包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂及其制备方法，为包裹液态氟碳的mPEG-PLLA、PLGA-PEG–PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物的超声微泡造影剂，其由下述方法制得：制取mPEG-PLLA、PLGA-PEG–PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物溶液，在加入液态氟碳全氟戊烷、全氟己烷或全氟丙烷后采用电动内切匀浆、超声乳化或机械振荡方法制得超声微泡造影剂。本发明所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂在制备超声影像诊断造影剂中的应用。本发明所用的高分子材料安全无毒，价格明显低于合成磷脂，微泡制备工艺简便，是一种新型的超声微泡造影剂，具有较好的潜在的临床应用前景。
【专利说明】包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种嵌段聚合物包裹可发生液气相变的氟碳化合物的超声微泡造影齐U，属于超声影像诊断领域。
【背景技术】
[0002]超声微泡造影剂已经广泛应用于临床疾病的诊断，明显提高了超声诊断符合率，是超声医学发展史上的一个“里程碑”。目前临床使用的超声造影剂多为脂质或白蛋白包裹惰性气体，稳定性较差，容易自发破裂。
[0003]高分子材料具有生物相容性好，可生物降解等优点，采用高分子材料制备超声微泡造影剂粒径分布较均匀，稳定性高，抗压性能好，已经成为目前超声造影剂研究的热点。但部分高分子材料，如聚乳酸羟基乙酸制备的造影剂外壳较硬，低机械指数的二次谐波成像超声造影难以显影，需要较高的声学输出才能引起微泡的非线性振动或破裂，产生增强的对比成像，但同时背景组织回声信号亦明显增强，导致信噪比明显降低，造影效果差。本发明研究表明，对高分子材料进行聚乙二醇接枝处理形成的嵌段聚合物如单甲氧基聚乙二醇-左旋聚乳酸mPEG-PLLA明显提高材料的柔顺性，在水溶液中可形成亲水段PEG朝外，疏水段PLLA朝内的胶束结构。
[0004]长氟碳链的全氟碳化合物在低温时呈液态，即液态氟碳，当外界压力降低或温度升高到其沸点时，液态氟碳发生气化，转变成气体。全氟戊烷在常压下沸点为29°C，注射到人体内呈气态，是一种较适合制备液气相变型超声造影剂的氟碳材料。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是 提供一种包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂及其制备方法。
[0006]本发明在制备包裹液态氟碳的mPEG-PLLA嵌段聚合物超声微泡造影剂中发现:改变mPEG与PLLA分子量比例，或将外壳材料改为聚乙二醇-聚己内酯mPEG-PCL、聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸mPEG-PLGA，或降低转速(14500rpm)内切匀浆进行乳化，或将乳化方法改为超声乳化，或将液态氟碳改为六氟化硫制备的微泡密度降低，导致造影增强强度均明显降低。mPEG-PLLA水溶液的浓度、mPEG-PLLA与全氟戊烷的比例等都会明显影响微泡的产量及粒径分布。
[0007]本发明首先采用透析法制备了 mPEG-PLLA胶束水溶液，在低温条件下将液态全氟戊烷与mPEG-PLLA水溶液混合，采用高速内切匀浆方法进行乳化，成功制备了以嵌段聚合物为外壳，包裹全氟戊烷的微泡造影剂。推测可能系液态全氟戊烷与mPEG-PLLA水溶液混合后，高速匀浆下形成“水包油”的乳剂，同时高速匀浆产生的热量使全氟戊烷发生气化，进而形成粒径适宜的微泡造影剂，粒径分布较均匀，稳定性明显优于脂质微泡造影剂，更适合进行超声靶向诊断与治疗研究。
[0008]本发明采用单乳化法制备的超声微泡造影剂体内外在MI为0.09低机械指数的二次谐波成像造影模式下具有明显增强效果，克服了部分高分子材料制备的微泡造影剂外壳硬，难以显影的缺点。
[0009]本发明的目的是这样实现的，所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影齐U，为包裹液态氟碳的mPEG-PLLA、PLGA-PEG - PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物的超声微泡造影剂，其由下述方法制得:制取mPEG-PLLA、PLGA-PEG - PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物溶液，在加入液态氟碳全氟戊烷、全氟己烷或全氟丙烷后采用电动内切匀浆、超声乳化或机械振荡方法制得超声微泡造影剂。
[0010]所述包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂，其嵌段聚合物中:mPEG分子量为1000-10000、PLLA分子量为2500-25000、PCL分子量为2500-25000，嵌段聚合物溶液浓度为0.1-10 wt% ;嵌段聚合物与全氟戊烷的比例lOmg/1-ΙΟΟμ I。
[0011]所述优选采用的电动内切匀浆法制备的包裹全氟戊烷的mPEG-PLLA嵌段聚合物超声微泡造影剂，其匀浆转速为14500-35000rpm，匀浆时间0.5_4min。
[0012]所述优选的包裹全氟戊烷的mPEG-PLLA嵌段聚合物超声微泡造影剂由下述方法制得:称·取分子量为5000/5000的mPEG-PLLA溶于四氢呋喃，装入透析袋，用生理盐水透析过夜，其间换透析液后形成mPEG-PLLA生理盐水溶液；取mPEG-PLLA生理盐水溶液，冰浴预冷，加入液态全氟戊烷，冰浴条件下电动内切匀浆得包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂。
[0013]所述优选的包裹全氟戊烷的mPEG-PLLA嵌段聚合物超声微泡造影剂更进一步来说由下述方法制得:称取0.2g分子量为5000/5000的mPEG-PLLA溶于2ml四氢呋喃，装入透析袋，用生理盐水透析过夜，其间换透析液2次形成mPEG-PLLA生理盐水溶液；取Iml lwt%mPEG-PLLA生理盐水溶液，冰浴预冷，加入40 μ I液态全氟戊烷，冰浴条件下，35000rpm电动内切匀浆2min，得包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂；所述微泡造影剂呈乳白色混悬液，用生理盐水将所述微泡造影剂稀释后，倒置显微镜下观察，微泡呈圆形，分散良好，表面光滑透亮，平均粒径为3.7±0.9 μ m，采用细胞计数板测量微泡密度为2.3X108/ml，4°C放置24h微泡数量降低的幅度显著低于脂质超声微泡造影剂。
[0014]本发明所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂的制备方法，包括如下步骤:制取mPEG-PLLA、PLGA-PEG - PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物溶液，在加入液态氟碳全氟戊烷、全氟己烷或全氟丙烷后采用电动内切匀浆、超声乳化或机械振荡方法制得超声微泡造影剂。
[0015]在所述的mPEG-PLLA、PLGA-PEG - PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物中mPEG分子量为1000-10000,PLLA分子量为2500-25000、PCL分子量为2500-25000，嵌段聚合物溶液浓度为
0.1-10 wt% ;嵌段聚合物与全氟戊烷的比例lOmg/1-ΙΟΟμ I。
[0016]本发明优选采用的电动内切匀浆法制备的包裹全氟戊烷的mPEG-PLLA嵌段聚合物超声微泡造影剂，其匀浆转速为14500-35000rpm，匀浆时间0.5_4min ;优选方法为:称取分子量为5000/5000的mPEG-PLLA溶于四氢呋喃中，装入透析袋，用生理盐水透析过夜形成mPEG-PLLA生理盐水溶液；取上述的mPEG-PLLA生理盐水溶液，冰浴预冷，加入液态全氟戊烷，冰浴条件下，电动内切匀浆后得包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂。
[0017]本发明所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂在制备超声影像诊断造影剂中的应用。[0018]所述的应用中在静脉注入超声造影剂后，超声造影剂的微泡数量为4X 107/kg，进行超声造影观察回声变化，TCA软件分析，绘制时间-强度变化曲线，最后能获得在3秒后肝动脉系统开始增强，紧接着肝实质明显增强，18秒时回声强度达峰值6.92X IO-5AU,持续65秒后消退的结果或者在注入超声造影剂后，进行超声造影观察回声变化，TCA软件分析，绘制时间-强度变化曲线，最后能获得在几秒后肾脏实质回声开始增强，到峰值，持续一段时间后消退的结果。
[0019]本发明的包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂具有如下优点:首先，采用PEG接枝的高分子材料作为微泡外壳，柔顺性好，包裹的液态氟碳气化膨胀后将外壳撑薄，使二次谐波成像造影模式下的低机械指数超声能穿过微泡外壳，微泡内部的气体产生明显背向散射，达到良好的超声造影效果；其次，以嵌段聚合物为外壳，可通过对聚合物进行修饰，使其携带蛋白质等药物，是一种新型的载药微泡造影剂；再次，采用PEG接枝的聚合物为外壳，弹性好，提高机械指数进行超声爆破可使造影剂破裂，可达到微泡靶向破裂释放药物的效果；最后，本发明所用的mPEG-PLLA、PLGA-PEG - PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物等高分子材料安全无毒，价格明显低于合成磷脂，微泡制备工艺简便，是一种新型的超声微泡造影剂，具有潜在的临床应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明超声微泡造影剂光学显微镜观察图(X400)。
[0021]图2为聚合物微泡造影剂与脂质微泡造影剂稳定性比较图。
[0022]图3为取0.1ml本发明的微泡造影剂，加入20ml生理盐水稀释，装入水囊，采用Toshiba Aplio500彩色多普勒超声诊断仪进行超 声造影,在二次谐波成像超声造影模式下(MI=0.09)观察，见水囊内回声明显增强，呈密集细点状回声图。
[0023]图4为提高机械指数(MI=L 5)进行超声爆破，水囊内微泡瞬间破裂，回声降低呈无回声图。
[0024]图5为本发明的超声微泡造影剂大鼠肝脏造影及时间-强度曲线图。
[0025]图6为本发明的超声微泡造影剂新西兰大白兔肾脏造影及时间-强度曲线图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
[0027]实施例1
1、造影剂的制备
称取0.2g mPEG-PLLA (分子量为5000/5000，为济南岱罡生物工程有限公司产品)溶于2ml四氢呋喃，装入透析袋，对生理盐水透析过夜，其间换透析液2次；取Iml I wt %mPEG-PLLA生理盐水溶液，冰浴预冷，加入40 μ I全氟戊烷，冰浴条件下，35000rpm电动内切匀浆2min，得包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂，呈乳白色混悬液体。上述的mPEG是单甲氧基聚乙二醇，PLLA是左旋聚乳酸。
[0028]2、造影剂的表征
用生理盐水将微泡造影剂稀释后，倒置显微镜下观察，微泡呈圆形，分散良好，表面光滑透亮，大小较均匀(见图1)，平均粒径(3.7±0.9) μ m，采用细胞计数板测量微泡密度为2.3 XlOVml ο
[0029]3、稳定性实验
将聚合物微泡造影剂与脂质微泡造影剂放置4°C冰箱，于0、l、2、3、12、24h取样显微镜下观察，结果脂质微泡造影剂数量降低幅度明显高于聚合物微泡造影剂，表明聚合物微泡造影剂稳定性明显高于脂质微泡造影剂(图2)。
[0030]4、体外造影及爆破实验
取0.1ml步骤I制得的微泡造影剂，加入20ml生理盐水稀释，装入水囊，采用Toshiba Aplio500彩色多普勒超声诊断仪进行超声造影,在二次谐波成像超声造影模式下(MI=0.09)观察，见水囊内回声明显增强，呈密集细点状回声(见图3);启动爆破模式(MI=L 5)将微泡击破，水囊内回声瞬间降低，呈无回声(图4)。取20ml生理盐水装入水囊，进行对照，超声造影观察呈无回声。
[0031]5、大鼠肝脏造影
取雌性SD大鼠，体质量180?220g，上腹部脱毛后，乙醚吸入麻醉，采用尾静脉团注法，注入上述制备的超声微泡造影剂4X 107/kg，超声造影观察大鼠肝脏回声变化，TCA软件分析，绘制时间-强度变化曲线。结果，3秒后大鼠肝动脉系统开始增强，紧接着肝实质明显增强，18秒时回声强度达峰值，Power为6.92 X 10_5AU，持续约65秒后消退(图5)。
[0032]6、新西兰大白兔肾脏造影· 雄性新西兰大白兔，体质量2.0?2.2 kg，固定于实验台，耳缘静脉置入留置针，右侧腰背部脱毛后，采用静脉团注方法，注入超声微泡造影剂3 X 107/kg，超声造影观察肾脏回声变化，TCA软件分析，绘制时间-强度变化曲线。结果，4秒后肾脏实质回声开始增强，峰值为4.6X 10_4AU，持续约75秒后消退(图6)。
[0033]实施例2
采用与实施例1不同的超声乳化法制备mPEG-PLLA造影剂
称取0.2g mPEG-PLLA (分子量为5000/5000，为济南岱罡生物工程有限公司产品)溶于2ml四氢呋喃，装入透析袋，对生理盐水透析过夜，其间换透析液2次；取Iml I wt %mPEG-PLLA生理盐水溶液，冰浴预冷，加入40 μ I液态全氟戊烷，冰浴条件下，200W超声乳化Imin,结果形成大量大粒径微泡与包裹生理盐水的微囊混合液,微泡粒径约6?50 μ m,微囊粒径约3?7 μ m。
[0034]实施例3
嵌段聚合物mPEG-PCL造影剂的制备
称取0.2g mPEG-PCL (分子量为5000/5000，为济南岱罡生物工程有限公司产品，PCL为聚己内酯)溶于2ml四氢呋喃，装入透析袋，对生理盐水透析过夜，其间换透析液2次；取Iml I wt% mPEG-PCL生理盐水溶液，冰浴预冷，加入40 μ I液态全氟戊烷，冰浴条件下，200W超声乳化Imin，得聚合物微泡造影剂，微泡平均粒径偏大(4.5± 1.2) μ m，密度较低为1.2 XlOVml ο
[0035]实施例4
聚合物PLGA-PEG-PLGA造影剂的制备
称取0.1g PLGA-PEG-PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)分子量5000dal，PEG分子量3000dal)溶于IOml生理盐水，取0.5ml聚合物水溶液，加入20 μ I液态全氟戊烷，机械振荡4000次/分40秒，结果形成大量大粒径微泡与包裹生理盐水的微囊混合液，微泡粒径约5?50 μ m,微囊粒径约2?8 μ m。
[0036]总结
本发明通过上述的四个实施例可以看出，I)同样的嵌段mPEG-PLLA聚合物在不同制备方法下其形成的微泡造影剂粒径、均匀度、稳定性均不同，实施例1采用的“冰浴条件下，35000rpm电动内切匀浆”，微泡呈圆形，分散良好，表面光滑透亮，大小较均匀(见图1 )，平均粒径(3.7±0.9) μ m，效果较好；2)本发明的嵌段聚合物mPEG-PCL、聚合物PLGA-PEG-PLGA在上述的制备方法下也能制得相应的超声微泡造影剂，但从结果来看，本发明实施例1的嵌段mPEG-PLLA聚合物在“其生理盐水溶液，在冰浴预冷，加入全氟戊烷，冰浴条件下，电动内切匀浆，得到的包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂”，其微泡呈圆形，分散良好，表面光滑透亮，大小较均匀(见图1)，平均粒径(3.7±0.9) μ m，效果最好；3)本发明采用液态的全氟化合物，试验显示效果最好。
[0037]具体地说，I)本发明采用的嵌段聚合物可以是两嵌段或三嵌段聚合物，mPEG/PLLA、PLGA/PEG、mPEG/PCL 等，其中以 mPEG-PLLA 效果做好。mPEG-PLLA 分子量比例范围可以是mPEGlOOO-lOOOO、PLLA2500-25000,其均能形成超声微泡造影剂，但是以mPGE5000-PLLA5000的分子量配比效果最好。
[0038]2)本发明的制备方法可以采用电动内切匀浆、超声乳化、机械振荡等方法，其中以电动内切匀浆效果最好，微泡粒径大小适宜，分布较均匀，匀浆转速14500-35000rpm，其中以35000rpm效果最好,勻衆时间0.5_4min,其中2min效果最好。
[0039]3)本发明上述的m PEG-PLLA的浓度0.1-10 wt%，其中以lwt%效果最好(wt%指重量百分比浓度)。
[0040]4)本发明采用含氟化合物作为微泡内的气体，可以选用全氟戊烷、全氟丙烷、全氟己烷、六氟化硫等，但以全氟戊烷效果最好，因为其在低温时呈液态，即液态氟碳，当外界压力降低或温度升高到其沸点时，液态氟碳发生气化，且较均匀地转变成气体。
[0041]5)本发明的mPEG-PLLA与全氟戊烷的比例lOmg/l-lOO μ 1，其中以40 μ I效果最好。
【权利要求】
1.一种包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂，为包裹液态氟碳的mPEG-PLLA、PLGA-PEG - PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物的超声微泡造影剂，其由下述方法制得:制取mPEG-PLLA、PLGA-PEG - PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物溶液，在加入液态氟碳全氟戊烷、全氟己烷或全氟丙烷后采用电动内切匀浆、超声乳化或机械振荡方法制得超声微泡造影剂。
2.根据权利要求1所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂，其特征在于所述包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂，其嵌段聚合物中:mPEG分子量为1000-10000,PLLA分子量为2500-25000、PCL分子量为2500-25000，嵌段聚合物溶液浓度为0.1-10 wt% ;嵌段聚合物与全氟戊烷的比例lOmg/1-ΙΟΟμ I。
3.根据权利要求1或2所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂，其特征在于所述采用电动内切匀浆法制备的包裹全氟戊烷的mPEG-PLLA嵌段聚合物超声微泡造影齐U，其匀浆转速为14500-35000rpm，匀浆时间0.5_4min。
4.根据权利要求3所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂，其特征在于所述包裹全氟戊烷的mPEG-PLLA嵌段聚合物超声微泡造影剂由下述方法制得:称取分子量为5000/5000的mPEG-PLLA溶于四氢呋喃，装入透析袋，用生理盐水透析过夜，其间换透析液后形成mPEG-PLLA生理盐水溶液；取mPEG-PLLA生理盐水溶液，冰浴预冷，加入液态全氟戊烷，冰浴条件下电动内切匀浆得包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂。
5.根据权利要求4所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂，其特征在于所述包裹全氟戊烷的mPEG-PLLA嵌段聚合物超声微泡造影剂由下述方法制得:称取0.2g分子量为5000/5000的mPEG-PLLA溶于2ml四氢呋喃，装入透析袋，用生理盐水透析过夜，其间换透析液2次形成mPEG-PLLA生理盐水溶液；取Iml lwt% mPEG-PLLA生理盐水溶液，冰浴预冷，加入40 μ I液态全氟戊烷，冰浴条件下，35000rpm电动内切匀浆2min，得包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂；所述微泡造影剂呈乳白色混悬液，用生理盐水将所述微泡造影剂稀释后，倒置显微镜下观察，微泡呈圆形，分散良好，表面光滑透亮，平均粒径为3.7±0.9 μ m，采用细胞计数 板测量微泡密度为2.3X 108/ml，4°C放置24h微泡数量降低的幅度显著低于脂质超声微泡造影剂。
6.一种包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂的制备方法，包括如下步骤:制取mPEG-PLLA、PLGA-PEG - PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物溶液，在加入液态氟碳全氟戊烷、全氟己烷或全氟丙烷后采用电动内切匀浆、超声乳化或机械振荡方法制得超声微泡造影剂。
7.根据权利要求6所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂的制备方法，其特征在于mPEG-PLLA、PLGA-PEG - PLGA或mPEG-PCL嵌段聚合物中mPEG分子量为1000-10000,PLLA分子量为2500-25000、PCL分子量为2500-25000，嵌段聚合物溶液浓度为0.1-10 wt% ;嵌段聚合物与全氟戊烷的比例lOmg/1-ΙΟΟμ I。
8.根据权利要求6或7所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂的制备方法，其特征在于采用电动内切匀浆法制备的包裹全氟戊烷的mPEG-PLLA嵌段聚合物超声微泡造影剂，其匀浆转速为14500-35000rpm，匀浆时间0.5_4min ;优选方法为:称取分子量为5000/5000的mPEG-PLLA溶于四氢呋喃中，装入透析袋，用生理盐水透析过夜形成mPEG-PLLA生理盐水溶液；取上述的mPEG-PLLA生理盐水溶液，冰浴预冷，加入液态全氟戊烷，冰浴条件下，电动内切匀浆后得包裹全氟戊烷的嵌段聚合物超声微泡造影剂。
9.权利要求1-5任一所述的包裹液态氟碳的嵌段聚合物超声微泡造影剂在制备超声影像诊断造影剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于静脉注入超声造影剂，超声造影剂的微泡数量为4X107/kg，进行超声造影观察回声变化，TCA软件分析，绘制时间-强度变化曲线，最后能获得在3秒后肝动脉系统开始增强，紧接着肝实质明显增强，18秒时回声强度达峰值6.92X 10_5AU，持续65秒后消退的结果或者注入超声造影剂，进行超声造影观察回声变化，TCA软件分析，绘制时间-强度变化曲线，最后能获得在几秒后肾脏实质回声开始增强，到峰值，持续一段时 间后消退的结果。
【文档编号】A61K49/22GK103432601SQ201310375354
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月26日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】陈志奎, 林礼务, 薛恩生, 何以敉, 陈琬萍, 黄丹凤 申请人:福建医科大学附属协和医院