆形成中的重要性。目前认为，LTP产生的分子机制为兴奋性神经递质谷氨酸(Glul)和其受体KA/AMPA结合，激活了 N2甲基2D2天门冬氨酸(NMDA)受体的离子通道进而产生的[11]。
[0013] 三、eIF6的基本特征
[0014]eIF6 基因(SEQ ID NO 2，NCBI genebank 登记号为 NM-002212)在真核生物中高度保守[12，13]，人和小鼠eIF6氨基酸序列有98%序列同源性。在人类基因组中，eIF6定位于20号染色体的长臂20qll.2区，5’端缺少TATA启动子结合区，CpG岛，mRNA全长1108bp，含有7个外显子和6个内含子，开放读框含有735个核苷酸，245个氨基酸，分子量大小为27KD[14]。eIF6蛋白分布广泛，研究证实，在上皮细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、激活的T细胞、活化的肥大细胞及肌肉组织纤维中均有eIF6蛋白的表达，也有研究证实只要表达α6β4整合素的细胞均表达eIF6[15]。细胞水平，eIF6蛋白表达在胞浆(中间丝附近)和胞核(主要位于核仁外周)[16]。
[0015]eIF6的生物学功能包括:
[0016]I)参与调控蛋白合成:在真核生物翻译起始阶段，eIF6促进40s亚基和60s亚基结合形成80s亚基，从而启动蛋白质的翻译[17-20]。敲除eIF6基因后核糖体60s亚基丢失，证明其对核糖体60s的形成具有重要的作用[16]。并且对胞外信号的反应中eIF6是作为最早的真核细胞翻译起始因子参与调节蛋白的翻译[21]。另一方面，eIF6与RISC (RNA诱导沉默复合体)结合，特异性地促进相应microRNA的作用，从转录水平上干扰mRNA形成，抑制其对应靶蛋白的表达，反之敲除eIF6后则会解除miciORNA对靶蛋白的表达抑制作用而促进革巴蛋白的表达[22,23]。
[0017]2)参与调节细胞黏附及细胞骨架的形成:eIF6为β 4整合素结合蛋白，与中间丝和α6β 4整合素的胞内结构域的功能区结合，介导细胞的黏附功能[24]。此外，eIF6还存在于核基质中，参与细胞骨架的形成。有实验已证明eIF6在中间丝和核基质上高表达
[15]，并且eIF6还可以调节Wnt信号通路中的β -联蛋白的表达，从而影响细胞骨架[25]。
[0018]3)与肿瘤发生和转移的关系:有实验证实eIF6作为翻译调节因子参与了细胞的增殖。在对分化诱导前后的肝癌细胞核基质成分进行亚细胞蛋白组学分析发现，eIF6在分化后的细胞中高表达，提示可能参与癌细胞分化[26]。eIF6在正常粘膜细胞可以检测到，但是在癌细胞中过表达，如在结直肠癌中eIF6的表达上调[27]，并且在淋巴结转移灶中尤为明显[28]，故而提示eIF6的高表达可能参与了肿瘤的增殖和转移。
[0019]从上面可以看出，eIF6在核糖体合成、细胞骨架以及肿瘤的增殖分化和转移中具有重要的作用，但是目前对于eIF6蛋白的相关文献较少，尤其是对于其与学习记忆功能的关系和在对抗记忆力减退或记忆障碍方面的作用还未见报道。
【发明内容】

[0020]本发明人通过大量的实验，出人意料地发现:eIF6敲基因小鼠有较强平衡能力和抗疲劳倾向，同时eIF6对中枢的记忆力具有负调控作用，可以增强大脑皮层及海马突触后神经元中谷氨酸受体的表达。基于该发现，本发明的目的提供一种在体外培养细胞中筛选有效抑制大脑eIF6基因表达的核酸抑制分子的方法(在本文中有时简称“本发明的方法”)，并且通过该方法筛选出可以有效抑制大脑eIF6基因表达的核酸抑制分子(在本文中有时也称为“eIF6抑制核酸分子”)，包括长期抑制分子和瞬时抑制分子。
[0021]在本发明中，eIF6抑制核酸分子是指以eIF6核酸分子，优选地以SEQID NO:2或3为靶序列的有效抑制eIF6基因表达的核酸分子(包括，但不限于，例如，反义核酸分子、小RNA(miRNA)、微小非编码RNA(tncRNA)、小调节RNA(smRNA)、短干扰RNA(siRNA)等。通过本发明的方法筛选的核酸抑制分子还可以进一步被包装成病毒RNA干扰载体(下文也称为“eIF6抑制性病毒RNA干扰载体”)或进一步筛选出有效抑制eIF6基因表达的siRNA分子(下文中有时也称为“本发明的siRNA分子”)。
[0022]在本发明中，β4整合素结合蛋白eIF6(下面简称为“eIF6蛋白”)涵盖具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列、在SEQ ID NO:1的序列的基础上发生1_3个氨基酸残基保守置换的同源氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的序列具有至少80%以上的同源性且能与β 4整合素，优选α6β 4整合素特异性结合的氨基酸序列的多肽。因此，在本发明中当提及eIF6蛋白时，并不仅仅特指具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的野生型eIF6蛋白本身，而是涵盖上述eIF6蛋白的各种衍生物或同源物。“eIF6核酸分子”或“eIF6基因序列”涵盖SEQID N0:2所示的eIF6基因核酸序列，与SEQ ID NO:2的序列具有至少80%以上同源性的核酸序列的核酸分子，所述eIF6核酸分子在哺乳动物细胞中的表达可产生eIF6基因表达产物。
[0023]在本发明中，当提及`“eIF6基因”时，其不限于鼠eIF6基因，而是泛指各种种属来源的eIF6基因，因为在进化中，eIF6基因在真核细胞中是非常保守的。另外，在本发明中“eIF6蛋白”、“eIF6核酸分子”或“eIF6抑制核酸分子”的来源不限于鼠，还可以来自哺乳动物，优选人。
[0024]因此，在第一个方面，本发明提供了一种筛选有效抑制大脑中eIF6基因表达的eIF6核酸抑制分子的方法，该方法包括以下步骤:
[0025]I)将以eIF6基因序列(例如，SEQ ID NO:2所示核酸序列)为靶序列的长度为20~40个，优选21~27个核苷酸的候选eIF6核酸抑制分子包装到带有报告基因，例如萤光素酶基因、荧光蛋白基因，优选绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或黄色荧光蛋白基因的病毒表达载体中，形成病毒干扰载体；
[0026]2)将步骤I)中获得的病毒干扰载体与体外培养的成纤维细胞(所述成纤维细胞可以是市售的人皮肤成纤维细胞系，如BJ等等；也可以是取自与eIF6基因相同或不同来源的动物的皮肤制成的原代或传代培养细胞，如取自人皮肤瘢痕组织并培养的增生性瘢痕成纤维细胞)共孵育使得所述病毒干扰载体感染成纤维细胞；
[0027]3)观察被感染的成纤维细胞中的报告基因表达产物(例如，突光)表达，将所述报告基因表达产物(例如，荧光)表达达到80%以上的细胞用于下一步筛选；[0028]4)提取步骤3)中筛选的报告基因表达产物表达(例如，荧光)达到80%以上的成纤维细胞的RNA并反转录为cDNA，以SEQ ID NO: 11、12、13、14作为引物以反转录的cDNA作为模板，通过实时定量PCR技术(例如，实时荧光定量PCR)检测eIF6mRNA的表达；
[0029]5)将与阴性对照病毒载体感染的成纤维细胞相比eIF6mRNA表达相比减少50%以上的候选eIF6核酸抑制分子作为初始筛选分子；
[0030]6)将包装有步骤5)中确定的初始筛选分子的病毒干扰载体感染小鼠48小时，采用Western Blot检测小鼠脑中突触后神经元的谷氨酸受体蛋白NMDAR的表达量，若NMDAR的表达量与野生型小鼠相比升高30%以上，则所述初始筛选分子被确定为有效抑制eIF6基因表达的eIF6核酸抑制分子。
[0031]在本发明中，候选eIF6抑制核酸分子的设计可以采用以下的思路:
[0032]I)从转录本(mRNA) (NM_002212.3，eIF6 mRNA剪切本I)的ATG起始密码开始，寻找第一个“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的eIF6抑制核酸分子靶位点。有研究结果显示GC含量在30% -50%左右的eIF6抑制核酸分子要比那些GC含量偏高的更为有效。在设计eIF6抑制核酸分子时不要针对5'和3'端的非编码区；
[0033]2)将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列；
[0034]3)选出合适的目标序列进行合成，从而得到候选eIF6抑制核酸分子。
[0035]在第二个方面，本发明进一步提供了一种筛选瞬时抑制大脑eIF6基因表达的siRNA分子的方法，该方法包 括以下步骤:
[0036]I)将上述初始筛选分子通过瞬时转染的方式转染体外培养的小鼠海马神经元细胞，将转染的海马神经元细胞继续培养72小时；
[0037]2)提取步骤I)中被转染的海马神经元细胞的蛋白，通过western blot技术检测eIF6蛋白的表达；
[0038]3)将与阴性对照转染的海马神经元细胞中eIF6蛋白表达相比减少30%以上的海马神经元细胞所对应的候选eIF6核酸抑制分子确定为瞬时抑制eIF6基因表达的siRNA分子。
[0039]在本发明的方法中，病毒表达载体可选自慢病毒载体或腺病毒载体。
[0040]在第三个方面，本发明提供了根据本发明上述方法筛选的eIF6核酸抑制分子，其长度为20~40个，优选21~27个核苷酸。
[0041]在第四个方面，本发明涉及包含eIF6核酸抑制分子的病毒干扰载体，所述病毒选自腺病毒载体或慢病毒载体。
[0042]在本发明的一个优选实施方案中，上述eIF6核酸抑制分子或siRNA分子包含SEQID NO:3-8,15-16中任一个所不的序列。
[0043]在第五个方面，本发明涉及本发明的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子在制备用于治疗和/或预防运动性疲劳和/或记忆力减退的药物中的用途。
[0044]在一个优选的实施方案中，运动性疲劳是由突触后神经元的谷氨酸受体表达增加介导的。在另一个优选的实施方案中，记忆力减退是由于海马功能受损相关的疾病或功能障碍引起的。
[0045]在本发明中，本发明的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子可以用于预防和/或治疗选自下列的因素、疾病、疾病状态或功能障碍:慢性疲劳综合征、衰老、抑郁症、脑部肿瘤、糖尿病、阿尔兹海默病、帕金森病、脑动脉硬化、慢性鼻窦炎、老年痴呆症、匹克氏病(Pick’ sdisease)、亨廷顿病、肝豆状核变性、精神分裂症或癫痫、神经退行性疾病、睡眠障碍、慢性酒精中毒酒精中毒、甲状腺功能低下和神经性梅毒。
[0046]本发明的eIF6抑制性病毒RNA干扰载体或siRNA分子还可以与适宜的一种或多种药用载体一起制成药物组合物。
[0047]在第六个方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含与递送载体结合的本发明的eIF6核酸抑制分子或病毒干扰载体,和任选的一种或多种药用载体,其中所述递送载体选自胆固醇、纳米颗粒、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白、阳离子多肽、壳聚糖或脂质体。为了增加核酸的使用效果，还可辅以专用的稳定剂和特异性免疫增强剂。
[0048]本领域的技术人员应该 理解，本发明的eIF6抑制性病毒RNA干扰载体或siRNA分子或包含它们的药物组合物优选地可以通过局部定向给药，尤其是脑室内给药(根据需要还可以海马局部给药)，静脉内注射、输注，肌内注射，还更优选通过本领域技术人员熟知的靶向递送方式给药。
[0049]在本发明中，eIF6抑制性慢病毒RNA干扰载体可以用于长期敲降eIF6基因，适合长期给药以治疗无法通过卧床休息而缓解的长期严重疲劳，如慢性疲劳综合征；以及与记忆力减退或记忆障碍相关的疾病或疾病状态。
[0050]本发明的siRNA分子可用于短期施用，以暂时缓解、减轻或消除运动性中枢疲劳症状，诸如躯体性疲劳症状如肌肉运动能力下降(由于长时间运动训练导致)，和心理性疲劳症状如情绪低迷、注意力不集中、失眠、精力不济等；以及记忆力减退或记忆障碍的症状。换句话说，本发明的siRNA分子可用于短期对症治疗。
[0051]本领域技术人员通过常规试验能够分别确定eIF6抑制性病毒RNA干扰载体或siRNA分子或包含它们的药物组合物的剂量水平(例如，I μ g~100mg/kg体重)。应该理解，关于任何具体受试者的具体剂量水平依赖于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物联合和疾病的严重性等。此外，eIF6抑制性病毒RNA干扰载体或siRNA分子或包含它们的药物组合物还可以与其记忆力减退抑制剂或记忆增强剂同时、或间隔一定时间联合给药。
[0052]本发明的有益效果:
[0053]1.本发明通过Morris (Morris water maze,MWM)水迷宫系统检测发现eIF6敲基因小鼠有较强学习和空间定位能力。
[0054]2.通过免疫组织化学方法显示，eIF6蛋白在大脑皮层、海马及其周边组织的神经元和神经节中的过度表达与记忆力下降或记忆障碍有关，而eIF6蛋白的低表达则具有明显增强学习记忆作用。
[0055]3.通过转棒式疲劳仪测试，发现eIF6敲基因小鼠有较强平衡能力和抗疲劳倾向，提示敲基因小鼠有较强延缓疲劳出现能力。
[0056]4.基于本发明的发现，本发明人利用海马神经元细胞通过逆转录定量PCR等技术筛选出了特异性抑制eIF6基因表达的病毒RNA干扰载体和siRNA分子。本发明的病毒RNA干扰载体和siRNA分子可以用于对抗疲劳和/或记忆力减退的症状及其相关疾病或功能障碍。[0057]5.eIF6基因在真核细胞中序列高度保守。通过clustalw2序列比对显示，发现eIF6基因在真核细胞中序列高度保守。人与小鼠eIF6氨基酸序列有98%同源性(见图
8)，人和小鼠eIF6核苷酸序列高度保守，有91%同源性(见图9)。因此可以预期，各种真核来源的eIF6蛋白或eIF6核酸分子均可以实现本发明。
【专利附图】

【附图说明】
[0058]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0059]图1.野生型和eIF6敲基因鼠旷场测试。A:小鼠在旷场中央区域停留时间。B:小鼠在旷场中央区域走过路程。C:小鼠在旷场中30分钟内跳跃次数。D:小鼠在旷场中走过的总路程。10-12周雄性小鼠，实验动物野生型12只，敲基因小鼠13只，*p < 0.05，**p
<0.01。
[0060]图2.野生型和eIF6敲基因鼠在转棒式疲劳仪停留时间。A:单只小鼠在疲劳仪停留时间分布。B:野生型和敲基因小鼠在疲劳仪上平均停留时间。8-10周雄性小鼠，实验动物野生型12只，敲基因小鼠13只，*p < 0.05，**p < 0.01。
[0061]图3.野生型和eIF6敲基因鼠水迷宫测试。A:小鼠水迷宫中潜伏期。B:小鼠在目标象限停留时间百分比。C:小鼠水迷宫中游泳总路程。D:小鼠水迷宫中平均游泳速度。10-12周雄性小鼠，实验动物野生型12只，敲基因小鼠13只，*p < 005，**p < 0.01。
[0062]图4.野生型和eIF6敲基因在水迷宫中空间搜索策略。A:野生型小鼠在水迷宫中的空间搜索策略。B:敲基因小鼠在水迷宫中的空间搜索策略。
[0063]图5.免疫组织化学检测eIF6基因在小鼠大脑内表达情况。A:eIF6在小鼠海马中表达情况。B:eIF6在大脑皮层中表达。C:海马中eIF6表达放大图。D:大脑皮层中eIF6表达放大图。
[0064]图6.免疫组织化学检测eIF6基因在海马表达。A:eIF6在小鼠大脑海马中表达情况。B:eIF6在CA区中表达。C:eIF6在DG区中表达。D:海马CA区中eIF6亚细胞定位情况。
[0065]图7.大脑海马区和非海马区不同的蛋白表达。Hippo:海马组织，non-hippo:除海马的大脑组织，WT:野生型小鼠，ko:敲基因型小鼠。
[0066]图8.小鼠与人eIF6氨基酸序列同源性比对。黑色表示匹配，灰色表示不匹配。Homo:人类Mus:小鼠。
[0067]图9.小鼠与人eIF6核苷酸序列同源性比对。黑色表示匹配，灰色表示不匹配。Homo:人类Mus:小鼠。
[0068]图10.筛选eIF6基因干扰用的有效慢病毒干扰载体。1#、2#和3#分别表示慢病毒-FIV-Hl/U6-copGFP-1TGB4BPRNAil#、2#、3#。
[0069]图11.pFIV-Hl/U6_copGFP 质粒图谱。
[0070]图12.A.小鼠eIF6蛋白的氨基酸序列和B.小鼠eIF6基因序列。
【具体实施方式】
[0071]术语定义
[0072]记忆力减退:在本发明中，记忆力减退除与衰老相关的记忆力下降以外，还包括由心理因素和/或躯体器质性病变引起的记忆力下降。与记忆力下降有关的疾病或疾病状态如神经退行性疾病、睡眠障碍、脑动脉硬化、慢性鼻窦炎、慢性酒精中毒、脑部肿瘤、糖尿病、酒精中毒、甲状腺功能低下或神经性梅毒等。同时长期处于社会压力大、抑郁、自卑、焦虑等心理状态时也会引起记忆障碍。记忆力下降常常令病人陷入焦虑和紧张状态，而抑郁也是造成病人注意力不集中的原因，表现为注意力下降。
[0073]记忆障碍(Impaired Memory):指个体处于一种不能记住或回忆信息或技能的状态，有可能是由于病理生理性的或情境性的原因引起的永久性或暂时性的记忆障碍。在本发明中，当指个体的记忆力状态或临床表现时，记忆力减退和记忆障碍两个术语可以互换使用。
[0074]疾病状态:是指具有相关疾病的症状或功能障碍表现，但可能具有或不具有相关器官器质性病变的状态。
[0075]与海马功能受损相关的疾病或功能障碍:原发或继发引起的海马神经元器质性病变(例如，死亡)和/或功能紊乱而导致海马暂时或永久性功能受损的各种病因诸如创伤、器官萎缩、应激或其他有害刺激、中枢神经系统退行性或进行性疾病或综合征(例如，神经退行性疾病如阿尔兹海默病，大脑认知功能进行性退化综合征如老年痴呆症等)、生理性过程(例如，衰老、睡眠障碍等)或其他疾病(例如，糖尿病、抑郁症等)等。
[0076]负对照:在本发明中，作为负对照的eIF6核酸抑制分子与选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。在具体实验中将选中的eIF6核酸抑制分子打乱作为负对照，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。
[0077]筛选用细胞系:在本发明中为尽可能使实验结果接近于临床应用，我们选择敲降eIF6人源序列。然而人海马神经元元代分离取材有限制。为了克服这一困难，我们在初步筛选实验中采用相对较易取材的瘢痕成纤维细胞系(可以采用采集自临床标本的细胞培养物，也可以采用市售的人或动物成纤维细胞系)作为实验对象，体外检测eIF6慢病毒敲降结果。由于eIF6高度保守，在不同组织中广泛表达，在瘢痕组织成纤维细胞中取得的结果，特别是采用病毒干扰载体的长期敲降，也完全适用于海马神经元细胞中。在获得初步筛选结果后，为保证进一步筛选更有效的瞬时敲降的siRNA分子，则采用从小鼠分离的海马神经元细胞作为实验对象。
[0078]以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0079]本发明所用的实验仪器和材料及其来源如下:
[0080]
【权利要求】
1.一种筛选有效抑制大脑eIF6基因表达的eIF6核酸抑制分子的方法，该方法包括以下步骤: 1)将以eIF6基因序列为靶序列的长度为20~40个，优选21~27个核苷酸的候选eIF6核酸抑制分子包装到带有报告基因的病毒表达载体中，形成病毒干扰载体； 2)将步骤I)中获得的病毒干扰载体与体外培养的成纤维细胞共孵育使得所述病毒干扰载体感染成纤维细胞； 3)观察被感染的成纤维细胞中的报告基因表达产物表达，将所述报告基因表达产物表达达到80%以上的细胞用于下一步筛选； 4)提取步骤3)中筛选的报告基因表达产物表达达到80%以上的成纤维细胞的RNA并反转录为cDNA，以SEQ ID NO:11、12、13、14作为引物以反转录的cDNA作为模板进行实时定量PCR检测eIF6mRNA的表达； 5)将与阴性对照病毒载体感染的成纤维细胞相比eIF6mRNA表达相比减少50%以上的候选eIF6核酸抑制分子作为初始筛选分子； 6)将包装有步骤5)中确定的初始筛选分子的病毒干扰载体感染小鼠48小时，采用Western Blot检测小鼠大脑中突触后神经元的谷氨酸受体蛋白NMDAR的表达量，若NMDAR的表达量与野生型小鼠相比升高30 %以上，则所述初始筛选分子被确定为有效抑制eIF6基因表达的eIF6核酸抑制分子。
2.一种筛选瞬时抑制大脑eIF6基因表达的SiRNA分子的方法，该方法包括以下步骤: 1)将权利要求1中筛选的初 始筛选分子通过瞬时转染的方式转染体外培养的小鼠海马神经元细胞，将转染的海马神经元细胞继续培养72小时； 2)提取步骤I)中被转染的海马神经元细胞的蛋白，通过westernblot技术检测eIF6蛋白的表达； 3)将与阴性对照转染的海马神经元细胞中eIF6蛋白表达相比减少30%以上的海马神经元细胞所对应的候选eIF6核酸抑制分子确定为瞬时抑制eIF6基因表达的siRNA分子。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述病毒表达载体为慢病毒载体或腺病毒载体。
4.一种有效抑制大脑eIF6基因表达的eIF6核酸抑制分子，其是根据权利要求1_3中任一项所述的方法筛选的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子，所述eIF6核酸抑制分子或siRNA分子的长度为20~40个，优选21~28个核苷酸。
5.包含权利要求4所述的eIF6核酸抑制分子的病毒干扰载体，所述病毒选自腺病毒载体或慢病毒载体。
6.根据权利要求4或5所述的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子，其特征在于所述eIF6核酸抑制分子或siRNA分子包含SEQ ID NO:3_8，15-16中任一个所示的序列。
7.一种药物组合物，其包含与递送载体结合的权利要求4-6中任一项所述的eIF6核酸抑制分子或病毒干扰载体，和任选的一种或多种药用载体，其中所述递送载体选自胆固醇、纳米颗粒、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白、阳离子多肽、壳聚糖或脂质体。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的eIF6核酸抑制分子或siRNA分子或药物组合物在制备用于治疗和/或预防运动性疲劳和/或记忆力减退的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征所述药物用于预防和/或治疗选自下列的疾病或功能障碍:慢性疲劳综合征、衰老、抑郁症、脑部肿瘤、糖尿病、阿尔兹海默病、帕金森病、脑动脉硬化、慢性鼻窦炎、老年痴呆症、匹克氏病(Pick’s disease)、亨廷顿病、肝豆状核变性、精神分裂症或癫痫、神经退行性疾病、睡眠障碍、慢性酒精中毒酒精中毒、甲状腺功能低下和神经性梅毒。`
【文档编号】A61P35/00GK103525900SQ201210234087
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2012年7月6日
【发明者】崔艳艳, 吴军, 罗高兴, 桂莉, 谭江琳, 贺伟峰 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院