专利名称：Fgfr单链抗体融合蛋白及其在制备靶向肿瘤细胞药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和生物制药领域，具体地说，涉及FGFR单链抗体融合蛋白及其在制备靶向肿瘤细胞药物中的应用。
背景技术：
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)是一类由FGF基因家族成员编码的结构相关的蛋白质，目前已经发现23个成员，其中心区域都含有同源性为30%-70%的一段氨基酸序列。庞大的FGF家族成员作为细胞间的多功能信号分子调节着生物体的多种生理功能。FGFs主要通过细胞膜上的FGFR受体发挥调控功能，FGFR属于酪氨酸激酶受体，是一种单跨膜蛋白，包括与FGFs结合的细胞外部分、跨膜部分和细胞内酪氨酸激酶结构域3个部分。其中细胞外部分包含着3个免疫球蛋白样结构域(Ig-like domain, I -III)，第I个免疫球蛋白区域被认为与受体的自身抑制有关，第2和第3个免疫球蛋白结构域是FGF配体的结合位点；细胞内的酪氨酸激酶结构域则类似于VEGF受体和TOGF受体激酶。FGF共有4种受体，分别是FGFR1-4，由于存在选择性剪切，最终可形成7种受体类型。在很多肿瘤中发现FGFs及FGF受体呈异常高表达，其中以FGFR3突变或过表达最为频繁，已经在多发性骨髓瘤(Plowright EE等，1995)、尿路上皮肿瘤(Al-Ahmadie HA等，2011、膀胱癌(PandithAA 等，2010)、口腔癌(Henson BJ 等，2010、睾丸癌(Goriely A等，2009)和大肠癌(Sonvilla G等，2010等多种肿瘤中发现FGFR3激活突变或过表达。FGFR3的异常表达参与了肿瘤细胞的增殖、生存、迁移和耐药等多种生理功能。针对FGFR的抑制治疗也得到了科学家们的广泛重视。目前，阻断FGFR的方法主要有酪氨酸激酶抑制齐U、反义基因方法和抗FGFR单克隆抗体。如Henson等(2010)发现降低FGFR3表达能明显抑制细胞增殖和增强口腔癌细胞对电离辐射的敏感性。FGFR3在放疗耐受的人鳞状细胞癌(squamous cancer)中高表达，用FGFR3抑制剂TO173074靶向FGFR3能够增强人鳞状细胞癌细胞的放疗敏感度，并且HH73074与放疗联用的抗肿瘤效果明显高于单独放疗或单独使用抑制剂(Uzawa K等，2011)。FGFR3也被发现在原发性巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia, WM)细胞中过表达，FGFR3抑制剂Dovitinib处理能诱导WM细胞凋亡和抑制细胞增殖，同时也发现Dovitinib与其它药物联用能产生更好的治疗效果(AzabAK, 2011)。FGFR抑制剂不能直接抑制过量表达的FGFR基因，更不能彻底阻断FGFR的表达。而且FGFR抑制剂往往具有广谱性，对其它酪氨酸激酶也具有一定的抑制作用，因此往往对正常细胞的信号传导也具有一定的干扰，产生一定的毒性，大大限制了它的临床应用。抗FGF受体单克隆抗体是一种更为特异性的阻断FGF信号通路的途径，很多研究都表明，它是一种更为有效的方法。FGFR3的下调也被发现能明显抑制膀胱癌细胞的细胞周期和削弱其在异种移植小鼠内的肿瘤发生进程，小鼠体内实验结果显示针对FGFR3的特异性抗体处理对膀胱癌和t (4; 14)阳性的多发性骨髓瘤都具有明显的抗肿瘤效果(Qing J等，2009)。通过Anti-FGFR3中和抗体PRO-OOl抑制FGFR3自身磷酸化和下游的信号传导，能特异性的抑制FGFR3转化的多发性骨髓瘤细胞生长(Trudel S等，2006)。尽管靶向抑制FGFR3介导的信号传导能抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织生长，但仍然不能从根本上根除肿瘤，因为FGF受体仅仅是肿瘤恶性生长的一个因素，其他的信号传导途径仍然可以激活促进肿瘤细胞增殖和生存。
发明内容
本发明的目的是提供一种FGFR单链抗体(ScFV)融合蛋白。本发明的另一目的是提供所述FGFR单链抗体融合蛋白在制备靶向肿瘤细胞，特别是靶向肿瘤干细胞的药物中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种FGFR单链抗体融合蛋白，其为FGFR单链抗 体-碱性多肽融合蛋白；其中，所述FGFR单链抗体为人成纤维细胞生长因子受体1、2、3或4的单链抗体，所述碱性多肽为由9-30个碱性氨基酸组成的多肽。其中，人成纤维细胞生长因子受体1-4的单链抗体的氨基酸序列分别如Seq ID No. 7_10所示(参照美国专利US8101721)。优选的，所述碱性多肽为鱼精蛋白(protamine)、多聚精氨酸(如多聚精氨酸9R)
坐寸οFGFR3单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白，其氨基酸序列如Seq IDNo. I所示。FGFR3单链抗体-多聚精氨酸9R融合蛋白，其氨基酸序列如SeqID No. 2所示。本发明还提供编码所述FGFR单链抗体融合蛋白的基因。本发明还提供含有编码所述FGFR单链抗体融合蛋白的基因的载体。其出发载体优选为原核表达载体，更优选为pET-20b。本发明还提供含有编码所述FGFR单链抗体融合蛋白的基因的转化细胞系。本发明还提供含有编码所述FGFR单链抗体融合蛋白的基因的工程菌。工程菌的出发菌株优选为大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明还提供所述FGFR单链抗体融合蛋白的制备方法，通过在编码所述FGFR单链抗体融合蛋白的基因的5’端添加编码分子伴侣Sumo蛋白的基因序列，从而形成融合基因，将该融合基因克隆至原核细胞中进行诱导表达，并分离纯化融合蛋白，切除Sumo蛋白部分，纯化后即得。具体地说，可采用以下方法制备融合蛋白首先，合成编码FGFR ScFV-碱性多肽的核苷酸序列根据ScFV和碱性多肽的核甘酸序列，设计长引物，通过PCR引物延伸的方法获得ScFV和碱性多肽的融合基因。其次，合成编码Sum0-ScFV-碱性多肽的融合基因将编码FGFRScFV-碱性多肽的核苷酸序列通过PCR引物延伸的方法连接到编码分子伴侣Sumo蛋白的核苷酸序列上。迄今为止，主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业规模生产蛋白质的宿主细胞，大肠杆菌的主要优点是易于遗传操作并能保持转化株的稳定性；经大体积培养可获得高产率的表达产物；细胞易于培养，从而可降低生产成本。然而，使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质特别是真核细胞蛋白的一个重要缺点是，表达产物在宿主胞浆内形成所谓的包涵体，即无生物学活性的不溶性聚合体。必须对包涵体进行变性一溶解一复性处理。这一过程获得的产物回收率很低，也影响了蛋白质活性。为了克服原核表达容易形成包涵体的缺点，本发明采用Sumo分子伴侣与ScFV-碱性多肽基因融合，以提高ScFV-碱性多肽的可溶性表达。应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏好，合成相应的核苷酸序列，并将其克隆到适当的表达载体中，并转化相应的宿主。例如，以pET_20b为表达载体，BL21 (DE3)作为宿主，制备FGFR单链抗体融合蛋白的步骤如下 I)培养转化后的宿主细胞，诱导表达Sum0-ScFV-碱性多肽将转化后的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选阳性转化子，将筛选的阳性重组菌BL21 (DE3)/pET-20b-Sumo-ScFV-碱性多肽单菌落，接种到LB培养基中，37°C振荡培养16h。然后按5%比例转接到新鲜LB培养基中，进行温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化，经研究证实，OD值为O. 6时，ImM IPTG在37°C诱导3h，超声波(100w，超声2s，间隔2s)破菌，适于蛋白ScFV-碱性多肽的可溶性表达。其中可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的90%以上。2)分离纯化Sum0-ScFV-碱性多肽收集菌体，破碎后离心，取上清液进行纯化、碱性洗脱，收集洗脱液，进行树脂亲和层析，再经洗涤、洗脱，即得含Sum0-ScFV-碱性多肽的可溶性融合蛋白。3)切除Sumo部分利用Sumo蛋白酶切除分子伴侣部分取分离纯化后的可溶性融合蛋白，加入Sumo蛋白酶，在适当的条件下进行酶切反应，反应终止后，进行SDS-PAGE检测。4)纯化ScFV-碱性多肽重组蛋白酶切后的融合蛋白进行树脂亲和层析，经洗涤、洗脱、脱盐，即得纯化后的ScFV-碱性多肽重组蛋白，再经SDS-PAGE、考马氏亮蓝染色，验证蛋白纯度。本发明中所述载体、宿主菌等均可由商业途径获得，如pET_20b和BL21 (DE3)购自Novagen公司。本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆，表达载体的构建，DNA序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作，可按照本领域已知的技术进行(参见SambiOOk等,Molecular Cloning:ALaboratory Mannual, Cold Spring Harbor laboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY,1989)。本发明还提供所述FGFR单链抗体融合蛋白在制备靶向肿瘤细胞，特别是靶向肿瘤干细胞的药物中的应用，其是将融合蛋白作为小分子干扰RNA的肿瘤靶向药物递送载体。所述小分子干扰RNA为具有抑制肿瘤细胞功能的siRNA、mi RNA、sh RNA、ds RNA等中的一种或多种。本发明进一步提供靶向肿瘤干细胞的药物，其含有所述FGFR单链抗体融合蛋白和具有抑制肿瘤干细胞功能的小分子干扰RNA，任选含有药用赋形剂。 前述靶向肿瘤干细胞的药物中，优选所述FGFR单链抗体融合蛋白为FGFR3单链抗体-碱性多肽融合蛋白。FGFR3的单链抗体ScFV可以靶向肿瘤细胞表面高表达的FGFR3，碱性多肽可以携带带负电荷的siRNA，siRNA进入肿瘤细胞后，通过抑制特定基因的mRNA，以达到抑制肿瘤细胞增殖或生存或诱导肿瘤干细胞分化等功能。
前述靶向肿瘤干细胞的药物中，更优选所述FGFR单链抗体融合蛋白为FGFR3单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白或FGFR3单链抗体-多聚精氨酸9R融合蛋白。利用这两种融合蛋白作为核酸运载工具，携带siRNA去攻击FGFR3高表达的各类肿瘤细胞和组织(如白血病干细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞等)，通过诱导肿瘤细胞凋亡、生长抑制和分化等，最终起到抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作用。前述靶向肿瘤干细胞的药物中，最优选所述FGFR单链抗体融合蛋白为FGFR3单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白。在本发明中，发明人设计的FGFR3单链抗体融合蛋白，既可以靶向抑制肿瘤细胞表面的FGFR3信号途径，还可以用来携带小分子RNA去抑制与肿瘤细胞增殖、生存相关的基因表达，起到彻底杀死肿瘤细胞的目的。研究发现，很多肿瘤干细胞中高表达FGFR3，如已知的急性粒细胞白血病干细胞、慢性粒细胞白血病干细胞等。通过单链抗体-多肽融合蛋白，可以携带一些与肿瘤干细胞自我更新相关基因(如c-myc、Bmil和Dotl等)的siRNA，可以在靶向肿瘤干细胞的同时，通过单链抗体抑制肿瘤干细胞增殖，通过siRNA诱导肿瘤干细 胞分化，进而彻底根除肿瘤干细胞，有助于解决目前临床中肿瘤干细胞耐药的难题。本发明中，ScFV-碱性多肽融合蛋白与Sumo融合后，蛋白表达量明显提高，可溶性蛋白含量大大增加，通过DEAE-S印harose FF阴离子交换、Ni-NTA亲和层析以及S印hadexG-25脱盐，最终获得蛋白纯度超过95%的具有较高生物学活性的ScFV-碱性多肽重组蛋白，为大规模产业化生产奠定了基础。
图I为本发明实施例3中重组Sumo-FGFR3 ScFV-碱性多肽的SDS-PAGE图，其中I为诱导后3h ；2为诱导前；M为蛋白Marker。图2为本发明实施例3中目的蛋白FGFR3 ScFV-碱性多肽的Western Blot检测图，其中1为FGFR3 ScFV-protamine融合蛋白；2为FGFR3 ScFV_9R融合蛋白。图3显示了本发明实施例4中FGFR3 ScFV-碱性多肽融合蛋白与siRNA的结合能力。图4显示了本发明实施例5中FGFR3 ScFV-碱性多肽融合蛋白可以携带c_mycsiRNA诱导K562细胞分化，其中A为FGFR3 ScFV-碱性多肽融合蛋白(对照组);B为FGFR3ScFV-碱性多肽融合蛋白+ c-myc siRNA (箭头标记为较为典型的分化细胞)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 实施例I FGFR3 ScFV-碱性多肽融合基因的PCR合成根据文献(Martinez-Torrecuadrada J等，2005)中报道的编码FGFR3单链抗体的基因序列，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成了 FGFR3ScFV与碱性多肽的融合基因，其中，FGFR3单链抗体-鱼精蛋白融合基因和FGFR3单链抗体-多聚精氨酸9R融合基因的核苷酸序列分别为Seq ID No4和6。实施例2 pET-20b-Sumo-FGFR3 ScFV-碱性多肽表达载体的构建
参照ZL200810102542. 4中描述的载体构建方法。为了将合成的FGFR3 ScFV-碱性多肽融合基因同编码Sumo分子伴侣的核苷酸序列融合，根据Sumo序列N端设计合成引物P1，根据Sumo C端和ScFV N端设计引物P2，P2包含20bp与ScFV-碱性多肽基因互补的序列。以Pl和P2为引物(引物序列见表I )，通过PCR方法合成Sumo-S序列。PCR反应体系一
权利要求
1.FGFR单链抗体融合蛋白，其特征在于，其为FGFR单链抗体-碱性多肽融合蛋白；其中，所述FGFR单链抗体为人成纤维细胞生长因子受体1、2、3或4的单链抗体，所述碱性多肽为由9-30个碱性氨基酸组成的多肽。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，其为FGFR3单链抗体-碱性多肽融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，其为FGFR3单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No. I所示。
4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，其为FGFR3单链抗体-多聚精氨酸9R融合蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No. 2所示。
5.编码权利要求1-4任一项所述融合蛋白的基因。
6.含有权利要求5所述基因的载体。
7.含有权利要求5所述基因的工程菌。
8.权利要求1-4任一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，在权利要求5所述基因的5’端添加编码分子伴侣Sumo蛋白的基因序列形成融合基因，将该融合基因克隆至原核细胞中进行诱导表达，并分离纯化融合蛋白，切除Sumo蛋白部分，纯化后即得。
9.权利要求1-4任一项所述FGFR单链抗体融合蛋白在制备靶向肿瘤细胞药物中的应用，其是将融合蛋白作为小分子干扰RNA的肿瘤靶向药物递送载体。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述小分子干扰RNA为具有抑制肿瘤细胞功能的siRNA、mi RNA、sh RNA、ds RNA中的一种或多种。
全文摘要
本发明提供了一种人成纤维细胞生长因子受体(FGFR)单链抗体融合蛋白，其为FGFR单链抗体-碱性多肽融合蛋白。其中，FGFR单链抗体为FGFR1、2、3或4的单链抗体，碱性多肽为由9-30个碱性氨基酸组成的多肽。本发明还提供所述FGFR单链抗体-碱性多肽融合蛋白在制备靶向肿瘤细胞药物中的应用。利用该融合蛋白作为核酸运载工具，携带小分子干扰RNA(如siRNA)去攻击相应的FGFR高表达的各类肿瘤细胞和组织(如白血病干细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞等)，通过诱导肿瘤细胞凋亡、生长抑制和分化等，最终起到抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作用。
文档编号A61K47/42GK102875684SQ201210323399
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者肖业臣, 李校堃 申请人:吉林大学