针对人il33r的抗体及其用途
【专利摘要】与IL33R结合的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQ?ID?NO:1的CDR3区、SEQ?ID?NO:2的CDR2区和SEQ?ID?NO:3的CDR1区，并且其特征在于轻链可变域包含SEQ?ID?NO:4的CDR3区、SEQ?ID?NO:5的CDR2区和SEQ?ID?NO:6的CDR1区，或者所述抗体是具有治疗炎性疾病的有利性质的嵌合抗体、人源化抗体或T细胞表位缺失的抗体变体。
【专利说明】针对人IL33R的抗体及其用途
[0001]本发明涉及针对人IL33R的抗体(IL33R抗体)，用于产生所述抗体的方法、含所述抗体的药物组合物及其用途。
[0002]发明背景
[0003]人IL33是IL-1家族的白细胞介素_1_样细胞因子，其通过IL-1受体相关的ILL33受体(受体:IL1RL1、T1/ST2的同义词)传递信号，并诱导2型T辅助细胞-相关的细胞因子。IL33 (Swiss-Prot登记号095760)的同义词是白细胞介素-1家族成员11 (IL-1Fll)和来自毛细血管后微静脉(NF-HEV)的核因子。NF-HEV描述于BaekkevoId，.S.，等人，J.Pathol.163 (2003) 9-79 中。IL33 由 Schmitz，J.，等人，Immunity 23 (2005) 479-490 描述。
[0004]人IL33受体，IL33R(ILRL1的同义词；SwissProt登记号Q01638，其他名称为ST2、T1/ST2、Fit-1和DER4)在成纤维细胞中通过生长刺激来诱导，并且还可以在Th2细胞中通过抗原刺激诱导。根据本发明，IL33R和ST2表示人IL33R。Tominaga, S.，等人，(FEBSLett.258 (1989)301-304 ；Biochim.Biophys.Acta.1171 (1992)215-218)和 Yanagisawa,K.，(FEBS Lett.318 (1993) 83-87)鉴定了人ST2 (分泌形式)、ST2L (跨膜受体形式)和ST2V (变体Glu-78)。人ST2仅在受生长刺激的BALB/C-3T3细胞中表达，并是由生长因子诱导的初次应答基因家族的成员。ST2编码在序列上与人白细胞介素I受体(I型和2型)的胞外部分相似的蛋白质。使用IL33R敲除型小鼠的研究表明，IL33R参与TH2应答的早期事件(Kropf, P,等人，Infect.1mmunity 70 (2002) 5512-5520 ；Hoshino, K.，等人，J.Exp.Med.190 (1999) 1541-1548 ;Senn，等人，Eur.J.1mmunol.30 (2000) 1929-1938 ；Townsend,M.J.，等人，J.Exp.Med.191 (2000) 1069-1076)。认为ST2是TH2免疫的标志、活化剂和调节剂( Kumar，R.K.，等人，Cl in.Exp.Al Iergy 32 (2002) 1394-1396)。
[0005]在许多出版物中描述了抗IL33R抗体及其在免疫功能中的作用。抗人ST2抗体Mab523 和多克隆抗体 AF523 是在商业上可从 R&D Systems (http://www.rndsystems.com)得到的。抗人ST2抗体HB12是在商业上可从antibodies-online GmbH,德国和MBL Int.Corp.(www.mblinti, com)得到的。抗IL33R抗体导致了 TH2-型免疫应答的降低。该抗体抑制嗜酸性粒细胞浸润、IL-5产生，以及IgE产生。ST2在动物模型中对哮喘的作用的评价导致了 CD4+T细胞上小鼠IL33R的表达增加，表明IL33R在变态反应或哮喘应答中的作用( Lohnmg, ll，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95 (1998) 6930-6935 和 Xu，D.，等
人，J.Exp.Med.187 (1998) 787-794 ；Coyle, A.J.，等人，J.Exp.Med.190 (1999) 895-902)。Meisel, C.，等人，J.1mmunol.166 (2001) 3143-3150 研究了 CD4+T 细胞上 T1/ST2 表达，
以及通过T1/ST2交联诱导2型细胞因子产生的调节和功能。Lohning, μ.，等人，在大
鼠中产生了抗小鼠ST2抗体。在变应原刺激前用20 μ g (大约0.8mg/kg)的该抗体预处理I小时，降低了小鼠气道中嗜酸性粒细胞数的70%O Kumar, S.,等人，(Biochem.Biophys.Res.Comm.235 (1997) 474-478 和 J.Biol.Chem.270 (1995) 27905-27913)描述了通过使用针对在果蝇中表达的纯化的可溶性ST2受体产生的兔多克隆抗体进行的免疫沉淀，来检测ST2蛋白的表达。用BALB/c小鼠进行的研究显示，用抗IL33抗体处理诱导了更高的THl型应答。Kuroiwa, K.，等人，Hybridoma 19 (2000) 151-159描述了定量患者血清中人ST2蛋白的ELISA系统。抗IL33R抗体还降低了由于RSV感染的影响(Walzl，等人，J.Exp.Med.193 (2001) 785-792)。还在关节炎动物模型中研究了抗IL33R抗体(Leung，B.P.，等人，J.1mmunol.173 (2004) 145-150 ；ffalzl,等人，J.Exp.Med.193 (2001) 785-792)。Smithgall, M.D.，等人，Int.1mmunol.20 (2008) 1019-1030 研究了在抗 huST2 抗体存在的情况下，NK 细胞中的干扰素 Y 水平。在 WO 2005/079844,US 7,087, 396,WO 2001/021641、WO 2002/038794、WO 2003/094856 中提及了 IL33R 和 / 或针对 IL33R 的抗体。Oboki，K.，等人，Allergology Int.59 (2010) 143-160，综述了 IL-33 和 IL-33 受体在宿主防御和疾病中的作用，以及抗ST2抗体、可溶性ST2和抗IL-33抗体对小鼠气道炎症的作用。
[0006]发明概沭
[0007]本发明包括与IL33R结合的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQ ID N0:1的CDR3区、SEQ ID NO: 2的CDR2区和SEQ ID NO: 3的CDRl区，并且轻链可变域包含SEQ IDNO:4的CDR3区、SEQ ID NO:5的CDR2区和SEQ ID NO:6的CDRl区。优选地，该抗体的特征在于重链可变域包含SEQ ID N0:7。优选地，该抗体的特征在于重链可变域包含SEQ IDNO: 7，并且轻链可变域包含SEQ ID NO:8。优选地，该抗体与IL33R结合，并且其特征在于上述氨基酸序列和氨基酸序列片段是在ChI和Ch2之间的氨基酸位置216-240，优选地在氨基酸位置220-240处的铰链区和/或在Ch2和Ch3之间的氨基酸位置327-331处的第二域间区中经修饰的人IgGl同种型。优选地，该抗体包含突变L234A (在氨基酸位置234处丙氨酸替代了亮氨酸)和L235A。SEQ ID NO: 9显示了包含突变L234A和L235A的优选的重链恒定域。优选地，该抗体与IL33R结合，并且所述抗体的特征在于上述氨基酸序列和氨基酸序列片段是在ChI和Ch2之间的氨基酸位置216-240，优选地在氨基酸位置220-240处的铰链区和/或在Ch2和Ch3之间的氨基酸位置327-331处的第二域间区中经修饰的人IgG4同种型。优选地，该抗体包含突变L235E (在氨基酸位置235处谷氨酸替代了亮氨酸)和S228P(在氨基酸位置228处脯氨酸替代 了丝氨酸)。
[0008]抗体ral70 (Mab ral70)是本发明优选的实施方案。本发明的其他实施方案是抗体ral70的嵌合抗体、人源化抗体或者T细胞表位缺失的抗体变体。
[0009]抗体ral70的优选的人源化抗体变体的特征在于重链可变域包含SEQ ID NO: 24的CDR3区、SEQ ID NO: 23的CDR2区和SEQ ID NO: 22的CDRl区，并且轻链可变域包含SEQID NO: 33 的 CDR3 区、SEQ ID NO: 32 的 CDR2 区和 SEQ ID NO: 31 的 CDRl 区，或者重链可变域包含 SEQ ID NO:28 的 CDR3 区、SEQ ID NO:27 的 CDR2 区和 SEQ ID NO:26 的 CDRl 区，并且轻链可变域包含SEQ ID NO:33的CDR3区、SEQ ID NO:32的CDR2区和SEQ ID NO:31的⑶Rl区。优选地，人源化抗体的特征在于重链可变域包含SEQ ID N0:21或25。优选地，人源化抗体的特征在于轻链可变域包含SEQ ID N0:30。
[0010]抗体以ΙΟ,Μ或更低的亲和力与IL33R特异性结合。
[0011]本发明还涉及与IL33R结合的抗体，并且其特征在于结合的IL33R表位与单克隆抗体ral70结合的IL33R表位相同。抗体以至少I(T8M4-1(T12M4的亲和力与IL33R结合，所述抗体优选地为在ChI和Ch2之间的氨基酸位置216-240，优选地为在氨基酸位置220-240处的铰链区和/或在Ch2和Ch3之间的氨基酸位置327-331处的第二域间区中经修饰的人IgGl同种型。优选地，抗体是包含突变L234A和L235A的人IgGl同种型或者包含突变L235E和S228P的人IgG4同种型。
[0012]优选地，抗体是人源化抗体或人抗体。优选地，根据本发明的抗体抑制IL33与IL33R的结合(对于人IL33/IL33R，IC50值为0.32nM，并且对于食蟹猴IL33/IL33R，IC50值为 0.13nM)。[0013]根据本发明的抗体在嗜酸性粒细胞测定法、肥大细胞测定法、Th2测定法、嗜碱性粒细胞测定法(IL-5)中优选地显示出5nM或更低的IC5tl值。该抗体在类风湿性关节炎、哮喘或溃疡性结肠炎的治疗中特别有用。
[0014]本发明的其他实施方案是包含根据本发明的抗体的药物组合物。优选地，药物组合物包含这样的抗体，其特征在于结合的IL33R表位与单克隆抗体ral70结合的IL33R表位相同。优选地，药物组合物的抗体与至少的亲和力与IL33R结合，其优选地为在ChI和Ch2之间的氨基酸位置216-240，优选地在氨基酸位置220-240处的铰链区和/或在Ch2和Ch3之间的氨基酸位置327-331处的第二域间区中经修饰的人IgGl同种型。优选地，抗体是包含突变L234A (在氨基酸位置234处丙氨酸替代了亮氨酸)和L235A的人IgGl同种型或者包含突变L235E和S228P的人IgG4同种型。
[0015]根据本发明的其他实施方案是根据本发明的抗体的用途，所述抗体用于产生药物组合物。优选地，药物组合物包含这样的抗体，其特征在于结合的IL33R表位与单克隆抗体ral70结合的IL33R表位相同。优选地，药物组合物的抗体以至少的亲和力与IL33R结合，所述抗体优选地为在ChI和Ch2之间的氨基酸位置216-240，优选地在氨基酸位置220-240处的铰链区和/或在Ch2和Ch3之间的氨基酸位置327-331处的第二域间区中经修饰的人IgGl同种型。优选地，抗体是包含突变L234A (在氨基酸位置234处丙氨酸替代了亮氨酸)和L235A的人IgGl同种型或者包含突变L235E和S228P的人IgG4同种型。
[0016]本发明的其他实施方案是根据本发明的抗体的用途，所述抗体用于治疗溃疡性结肠炎或者哮喘。本发明的其他实施方案是产生包含根据本发明的抗体的药物组合物的方法。优选地该药物组合物包含这样的抗体，其特征在于结合的IL33R表位与单克隆抗体ral70结合的IL33R表位相同。优选地，药物组合物的抗体以至少的亲和力与IL33R结合，所述抗体优选地为在ChI和Ch2之间的氨基酸位置216-240，优选地在氨基酸位置220-240处的铰链区和/或在Ch2和Ch3之间的氨基酸位置327-331处的第二域间区中经修饰的人IgGl同种型。优选地，抗体是包含突变L234A (在氨基酸位置234处丙氨酸替代了亮氨酸)和L235A的人IgGl同种型或者包含突变L235E和S228P的人IgG4同种型。
[0017]本发明的其他实施方案是编码与IL33R结合的抗体的重链的核酸，其特征在于包含SEQ ID NO:1的重链CDR3区和优选地IgGl重链恒定域中的突变L234A和L235A。优选地，抗体另外地包含SEQ ID N0:2的重链CDR2区和SEQ ID NO:3的CDRl区。本发明的其他实施方案是编码与IL33R结合的抗体的轻链，其特征在于包含SEQ ID N0:4的轻链⑶R3区和优选地IgGl重链恒定域中的突变L234A和L235A。优选地，抗体另外地包含SEQ IDN0:5的轻链⑶R2区和SEQ ID NO:6的⑶Rl区。本发明的其他的实施方案是编码根据本发明的抗体的核酸，其特征在于包含SEQ ID NO: 7的重链可变域和SEQ ID NO: 8的轻链可变域，以及优选地重链人IgGl恒定域中的突变L234A和L235A或者重链人IgG4恒定域中的突变 L235E 和 S228P。
[0018]本发明的其他实施方案是编码与IL33R结合的抗体的重链的核酸，其特征在于包含SEQ ID N0:24的重链CDR3区和优选地IgGl重链恒定域中的突变L234A和L235A。优选地，抗体另外包含SEQ ID N0:23的重链CDR2和SEQ ID N0:22的CDRl区。本发明的其他实施方案是编码与IL33R结合的抗体的轻链的核酸，其特征在于包含SEQ ID N0:33的轻链⑶R3区和优选地IgGl重链恒定域中的突变L234A和L235A。优选地，抗体另外包含SEQID NO:2的轻链⑶R32区和SEQ ID N0:31的⑶Rl区。本发明的其他实施方案是编码根据本发明的抗体的核酸，其特征在于包含SEQ ID NO:21的重链可变区和SEQ ID N0:30的轻链可变域，以及优选地重链人IgGl恒定域中的突变L234A和L235A或者重链人IgG4恒定域中的突变L235E和S228P。
[0019]本发明的其他实施方案是编码与IL33R结合的抗体的重链的核酸，其特征在于包含SEQ ID勵:28的重链0)1?3区和优选地1861重链恒定域中的突变1^2344和1^2354。优选地，抗体另外包含SEQ ID N0:27的重链CDR2和SEQ ID NO:26的CDRl区。本发明的其他实施方案是编码与IL33R结合的抗体的轻链的核酸，其特征在于包含SEQ ID N0:33的轻链⑶R3区和优选地IgGl重链恒定域中的突变L234A和L235A。优选地，抗体另外包含SEQ IDNO:2的轻链⑶R2区和SEQ ID NO:31的⑶Rl区。本发明的其他实施方案是编码根据本发明的抗体的核酸，其特征在于包含SEQ ID NO: 25的重链可变域和SEQ ID NO: 30的轻链可变域，以及优选地重链人IgGl恒定域中的突变L234A和L235A或者重链人IgG4恒定域中的突变L235E和S228P。
[0020]优选地，根据本发明的抗体的特征在于恒定链是人类来源的。此类恒定链是本领域熟知的，并且例如由 Kabat (Kabat, E.A.,等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1991)，和 Johnson，G.和 Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28 (2000)214-218)描述。例如，有用的人重链恒定区包含SEQ ID NO:9(包含突变L234A和L235A的人IgGl)的氨基酸序列或者SEQ ID` NO: 29 (包含突变L235E和S228P的人IgG4)的氨基酸序列。例如，有用的人轻链恒定区包含SEQ ID NO: 12或34的轻链恒定区κ的氨基酸序列。进一步优选的是抗体是小鼠来源的，并且包含根据Kabat (Kabat, E.A.，等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, NationalInstitutes of Health,Bethesda, MD (1991),和 Johnson,G.和 Wu, T.T., Nucleic AcidsRes.28 (2000) 214-218)的小鼠抗体的抗体可变序列框。
[0021]特别地，根据本发明的抗体的特征在于抑制IL33与IL33R的结合，因此抑制经由IL-33R/IL-lRacP信号复合体的信号转导。
[0022]根据本发明的抗体优选地是人同种型IgGl。优选地，Y I重链恒定区显示于SEQID NO: 10或29中，以及SEQ ID NO: 11 (没有L234A和L235A突变)中。优选地轻链恒定区K显示于SEQ ID NO: 12或34中。
[0023]优选地，根据本发明的抗体的特征在于不结合人补体因子Clq，因此避免了⑶C效应子功能。
[0024]根据本发明的抗体优选地为在ChI和Ch2之间的氨基酸位置216-240，优选地为在氨基酸位置220-240处的铰链区和/或在Ch2和Ch3之间的氨基酸位置327-331处的第二域间区中经修饰的人IgGl同种型。优选地，根据本发明的抗体的特征在于是人IgGl同种型，其在 L234 (氨基酸位置 234 处为亮氨酸)、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和/或P329 (根据EU索引编号)中含有至少一个突变。优选地，抗体是包含突变L234A (在氨基酸位置234处丙氨酸替代了亮氨酸)和L235A的人IgGl同种型或者包含突变L235E和S228P的人IgG4同种型。
[0025]本发明还提供了含根据本发明的核酸的表达载体(其能在原核或真核宿主细胞表达所述核酸)，以及含有此类载体的宿主细胞以用于该抗体的重组产生。本发明还包含原核或真核宿主细胞，其含有根据本发明的载体。本发明还包含用于产生根据本发明的重组人抗体或人源化抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据本发明的核酸，并从所述细胞或细胞培养上清液中回收所述抗体。本发明还包含通过该重组方法获得的抗体。
[0026]根据本发明的抗体对需要IL33R靶向治疗的患者显示出益处。根据本发明的抗体具有新的和创造性特性，其特别地给患此种免疫疾病，特别地患类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘的患者带来了益处。根据本发明的抗体不会使受治疗的患者易于感染葡萄球菌和肠细菌。本发明还提供了治疗患类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘的患者的方法，其包括将有效量的根据本发明与IL33R结合的抗体施用给诊断为患有该疾病(因此需要该治疗)的患者。抗体优选地以药物组合物的形式施用。本发明的其他实施方案是治疗患类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘的患者的方法，其特征在于给患者施用根据本发明的抗体。本发明还包含根据本发明的抗体的用途，所述抗体用于治疗患类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘的患者，以及用于产生根据本发明的药物组合物。此外，本发明包含用于产生根据本发明的药物组合物的方法。
[0027]本发明还包含药物组合物，其包含根据本发明的抗体，以及任选地用于配制药物目的的抗体的缓冲液和/或佐剂。本发明还提供了药物组合物，其包含在可药用载体中的根据本发明的抗体。在一个实施方案中，药物组合物可以包含于产品或试剂盒中。
[0028]发明详沭
[0029]术语“抗体”包括多种形式的抗体结构，其包括但不限于全抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选地是人源化抗体、嵌合抗体或者另外的基因工程抗体，只要保留了根据本发明所表征的性质。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选地所述抗体的可变域或者至少所述抗体的抗原结合位点。抗体片段的实例包括，双抗体、单链抗体分子，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体例如在Huston, J.S.,Methods in Enzymol.203( 1991)46-88中描述。此外，抗体片段包含这样的单链多肽，其具有Vh结构域的特征，即能与'结构域组装在一起或者具有与IL33R结合的'结构域的特征，即能与Vh结构域组装在一起成为功能性抗原结合位点，从而提供根据本发明的抗体的性质。如本文中所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一的氨基酸组合物的抗体分子的制备物。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中与亲本免疫球蛋白的CDR相比，所述抗体已经修饰了构架区和/或“互补决定区”(CDR)以包含不同物种的免疫球蛋白的CDR。在优选的实施方案中，将小鼠CDR嫁接到人抗体的构架区中，以制备“人源化抗体”。参见，例如Riechmann，L.，等人，Nature 332 (1988) 323-327 ;和 Neuberger，Μ.S.，等人，Nature 314 (1985) 268-270。[0030]如本文中所用，术语“与IL33R结合”指的是在ELISA结合测定法中，抗体与固定化的人IL33R结合。如果抗体以12ng/ml以上的抗体浓度造成了信号比没有抗体的对照高平均值+3倍标准差或者更多，那么认为结合。
[0031]术语“亲和力”指分子(例如，抗体)的单结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，如本文中所用，“结合亲和力”指反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X与其配偶体Y的亲和力可以一般地通过解离常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的常用方法测量亲和力，所述方法包括在本文中所述的那些方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
[0032]术语“表位”表示能与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链组成，并且表位通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在的情况下，前者而不是后者丧失了结合。优选地，根据本发明的抗体与天然的而不是变性的IL33R特异性结合。本发明的IL33R抗体结合的IL33R上的表位与抗体Mab ral70结合的表位相同。可以使用本领域已知的技术测定根据本发明的IL33R抗体的表位结合性质。通过体外交叉封闭结合测定法(crossblocking binding assay)测试IL33R抗体，以测定测试抗体阻碍抗体Mab ral70与IL33R结合的能力。如果抗体Mab ral70取代了至少15%的测试抗体，那么表位几乎近似。
[0033]如本文中所用，“可变域”(轻链的可变域(')、重链的可变域(Vh))表示抗体与抗原结合中直接涉及的每一个轻链和重链域对。轻链可变域和重链可变域具有相同的一般结构，并且每一结构域包含四个构架(FR)区，其序列是广泛保守的，所述构架区通过三个“超变区”(或者互补决定区，⑶R)连接。构架区采用β-片层构象，并且⑶R可以形成连接β-片层结构的环。每一链中的⑶R通过构架区保持其三维结构，并与来自其他链的⑶R —起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥着特别重要的作用，因此`提供了本发明的其他目的。
[0034]当在本文中使用时，术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是那些可变域，而非如本文中所定义的超变区。因此，抗体的轻链和重链可变域从N-端至C-端包含结构域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合并且限定抗体性质的区域。根据Kabat,等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1991)的标准定义和/或那些来自“超变环”的残基来确定CDR和FR区。
[0035]如本申请中所用，术语“氨基酸”表示一组天然存在的羧基α -氨基酸，其包括丙氨酸(三字母编码:ala,单字母编码:A)、精氨酸(arg, R)、天冬酰胺(asn, N)、天冬氨酸(asp, D)、半胱氨酸(cys, C)、谷氨酰胺(gin, Q)、谷氨酸(glu, E)、甘氨酸(gly, G)、组氨酸(his, H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys, K)、甲硫氨酸(met, Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、丝氨酸(ser, S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp, W)、酪氨酸(tyr,Y)和纟颜氨酸(val, V)。[0036]如本文中所用，术语“核酸”或“核酸分子”意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或者双链的，但优选地是双链DNA。当核酸与另一核酸有功能性关系时，核酸是“有效连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA如果表达为参与多肽分泌的前蛋白，那么其与多肽的DNA有效连接；如果启动子或增强子影响了序列的转录，那么其与编码序列有效连接；或者如果核糖体结合位点的位置是为了协助翻译，那么其与编码序列有效连接。通常，“有效连接”指的是连接的DNA序列是共线连接，并且在分泌前导序列的情况下是邻近的并且在阅读框中连接。然而，增强子并非必需是邻近的。连接通过在方便的限制位点处连接来实现。如果此类位点不存在，那么根据常规实践，使用合成的寡核苷酸接头或连接体。如本文中所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且全部此类指代包括子代。因此，不考虑转化的数目，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原始的主题细胞及来源于其的培养物。还应当理解，由于故意的或者非故意的突变，全部子代在DNA含量方面都不是精确相同的。当筛查包括最初转化的细胞时，变异的子代具有相同的功能或生物学活性。[0037]抗体的“Fe部分”虽然不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能。“抗体的Fe部分”是本领域技术人员熟知的术语，并基于抗体的木瓜蛋白酶切割定义。取决于抗体的重链恒定区的氨基酸序列，将抗体或免疫球蛋白划分为以下的种类:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且可以将其中几种进一步划分成亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4、IgAl和IgA2。根据重链恒定区，分别将免疫球蛋白的不同种类称为α、δ、ε、Y和μ。抗体的Fe部分直接参与ADCC (抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)和基于补体活化的⑶C (补体依赖的细胞毒性)、Clq结合和Fe受体结合。补体活化(⑶C)通过补体因子Clq与大多数IgG抗体亚类的Fe部分结合引发。尽管抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但与Clq的结合通过Fe部分中确定的结合位点引起。此类结合位点是现有技术已知的，并且例如由 Boackle，R.J.，等人，Nature 282 (1979) 742-743 ;Lukas，T.J.，等人，J.Tmmunol.127 (1981)2555-2560 ;Brunhouse,R.和 Cebra,J.J.,Mol.1mmunol.16 (1979)907-917 ；Burton, D.R.,等人，Nature 288 (1980) 338-344 ；Thommesen, J.E.,等人，Mol.1mmunol.37 (2000) 995-1004 ；Idusogie, E.E.，等人，J.1mmunol.164 (2000) 4178-4184 ；Hezareh, M.,等人，J.Virology 75 (2001) 12161-12168 ；Morgan, A.,等人，Immunology86 (1995) 319-324 ；EP 0 307 434 描述。此类结合位点例如是，L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 (根据 Kabat 的 EU 索引编码，Kabat, Ε.A.，等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD (1991))。亚类 IgGl、IgG2 和 IgG3 的抗体通常显不出补体活化和Clq结合,而IgG4并不活化补体系统,也不结合Clq。
[0038]根据本发明的抗体包含来自人源的Fe部分，其是人抗体亚类IgGl或IgG4的Fe部分。对于根据本发明的抗体的Fe部分，优选地不能检测到如下所定义的Clq结合。
[0039]因此，本发明包含根据本发明的抗体，其特征在于所述抗体结合IL33R、含有来自人源的Fe部分，并且不结合人补体因子Clq，因此避免了⑶C效应子功能。
[0040]优选地，根据本发明的抗体涉及人IgGl或IgG2亚类的Fe Y受体结合，具有在L234、L235和/D265中的突变，和/或含有PVA236突变。优选地是突变L234A、L235A、L235E和/或PVA236 (PVA236指的是来自IgGl的氨基酸位置233-236的氨基酸序列ELLG (以单字母氨基酸密码给出)或者IgG4的EFLG被PVA替换)。因此，本发明提供了根据本发明的抗体，其特征在于所述抗体是人亚类IgGl的抗体，含有在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中的至少一个突变。在一个实施方案中，抗体是人抗体。在另一个实施方案中，抗体是人源化抗体。在一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的抗体，其含有来自人源的Fe部分，并且其特征在于所述抗体是含有L234、L235、D270、Ν297、Ε318、Κ320、Κ322、Ρ331中至少一个突变的人亚类IgGl的抗体，并且其中在BIAcore测定法中，所述抗体以低于10_8Μ的Kd值与IL33R结合。在另一个实施方案中，Kd范围为10_η_10_9Μ。
[0041]可以根据Idusogie, Ε.Ε.，等人，J.1mmunol.164 (2000) 4178-4184 测量 Clq 结合。根据本发明，在这样的测定法中表征了没有Clq结合，在所述测定法中，用不同浓度的抗体包被ELISA平板，加入人Clq。通过直接针对人Clq的抗体以及之后用过氧化物酶底物ABTS㊣(2，2'-连氮基-双-[3-乙基苯噻唑啉磺酸盐])检测过氧化物酶标记的缀合物来检测Clq结合。根据本发明，对于测试抗体，如果以10 μ g/ml的抗体浓度在405nm处的光密度小于0.05，那么认为没有Clq结合。
[0042]优选地，根据本发明的抗体特征在于恒定链是人源的。此类恒定链是现有技术熟知的，并且例如由 Kabat (Kabat, Ε.A.，等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,MD (1991);和 Johnson，G.和 Wu, T.T., Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218)所述。例如，有用的人重链恒定区包含SEQ ID NO: 10、11或29。例如，有用的人轻链恒定区包含SEQID NO: 12或34的轻链恒定区K的氨基酸序列。
[0043]本发明的其他实施方案是编码根据本发明的抗体的重链和轻链的核酸。
[0044]本发明包含用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于给患者施用治疗有效量的根据本发明的抗体。本发 明包括根据本发明的抗体用于治疗的用途。本发明包括根据本发明的抗体的用途，所述抗体用于制备用于预防和尤其是治疗炎性疾病的药物。本发明包括根据本发明的抗体用于治疗炎性疾病，优选地用于治疗类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎和哮喘的用途。
[0045]此外，根据本发明的抗体包括这样的抗体，其具有不影响或改变根据本发明的抗体的上述特征的“保守序列修饰”(变异的抗体)、核苷酸和氨基酸序列修饰。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变引入修饰。保守氨基酸取代包括以下的一种方式:其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，可以优选地用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代人抗IL33R抗体中预测的非必需氨基酸残基。因此，在本文中，“变异的”抗IL33R抗体指这样的分子，在亲本抗体的一个或多个可变区中的氨基酸序列上所述分子与“亲本”抗IL33R抗体氨基酸序列相差多达10个，优选地约2-约5个添加、缺失和/或取代。可以通过基于如Riechmann，L.，等人，Nature 332 (1988)323-327和 Queen, C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86 (1989) 10029-10033 所述的分子建模的诱变来进行氨基酸取代。
[0046]本发明的其他实施方案是用于产生针对IL33R的抗体的方法，所述抗体不与Fe Y受体和/或Clq结合，所述抗体的特征在于以这样的方式修饰编码与IL33R结合的人IgGl型抗体的重链的核酸序列，以使所述经修饰的抗体不结合Clq和/或Fe Y受体，将所述经修饰的核酸和编码所述抗体的轻链的核酸插入到表达载体中,将所述载体插入到真核宿主细胞中，表达并从宿主细胞或上清液中回收编码的蛋白质。
[0047]在本文中，就序列而言，将同一性或同源性定义为在比对序列和引入空位后，候选序列中与亲本序列相同的氨基酸残基的百分比，根据需要，以实现最大序列同一性百分比。应当理解，N-端、C-端或内部延伸、缺失或者抗体序列中的插入都不应影响序列同一性或同源性。变体保留了结合人IL33R的能力，并优选地具有优于亲本抗体的那些性质。例如，变体可以在治疗期间具有降低的副作用。
[0048]“亲本”抗体包含抗体ral70的⑶R区，并且优选地用于制备变体。优选地，亲本抗体具有人构架区，并且如果存在，其具有人抗体恒定区或人抗体恒定结构域。例如，亲本抗体可以是人源化抗体或人抗体。
[0049]根据本发明的抗体优选地通过重组方法产生。此类方法是现有技术广泛已知的，并包括在原核和真核细胞中表达蛋白质，以及随后分离抗体多肽，并通常纯化至可药用纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入到表达载体中。表达在合适的原核或真核宿主细胞，例如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行，并从细胞(从上清液中或者在细胞裂解后)中回收抗体。抗体的重组产生是现有技术熟知的，并例如在Makrides, S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202 ；Geisse,S.，等人，Protein Expr.Purif.8 (1996)271-282 ；Kaufman,R.J.，Mol.Biotechnol.16 (2000) 151-160 ；fferner, R.G.，Drug Res.48 (1998) 870-880 的综述文章中描述。抗体可以以 全细胞、以细胞裂解物或者以部分纯化的或者基本纯化的形式存在。通过标准技术，包括柱层析和其他本领域熟知的技术进行纯化，以去除其他细胞组分或者其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质。参见，Ausubel, F.,等人,编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, NewYorkC 1987)0 例如，Barnes,L.M.,等人，Cytotechnology 32(2000)109-123 ；Barnes,L.M.，等人，Biotech.Bioeng.73 (2001) 261-270 描述了在 NSO 细胞中的表达。例如，Durocher,Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30 (2002) E9 描述了瞬时表达。Orlandi, R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86(1989)3833-3837 ；Carter,P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89(1992)4285-4289 ；Norderhaug, L.，等人，J.Tmmunol.Methods204 (1997) 77-87 描述了可变域的克隆。Schlaeger, E.-J.和 Christensen, K.,在 Cytotechnology 30 (1999) 71-83 中和Schlaeger,E.-J.，在 J.1mmunol.Methods 194 (1996)191-199 中描述了优选的瞬时表达系统(HEK 293)。通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如A蛋白-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或者亲和层析，可以从培养基中合适地分离单克隆抗体。使用常规方法容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA和RNA。可以将杂交瘤细胞用作该DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将DNA插入到表达载体中，然后将所述载体转染到宿主细胞，例如HEK 293细胞、CHO细胞或者另外地不产生免疫球蛋白的杂交瘤细胞中，以在宿主细胞中获得合成的重组单克隆抗体。[0050]通过将合适的核苷酸改变引入到编码DNA的抗体中，或者通过肽合成，制备人IL33R抗体的氨基酸序列变体。然而，例如，如上所述，此类修饰仅可以在非常有限的范围内进行。例如,修饰不改变上述抗体特征,例如IgG同种型和表位结合，但可以改进重组产生的产量、蛋白质稳定性或者协助纯化。通常，还可以用丝氨酸取代不参与维持抗IL33R抗体的正确构象的任一半胱氨酸残基，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可以将半胱氨酸键(cysterine bond)加入到抗体中，以改进其稳定性(特别地,当抗体是抗体片段如Fv片段的情况下)。另一类型的抗体的氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。“改变”指的是去除抗体中发现的一个或多个糖部分和/或添加一个或多个在抗体中不存在的糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的。N-连接指糖部分与天冬酰胺残基的侧链结合。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸)是糖部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，任何这些三肽序列在多肽中的存在都产生了潜在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列，以使其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，可以方便地实现抗体中糖基化位点的添加。
[0051]通过本领域已知的多种方法，制备编码抗IL33R抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于，从天然来源中分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或者通过人源化抗IL33R抗体的较早制备变体或者未变异形式的寡核苷酸介导的(或者定点)诱变、PCR诱变，以及盒式诱变制备。
[0052]抗体共价修饰的另一类型包括将抗体与多种非蛋白质聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯之一以 US Patent N0.4，640，835 ;4，496，689 ;4，301，144 ;4，670，417 ；4，791，192 ;4，179，337中所提出的方式连接。
[0053]将根据本发明的重链和轻链可变域与启动子、翻译起始、恒定区、3'非翻译区、聚腺苷酸和转录终止组合，以形成表达载体构建体。可以将重链和轻链表达构建体组合到单个载体中，共转染、连续转染或者单独转染到宿主细胞中，然后所述宿主细胞融合，以形成表达两种链的单个宿主细胞。
[0054]在另一方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，所述组合物含有与可药用载体一起配制的本发明的单克隆抗体或`者其抗原结合部分之一或者组合。如本文中所用，“可药用载体”包括任一和全部在生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收/再吸收延迟剂等。优选地，载体是适合于注射或灌输的。可以通过本领域已知的多种方法施用本发明的组合物。本领域技术人员应当理解，取决于期望的结果，将改变施用的途径和/或模式。可药用载体包括无菌水溶液或者分散剂，以及用于制备无菌注射液或分散剂的无菌粉末。用于药物活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域已知的。除水外，载体可以例如是等渗缓冲的盐溶液。不考虑所选定的施用途径，可以以合适的水合形式使用本发明的化合物，和/或可以通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的药物组合物配制成可药用剂型。可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得对特定患者有效地实现期望治疗应答的活性成分、组合物的量，以及施用模式，而不会对患者造成毒性(有效量)。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，其包括本发明所使用的特定组合物或其酯或酰胺的活性、施用的途径、施用的时间、所使用的特定化合物的排泄率、用于与所使用的特定组合物组合的其他药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前病史，以及医学领域熟知的其他因素。[0055]本发明包含根据本发明的抗体用于治疗患类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘的患者的用途。
[0056]本发明的其他实施方案是抗IL33R抗体，优选地根据本发明的抗体的用途，所述抗体用于治疗患类风湿性关节炎的患者，所述患者对用TNF拮抗剂、抗⑶20抗体、CTLA4Ig或抗IL6抗体的治疗应答是中等的或者不应答。本发明的其他实施方案是抗IL33R抗体，优选地根据本发明的抗体用于产生用于治疗患类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘的患者的药物的用途。
[0057]本发明还提供了用于产生药物组合物的方法，以及根据本发明的抗体用于该方法的用途，所述药物组合物包含有效量的根据本发明的抗体和可药用载体。本发明进一步提供了根据本发明的抗体的用途，有效量的所述抗体用于产生药剂，优选地与可药用载体一起用于治疗患类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘的患者。本发明还提供了根据本发明的抗体的用途，有效量的所述抗体用于产生药剂，优选地与可药用载体一起用于治疗患类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘的患者。
[0058]序列说明
[0059]SEQ ID NO:1 重链 CDR3，Mab ral70
[0060]SEQ ID N0:2 重链 CDR2，Mab ral70
[0061]SEQ ID NO:3 重链 CDRl，Mab ral70
[0062]SEQ ID NO: 4 轻链 CDR3，Mab ral70
[0063]SEQ ID NO: 5 轻链 CDR2，Mab ral70
[0064]SEQ ID NO:6 轻链 CDRl，Mab ral70
[0065]SEQ ID NO:7 重链可变域，Mab ral70
[0066]SEQ ID NO:8 轻链可变域，Mab ral70
[0067]SEQ ID NO:9具有突变L234A和L235A的人gamma I重链恒定区(白种人同种异型(Caucasian Allotype))
[0068]SEQ ID NO: 10 A Y I 重链恒定区(白种人同种异型(Caucasian Allotype))
[0069]SEQ ID N0:11人Y I 重链恒定区(美国黑人同种异型(Afroamerican Allotype))
[0070]SEQ ID NO: 12人κ轻链恒定区
[0071]SEQ ID NO: 13对于mutl替换的ST2序列片段I
[0072]SEQ ID NO: 14对于mutl替换的ST2序列片段2
[0073]SEQ ID NO: 15对于mutl替换的ST2序列片段3
[0074]SEQ ID NO: 16对于mutl替换的ST2序列片段4
[0075]SEQ ID NO: 17IL-1R 片段 I mutl，替换的 ST2 片段 SEQ13
[0076]SEQ ID NO: 18IL-1R 片段 2 mut2,替换的 ST2 片段 SEQ14
[0077]SEQ ID NO: 19IL-1R 片段 3 mut3,替换的 ST2 片段 SEQ15
[0078]SEQ ID NO: 20IL-1R 片段 4 mut4，替换的 ST2 片段 SEQ16
[0079]SEQ ID NO: 21 重链可变域，人源化 ral70 11.12 (VHll)
[0080]SEQ ID N0:22Mab ral70 11.12 的重链 CDR1，
[0081]SEQ ID N0:23Mab ral70 11.12的重链0?2
[0082]SEQ ID N0:24Mab ral70 11.12的重链0?3[0083]SEQ ID NO: 25 重链可变域，人源化 ral70 10.12 (VHlO)
[0084]SEQ ID N0:26Mab ral70 10.12 的重链 CDRl
[0085]SEQ ID N0:27Mab ral70 10.12 的重链 CDR2
[0086]SEQ ID N0:28Mab ral70 10.12 的重链 CDR3
[0087]SEQ ID NO: 29人IgG4 SPLE主链(具有突变L235E和S228P的人Y 4重链恒定区)
[0088]SEQ ID NO: 30 人源化 ral70 (11.12 和 10.12)的轻链可变域
[0089]SEQ ID NO: 3IMab ral70 10.12 和 11.12 的轻链 CDRl
[0090]SEQ ID N0:32Mab ral70 10.12 和 11.12 的轻链 CDR2
[0091]SEQ ID N0:33Mab ral70 10.12 和 11.12 的轻链 CDR3
[0092]SEQ ID NO:34 人 κ 主链
实施例
[0093]实施例1
[0094]免疫
[0095]将来自Charles River Laboratories International, Inc.的野生型新西兰白(NZff)兔(穴兔(Oryctolagus cuniculus))用于免疫。根据动物护理制度(InstitutionalAnimal Care)和使用委员会指南`(Use committee guideline)以及实验动物评估和认可委员会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)(德国，欧洲)饲养并维持它们。
[0096]将与人IgG的Fe区融合的纯化的、NSO-衍生的、分泌的可溶性形式的人IL-33R以lmg/ml的浓度溶解于NaCl-组氨酸缓冲液pH 6.1中，并与完全弗氏佐剂(CFA) (1:1)混合，直到产生稳定的乳剂。三只兔接受2ml乳剂的皮内(1.d.)注射，之后以I周间隔每次用Iml进行第二次肌内(1.m.)和第三次皮下(s.c.)注射。两周后进行Iml的第四次肌内注射，之后以四周间隔进行Iml的另外两次皮下注射。在第三次、第四次、第五次和第六次注射后第4-6天收集IOml每只动物的外周全血样品，并用于FACS中的单细胞分选。同时收集每只动物另外0.5ml的血清，并用于表征IL33R特异性抗体应答。
[0097]抗体应答
[0098]使用IL33R特异性ELISA，通过连续稀释的血清测定对免疫的抗体应答，其中在370C，用在碳酸盐缓冲液中的0.3 μ g/ml rhIL33R蛋白包被96-孔MaxiSorp微量滴定板。然后，在 4°C，用补充了 l%Crotein C (Roche Diagnostics GmbH, DE)的 PBS 过夜封闭孔。对于检测，以1:16000稀释度使用与辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔IgG (The JacksonLaboratory)。将来自Roche Diagnostics GmbH, DE的起沉淀作用的四甲基联苯胺(TMB)的BM Blue POD底物的即用型溶液用于显色。通过IN HCl终止反应，并在Tecan Infinite中在450/690nm处测量。
[0099]抗体选择的说明
[0100]在4°C，用在碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠、34mM碳酸氢二钠，pH 9.55)中的
2μ g/ml IL33R蛋白过夜包被无菌细胞培养6-孔板。在使用前，在无菌PBS中洗涤平板三次。用I XPBS两倍稀释含兔全血的EDTA，之后在哺乳动物淋巴细胞分离液(CedarlaneLaboratories)中进行密度离心(用于分离兔PBMC)。洗涤PBMC两次，之后用抗体染色。[0101]EL-4 B5 培养基
[0102]用109^5(取(3101^，1^&11，^'，美国)、21111谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素溶液、21111丙酮酸钠、IOmM HEPES和0.05πιΜβ-巯基乙醇补充RPMI 1640。
[0103]巨噬细胞/单核细胞的去除
[0104]通过非特异性粘附，将无菌6-孔板(细胞培养级)用于去除巨噬细胞和单核细胞。每孔用4ml培养基和来自经免疫的兔子的多达6 X IO6的外周血单核细胞填满至最大，并允许在37°C在培养箱中结合I小时。将上清液中50%的细胞用于淘选步骤；在免疫荧光染色之前，将剩余50%的细胞放置在冰上。
[0105]在IL33R蛋白上的B细胞富集
[0106]用每4ml培养基多达6X IO6个细胞接种用IL33R蛋白包被的6_孔组织培养板，并允许在37°C在培养箱中结合I小时。在IL33R蛋白上的富集步骤后，通过用I XPBS仔细洗涤孔1-2次来去除未粘附的细胞。在37°C，在培养箱中用胰蛋白酶分离剩下的粘性细胞10分钟，然后在培养基中洗涤所述细胞2次。在免疫荧光染色之前，将细胞放置在冰上。
[0107]免疫荧光染色和流式细胞术
[0108]用于单细胞分选的抗兔IgG FITC 来自 AbD Serotec (STAR121F，Diisseldorf，德国)。对于表面染色，在4°C，在冷室中，将来自去除和淘选步骤的细胞与在PBS中最佳稀释的抗兔IgG FITC抗体一起避光转动温育30分钟。离心后，通过抽吸去除上清液。将PBMC进行2轮离心，并用冰冷的PBS洗涤。最后，将PBMC重悬在冰冷的PBS中，并立即进行FACS分析。加入5 μ g/ml浓度的碘化丙唳(BD Pharmingen, San Diego, CA,美国)，以区分死细胞和活细胞，之后进行FACS分析。将装备了计算机和FACSDiva?软件的Becton DickinsonFACSAria? (BD Biosciences,美国)用于收集和分析数据。
[0109]B细胞培养
[0110]通过与Zubler,等人，Eur.J.1mmunol.14 (1984) 357-363, Zubler,等人,J.Exp.Med.160 (1984) 1170-1183所述的方法相似的方法制备B细胞培养物。简言之，在37°C，在 5%C02 大气的培养箱中用 210 μ I/孔具有 Pansorbin ? Cells (1:20000) (Calbiochem(Merck), Darmstadt, Deutschland)、5% 兔胸腺细胞上清液(charge 20080910, productionIrmgard ThoreyMP Y _照射的EL-4-B5小鼠胸腺细胞(2X IO4/孔)的培养基在96孔板中培养单个筛选的B细胞7天。去除B细胞培养上清液以用于筛选，并立即收集细胞用于可变区基因回收或者在100μ I RLT缓冲液(Qiagen，Hilden，德国)中冷冻于_80°C。
[0111]核糖核酸(RNA)的分离
[0112]通过离心，首先沉淀需要分离RNA的细胞。通过加入具有10 μ Ι/ml β-巯基乙醇的100 μ I RLT缓冲液裂解细胞沉淀。通过用吸管多次混合重悬细胞，并将其转移到多孔板中。在200 Xg短暂离心平板,并冷冻于_20°C。根据厂商说明，使用NucleoSpin⑩96RNA试剂盒(Macherey&Nagel)进行RNA的分离。
[0113]逆转录聚合酶链反应
[0114]根据厂商说明，使用superscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)实施逆转录。
[0115]聚合酶链反应
[0116]根据厂商说明，使用AccuPrime Pfx SuperMix (Invitrogen)实施聚合酶链反应。在单独的反应中扩增轻链和重链可变区。使用具有25bp重叠的PCR引物，以靶向抗体表达载体。通过 NucleoSpin @ 96Extract II 试剂盒(Macherey&Nagel)纯化 PCR 产物。
[0117]测序和SLIC克隆
[0118]测序PCR产物，以测定重链和轻链可变区的DNA序列。通过所称作的SLIC克隆方法(由 Haun, R.S.，等人，在 BioTechniques 13 (1992)第 515-518 页中和 Li, Μ.Z.，等人，在Nature Methods 4 (2007)第251-256页中所述)，将PCR产物克隆到表达载体中。通过限制性酶消化，线性化用于抗体表达的质粒。通过预备的琼脂糖电泳纯化线性化的质粒，并从凝胶中提取(Qiaquick Gel Extraction Kit/Qiagen)所述质粒。将纯化的质粒加入到使用重叠引物(跨度25bp)的的PCR-方案中以用于克隆PCR产物。在dNTP不存在的情况下，用T4DNA聚合酶(Roche Applied Sciences)处理载体和插入物，以产生突出端,然后将载体和插入物与RecA (New England Biolabs)蛋白和ATP—起温育，以促进重组。将产物转化到大肠杆菌中。分离轻链和重链的质粒DNA，并将每一对组合用于瞬时转染。
[0119]用于在HEK293细胞中表达抗体的瞬时转染
[0120]HEK293细胞在F17培养基(Gibco)中生长至lX10e6个细胞/ml。用悬浮在293-free (Novagen)和 OptiMEM ? (Gibco)中的 Iyg HC+LC 质粒转染 2 X 10e6 个 HEK293细胞。培养7天后，收集并分析上清液。
[0121]基于抑制人UT-7细胞中IL33诱导的NFkB活化，根据本发明的抗体显示出高质量。优选地，根据本发明的抗体显示出0.05nM或更低，并且更优选地0.03nM或更低的IC50值。此外，根据本发明的抗体在嗜酸性粒细胞测定法、肥大细胞测定法、嗜碱性粒细胞测定法(KU812)和TH2测定法的测定组合中显示出有价值的性质。发现，显示出以0.05nM或更低，并且更优选地0.03nM或更低IC50值抑制人UT-7细胞中IL33诱导的NFkB活化的抗体在治疗类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎和哮喘中具有特别有用的性质。进一步优选的是在嗜酸性粒细胞测定法、肥大细胞测定法、Th2测定法、嗜碱性粒细胞测定法(IL-5)中显示出5nM或更低IC5tl值的抗体。`
[0122]实施例2
[0123]IL33 与 ST2 结合的抑制(ELISA)
[0124]在室温在384 孔 MaxiSorp? 微量滴定板(Sigma-Aldrich，Nunc.DE，货号 464718)上进行测试。每一温育步骤后，用PBST(磷酸缓冲盐水Tween?-20)洗涤3次平板。开始，用I μ g/ml山羊抗人IgG Fe片段(Jackson Imm.Res.,美国，货号109-006-170)包被平板至少 2 小时。然后，用补充了 0.l%Tween ?-20 和 2%BSA (Roche Diagnostics GmbH, DE)的PBS封闭孔I小时。捕获60ng/ml的重组人ST2/IL_lR4Fc嵌合体(R&D Systems，英国，货号523-ST)或重组cyno ST2 Fe嵌合体I小时。将具有0.5%BSA和0.05%Tween ? -20的
PBS中的纯化抗体或者来自杂交瘤/B细胞的上清液的稀释液与受体蛋白温育I小时。加入生物素化的人IL33 (P印roTech，美国，货号500-P261)持续额外的I小时，以形成复合体。根据厂商方法用Sulfo-NHS-LC-生物素(Thermo Scientific Pierce，美国，货号21327)生物素化 IL33,并用 Zeba? 脱盐旋转柱(Zeba? Desalt Spin Column) (Thermo ScientificPierce，美国，货号 89889)纯化 IL33。用 1:4000稀释的链霉亲和素!11^(1?0(31^ DiagnosticsGmbH，DE，货号11089153001)检测生物素化的IL33与复合体的结合。I小时后，用PBST洗涤平板6次，并用新鲜制备的BM blue POD底物溶液(BM blue:3，3'，5，5,-四甲基联苯胺，Roche Diagnostics GmbH, DE，货号 11484281001)室温显色 12 分钟。测量 370nm 处的吸收。将阴性对照限定为没有添加ST2/IL-1R4蛋白，并且将阳性对照限定为具有全部组分，但没有抗体。
[0125]抗体ral70显示出0.32nM (对于抑制与人ST2的结合)和0.13nM (对于抑制与食蟹猴ST2的结合)的IC50值。
[0126]实施例3
[0127]抗hST2抗体与人ST2 EO) (His-Avitag单体)的亲和力的测定
[0128]仪器:BIACORETlOO
[0129]芯片:CM4(GE Healthcare BR-1005-34)
[0130]偶联:胺偶联
[0131]缓冲液:包括0.05%Tween20 的 IOmM 磷酸缓冲盐水(PBST)，pH7.4，37°C
[0132]对于亲和力测量,将10 μ g/ml山羊抗人Fcg抗体(Jackson Imm.Res.,美国，货号115-005-098)偶联至芯片表面上，用于捕获与ST2结合的抗体。将多种浓度的具有6HisAvitag? (Avidity, LLC，美国)的单体人ST2 ECD加入到溶液中。通过在37°C持续120秒的接触时间注射ST2ECD (单循环-动力学)测量结合，通过在37°C用缓冲液洗涤芯片表面1800秒测量解离。对于表观 Kd和其他动力学参数的计算，使用Langmuir 1:1模型。结果(两次测量的平均值)显示于表1中。
[0133]表1:在 37°C，pH 7.4 在 IOmM PBST 中通过 SPR (BIACORE T100)测量的亲和力数据的平均值
【权利要求】
1.与人IL33R结合的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQID NO:1的⑶R3区、SEQID NO: 2的CDR2区和SEQ ID NO: 3的CDRl区，并且轻链可变域包含SEQ ID NO:4的CDR3区、SEQ ID NO: 5 的 CDR2 区和 SEQ ID NO:6 的 CDRl 区。
2.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述重链可变域包含SEQID N0:7。
3.根据权利要求2的抗体，其特征在于所述重链可变域包含SEQID N0:7，并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO:8。
4.根据权利要求3的抗体，其特征在于所述抗体是嵌合的、人源化的或者T细胞表位缺失的抗体变体。
5.与人IL33R结合的抗体，其特征在于所述抗体是人源化变体，其中重链可变域包含SEQ ID NO:24 的 CDR3 区、SEQ ID NO:23 的 CDR2 区和 SEQ ID NO:22 的 CDRl 区，并且轻链可变域包含 SEQ ID N0:33 的 CDR3 区，SEQ ID NO:32 的 CDR2 区和 SEQ ID N0:31 的 CDRl区。
6.与人IL33R结合的抗体，其特征在于所述抗体是人源化变体，其中重链可变域包含SEQ ID NO:28 的 CDR3 区、SEQ ID NO:27 的 CDR2 区和 SEQ ID NO:26 的 CDRl 区，并且轻链可变域包含 SEQ ID NO:33 的 CDR3 区，SEQ ID NO:32 的 CDR2 区和 SEQ ID NO:31 的 CDRl区。
7.根据权利要求5的抗体，其特征在于所述重链可变域包含SEQID N0:21。
8.根据权利要求7的抗体，其特征在于所述重链可变域包含SEQID N0:21，并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO:30。
9.根据权利要求6的抗体，其特征在于所述重链可变域包含SEQID NO:25。
10.根据权利要求9的抗体，其特征在于所述重链可变域包含SEQID NO:25，并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO:30。
11.根据权利要求1-10的抗体，其特征在于所述抗体是在氨基酸位置216-240处的铰链区和/或在Ch2和Ch3之间的氨基酸位置327-331处的第二域间区中经修饰的人IgGl或IgG4同种型。
12.与人IL33R结合的抗体，其特征在于所述抗体结合的IL33R表位与根据权利要求3的抗体结合的IL33R表位相同，所述抗体是在氨基酸位置216-240处的铰链区和/或在CH2和Ch3之间的氨基酸位置327-331处的第二域间区中经修饰的人IgGl或IgG4同种型。
13.根据权利要求11或12的抗体，其特征在于所述抗体包含氨基酸位置234处丙氨酸替代亮氨酸的突变和氨基酸位置235处丙氨酸替代亮氨酸的突变。
14.根据权利要求11或12的抗体，其特征在于所述抗体包含氨基酸位置235处谷氨酸替代亮氨酸的突变和氨基酸位置228处脯氨酸替代丝氨酸的突变。
15.药物组合物，其特征在于所述药物组合物包含根据权利要求1-14的抗体。
16.药物组合物,其特征在于所述药物组合物包含抗体,所述抗体结合的IL33R表位与根据权利要求3的抗体结合的IL33R表位相同。
17.根据权利要求1至14的抗体的用途，用于生产药物组合物。
18.特征在于结合的IL33R表位与根据权利要求3的抗体结合的IL33R表位相同的抗体的用途，用于生产药物组合物。
19.根据权利要求1-14的抗体的用途，用于治疗类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘。
20.特征在于结合的IL33R表位与根据权利要求3的抗体结合的IL33R表位相同的抗体的用途，用于治疗类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或哮喘。
21.编码与IL33R结合的抗体的重链的核酸，其特征在于所述抗体包含SEQID NO:1的重链 CDR3 区、SEQ ID NO: 2 的重链 CDR2 区和 SEQ ID NO: 3 的重链 CDRl 区、SEQ ID NO:4 的轻链⑶R3区、SEQ ID NO: 5的轻链⑶R2区和SEQ ID NO:6的轻链⑶Rl区。
22.编码与IL33R结合的抗体的重链的核酸，其特征在于所述抗体包含SEQID NO:24的CDR3区、SEQ ID NO: 23的CDR2区和SEQ ID NO: 22的CDRl区，并且轻链可变域包含SEQID NO: 33 的 CDR3 区、SEQ ID NO: 32 的 CDR2 区和 SEQ ID NO: 31 的 CDRl 区。
23.编码与IL33R结合的抗体的重链的核酸，其特征在于所述抗体包含SEQID NO:28的CDR3区、SEQ ID NO: 27的CDR2区和SEQ ID NO: 26的CDRl区，并且轻链可变域包含SEQID NO:33 的 CDR3 区、SEQ ID NO:32 的 CDR2 区和 SEQ ID NO:31 的 CDRl 区。
24.表达载体,其特征在于包含根据权利要求21、22或23的核酸,所述表达载体用于在原核或真核宿主细胞中表达与IL33R结合的抗体。
25.用于产生与IL33R结合的重组抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据权利要求21、22或23的核酸，并从所述细胞或细胞培养上清液中回收所述抗体。
【文档编号】A61P37/06GK103562224SQ201280009940
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年2月22日 优先权日:2011年2月23日
【发明者】G·弗尔蒂格, G·乔治斯, K·卡鲁扎, V·利夫克, J·莫莱肯, S·奥夫纳, A·帕施奈, S·西伯尔, J·菲舍尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司