专利名称：用于治疗疾病的腺病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及基因治疗领域，更具体地说涉及具有预防或治疗用途的腺病毒载体。
背景技术：
腺病毒是实施基因治疗的一种备选载体。参见，Jolly,D.，癌症的基因治疗(Cancer Gene Therapy)，vol.1，no.1-1994pp51-64。腺病毒了解透彻的分子遗传学知识使其成为该领域中的优选载体。腺病毒是无被膜二十面体双链DNA病毒，线性基因组大小约为36kbp。该病毒基因组的每一端都带有一段称为末端反向重复序列(或ITR)的短序列，这段序列为病毒复制所必需。部分该病毒基因组易于用外源DNA取代，而且重组腺病毒具有稳定的结构。
腺病毒复制循环分为两个阶段即早期阶段和晚期阶段，在早期阶段中，E1、E2、E3和E4这4个转录单元被表达，晚期阶段发生在病毒DNA合成开始之后，期间晚期转录本在主要晚期启动子(MLP)调控下得以表达。晚期信息编码大部分的病毒结构蛋白质。E1、E2和E4的基因产物负责转录活化、细胞转化、病毒DNA复制以及其它病毒功能并且是病毒生长所必需的。
迄今为止，多数腺病毒载体是在对病毒进行下述操作的基础上制备而成的突变发生于E1、E3或E4上游的位点以提供用于插入外源DNA的位点。可能这类载体中的绝大部分都是以缺失基因组E1区域的腺病毒突变株为基础的。通过缺失该区域，使得该病毒复制机能不全，此外得到一个可插入外源基因的区域。
有关将腺病毒用于基因治疗已有大量报道。例如，Smith，等人，自然遗传学(Nature Genetics),Vol.5，pgs.397-402(1993)一文中公开了向小鼠施用包括人因子Ⅸ基因的腺病毒载体。这种施用导致有效的肝转导，人因子Ⅸ的血浆水平可以有效地治疗乙型血友病患者。但是，注射9周后，人因子Ⅸ水平会慢慢地衰减到基线水平，而且这种水平还不能通过第二次载体注射来重建。Smith等人还发现抗腺病毒中和抗体能阻碍腺病毒成功的重复施用。
Kozarsky，等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，Vol.269，No.18，pgs.13695-13702(1994年5月6日)一文中公开了将一种包括编码LDL受体的DNA的腺病毒载体输注到兔中。发现LDL受体基因能够在兔子体内稳定表达7～10天，在3周内减低到不能检测的水平。抗腺病毒中和抗体的生成导致第二剂量的完全失效。
Kass-Eisler.等人，基因治疗，Vol.1，pgs.395-402(1994)一文指出，腺病毒载体在成人体内表达的持续时间受到限制与T-细胞应答有关，但并非完全取决于T-细胞应答。该作者进一步指明环孢菌素A不能有效阻断针对该载体的体液应答。
Fang，等人，细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)，增刊21A.C6-109,pg 363(1995)一文公开了向已用免疫抑制剂环孢菌素A处理过的狗中重复注射腺病毒载体的尝试。这种重复注射的尝试未获成功。
Yang，等人，美国国家科学院院报(proc.Natl.Acad.Sci.)，Vol.91，pgs.4407-4411(1994年5月)一文中描述了一种其中E1a和F1b区域已缺失的重组腺病毒。这类病毒还包括一种转基因。当将这类腺病毒施用给一种动物宿主时，含有上述重组病毒基因组的细胞可表达目的转基因，但是同时也发生病毒基因的低水平表达。
如上例示，腺病毒在体内可以有效地将基因转移到细胞中，因此可以用作送递载体将目的基因导入真核细胞，腺病毒从而通过结合细胞受体将这类基因送递至真核细胞。但是，腺病毒基因转移受到一些因素的限制，这部分来源于宿主对于腺病毒载体颗粒、该载体颗粒的分解产物或者转导细胞的应答。这些宿主应答包括非特异性应答和特异性免疫应答。所述非特异性应答包括炎性和非炎性变化。后者的一个实例是宿主细胞基因表达的变化。特异性免疫应答包括各种细胞应答及体液抗体应答。细胞应答包括辅助T-淋巴细胞、抑制性T-淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和天然杀伤细胞所介导的应答。
尽管腺病毒载体介导的基因转移的高效率，但是腺病毒载体介导基因转移的瞬时性表明有必要重复注射腺病毒载体。但是，最近对棉鼠的研究表明直接针对腺病毒载体的宿主免疫应答与基因转移效率的衰减以及重复注射后的表达相关。Yei等人，基因治疗，1192-200(1994)。E3区域编码gp 19K、10.4K、14.5K和14.7K这几种非病毒复制所必需的免疫调节蛋白，以及一种大小为11.6K的蛋白质，这种蛋白质为感染细胞的裂解以及传染性后代的释放所必需。
虽然E3区域对于病毒复制并非必不可少，但是其在调控宿主对病毒的免疫应答中发挥关键作用。例如，已知gp 19K能够结合内质网中的MHCⅠ类分子，从而抑制其糖基化以及向病毒转染细胞表面的转运。因此，转染后的细胞不能被细胞毒性淋巴细胞识别为外源物质。参见，Burgert.B.，等人，美国国家科学院院报1987,Vol.81356-60。
由于E3区域具有多种功能，所以希望获得一种具有下述特性的腺病毒用于基因治疗根据载体的预期用途缺失E3中的特定部分，而代之以外源的DNA。例如，描述了E3区域中可以去除Xba 1位点之间的1.88Kb片段的缺失。参见Berkner,K.Sharp，P.，(1983)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)Vol.11.pages 6003-6020，及Haj-Ahmad，Y.和Graham，F.(1986)病毒学杂志(J.Virol.)Vol.57.pages 267-274。另外还描述了用于构建在E1和E3区域中带有插入片段或缺失的组合物及方法。参见，Ginsberg，H.S.等人，美国国家科学院院报1989，Vol.86，pp.3823-7。
因此，尽管现在已有在E3区域突变或该区域大部分缺失的载体，但是迄今为止还没有一种去除了该区域中的选定部分而代之以外源DNA的腺病毒载体。
发明概述本发明的第一个目的为描述具有下述特征的重组腺病毒载体即E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点，或者其中包含的选择基因，如有必要，代之以外源基因，该外源基因表现出的表达模式在定时和表达程度上都类似于它所取代的内源腺病毒基因。
本发明的第二个目的为描述在编码6.7K和gp19K蛋白的E3区域的早期区域基因中含有限制位点的重组腺病毒载体。
本发明的第三个目的为描述在编码10.4k.14.5k和14.7k蛋白的E3区域中含有限制位点的重组腺病毒载体。
本发明的第四个目的为描述具有下述特征的重组腺病毒载体即E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点，或者其中包含的选择基因，以及用于其中取代以外源DNA的组合物和方法。
本发明的第五个目的为描述在E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点的重组腺病毒载体，或者其中包含的选择基因的制备方法。
本发明的第六个目的为描述含有重组腺病毒载体，或者其中包含的选择基因的宿主细胞，所述重组腺病毒载体E3区域部分或全部缺失。
本发明的第七个目的为描述在E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点的重组腺病毒突变体或者其中包含的选择基因。
本发明的第八个目的为描述在E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点的重组腺病毒突变体或者其中包含的选择基因，包括病毒粒体E3SV、E3SV+V、E3SV+B以及E3SV+V+B。
本发明的第九个目的为描述在E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点的重组腺病毒突变体，其中所述突变体在该腺病毒基因组其它部分还有突变，优选在E1 A、E1 B和/或E4区域中。
本发明的第十个目的为描述用于诊断或治疗疾病的方法和组合物，优选涉及多余的细胞生长的疾病，包括瘤形成，使用在E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点的重组腺病毒突变体或者其中包含的选择基因，其中所述的腺病毒突变体的E3区域中取代入编码具有医学应用价值的蛋白质的基因。优选的取代基因包括异源基因如负选择基因，优选胞嘧啶脱氨酶和胸腺嘧啶激酶。
本领域普通技术人员在阅读了下面说明书中对本发明各方面所做的描述之后，就会对本发明上述的这些以及其它的目的有清楚的认识。本发明上述的这些以及其它方面在下面的附图、发明详述及实施例部分有更为详细的描述。
附图简述
图1给出的是腺病毒5型E3区域转录单位的图谱。断开的箭头表示mRNAs的剪接结构(空心矩形或实线代表外显子，虚线代表内含子)。箭头厚度代表相对丰度。箭头上方的阴影条表示E3蛋白，它们是根据其分子量命名的。
图2给出的是用pNB和Ad5 TP-DNA制备重组病毒(m.u.代表图单位)。
图3给出的是用pSN和Ad5 TP-DNA制备重组病毒。
图4给出的是腺病毒E3SV E3区域的限制性图谱。
图5给出的是腺病毒E3SV+V E3区域的限制性图谱。
图6给出的是腺病毒E3SV+B E3区域的限制性图谱。
图7给出的是腺病毒E3SV+V+B E3区域的限制性图谱。
图8给出的是模拟感染或用Ad5感染的A549细胞。
图9给出的是用301、302、303和304感染的A549细胞。
图10给出的是在感染后不同时间，从用病毒301、302、303和304感染的细胞制备溶胞产物，对其中的gp 19k进行western印迹分析。
图11给出的是在感染后不同时间，从用病毒301、302、303、304和305感染的细胞制备溶胞产物，对其进行CD分析。
图12给出的是在感染后不同时间，从用病毒301、302、303、304和305感染的细胞制备溶胞产物，按0.6μg/反应的量对其进行CD分析。
图13给出的是在感染后的不同时间，病毒305和320的致细胞病变效应。
图14给出的是在感染后特定时间更换培养基或未更换培养基情况下，病毒320的致细胞病变效应。
发明详述本说明书中提到的包括专利和专利申请在内的所有公开出版物在此全文引入作为参考，其中每篇文献与其在特定情况单独所阐明的范围相同。
定义除有特别说明外，本发明中使用的所有技术及科学术语都与本发明所属技术领域内普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本发明使用的命名法以及下面所述的实验方法为本领域所熟知和常用的。
使用标准技术进行重组核酸方法、寡核苷酸合成以及微生物培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。通常，按照产品说明书进行酶促反应及纯化步骤。所述的技术和操作通常按照本领域常规方法及各种常见参考文献(一般参见Sambrook等人，分子克隆实验室手册，第2版(1989)纽约，冷泉港，冷泉港实验室出版社)进行，这些参考文献贯穿于本说明书全文。本发明使用的命名法以及下文提到的分析化学、有机合成化学及药物制剂学实验室方法都为本领域所熟知并被本领域经常使用。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制剂和送递以及患者的治疗。
本领域技术人员还应该认识到某些公开文献有助于基因工程构建本发明的腺病毒以制备出E3区域的突变体。这些公开文献包括McGrory，W.J等人，(1988)病毒学，vol.177，pp.437-444，此文描述了将DNA插入到E1区域；Hanke,T..等人(1990)病毒学，vol.177，pp.437-444和Bett.A.J.等人(1993)病毒学杂志，vol.67，pp.5911-5921，该文献描述了将外源DNA插入到E3区域；以及Bett.A.J.等人(1994)美国国家科学院院报vol.91，pages 8802-8806，此文描述了将DNA插入到E1和E3区域。
在代表本发明选择的具体实施方案的式子中，尽管通常不做明示，但是应该理解所述的氨基和羧基末端都以在生理pH值下所呈现的形式存在，除非另有说明。因此，在具体实施例或通式中，即使没有特指和明示，也应该理解到N-末端的H2-和C末端的O-都为在生理pH值下存在的形式。在本发明使用的多肽表示方法中，分子的左手端为氨基末端，右手端为羧基末端，与标准用法和惯例一致。当然，包括那些在非生理pH值下形成的盐在内碱性及酸性加成盐也包括在本发明所述化合物的范围之内。本发明所述氨基酸残基优选是“L”异构形式。但是，20种常规氨基酸的立体异构形式(例如，D-氨基酸)，a，a-分布氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸等非天然氨基酸以及其它非常见氨基酸也都可以是本发明所述多肽的合适成分，只要所述多肽能够保留期望的功能特性。对于给出的肽而言，选用的每个编码残基都用三字母命名，对应于常规氨基酸的通俗名称，与标准多肽命名法(参见生物化学杂志2433552-59(1969)并被37 CFR§1.822(b)(2)采用)一致。游离官能团，包括羧基或氨基末端的官能团，被称为非干扰取代基，也可以通过酰胺化、酰化或其它取代进行修饰，例如，这能够改变化合物的溶解度但不影响其活性。
本说明书使用的下列术语，除另有说明，都应当理解为具有下述含义术语“分离的蛋白质”在本发明中是指cDNA、重组RNA编码的蛋白质或者合成的蛋白质或者它们的组合，具有下述共同的特征(1)与自然界中发现的蛋白质不相关；(2)不含其它的同源蛋白质，例如，不含人体蛋白；(3)被不同种属来源的细胞表达，或者(4)不存在于自然界中。
本发明使用的术语“天然存在”是指一种物体可以在自然界中发现。例如，生物体内(包括病毒)的多肽或多核苷酸序列，它们可以从自然的来源中分离出来，这些序列未经实验人员有意修饰，是天然存在的。
术语“腺病毒”在本发明中是指从人体分离的40多个腺病毒亚型，以及从其它哺乳动物及鸟类中分离到的众多亚型。参见，Strauss,“人体内的腺病毒感染”，《腺病毒》Ginsberg，ed.，Plenum出版社，纽约，NY，pp.451-596(1984)。优选地，该术语适用于两个人血清型，Ad2和Ad5。
本发明使用的术语“多核苷酸”是指长度至少10个碱基的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸也可以是脱氧核苷酸或者任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链及双链形式。
本发明使用的术语“寡核苷酸”包括通过天然存在及非天然存在的寡核苷酸键连接在一起的天然存在的核苷酸及修饰的核苷酸。寡核苷酸长度为200个或更少碱基的多核苷酸子集。优选寡核苷酸长为10～60个碱基。寡核苷酸通常为单链，例如作为探针的寡核苷酸；尽管寡核苷酸可以是双链形式，例如用于构建基因突变体的寡核苷酸。本发明所述的寡核苷酸既可以是有义也可以是反义寡核苷酸。本发明使用的“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本发明使用的术语“修饰的核苷酸”包括带有修饰或取代糖基等本领域已知基团的核苷酸。
本发明使用的术语“标记”或“标记的”是指掺入一种可检测的标记物，例如掺入一种放射性标记的氨基酸或者连接一种生物素基团的多肽，该生物素基团可以用标记亲和素(例如，含有一种荧光标记物或可用光学或比色法检测的酶促活性的链霉亲和素)检测。各种标记多肽及糖蛋白的方法为本领域已知，并且都可以使用。标记多肽的实例包括，但不限于下述形式放射性同位素(例如，3H、14C、35S、125I、131I)、荧光标记物(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光剂(lanthanide phosphors))、酶促标记物(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光物、生物素基团、可被二级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链成对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标记)。在一些实施方案中，在标记物上连接有各种长度的间隔臂以减小潜在的空间位阻。
本发明使用的术语“序列同源性”描述的是两段核酸序列之间碱基匹配的比例或者两段氨基酸序列之间氨基酸匹配的比例。当序列同源性用百分比表示时，例如50％，所述的百分数表示的是在能与某一序列相比的序列的长度上相配者的比例。缺口(这两条序列的任一条)可以实现最大限度的匹配；通常使用长度为15个或更少碱基的缺口，优选为6个或更少碱基，更优选为2个或更少碱基。
本发明使用的术语“选择性杂交”是指可检测并且特异性地结合。本发明所述的多核苷酸、寡核苷酸及片段在下述杂交及洗涤条件下选择性地与核酸链杂交该条件可使与非特异性核酸可检测结合的可估计的量降低到最低限度。可以使用高度严格条件来实现本领域已知的及本发明中讨论的选择性杂交条件。通常，本发明所述的多核苷酸、寡核苷酸及片段与目的核酸序列之间的核酸序列同源性应为至少80％，更典型地优选将同源性增至至少85％、90％、95％、99％和100％。
如果在两个氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，那么这两个序列就是同源性的。例如，85％同源性是指当将两序列对比最大限度匹配时有85％的氨基酸是相同的。允许最大限度匹配时存在缺口(在两条匹配序列的任一条中)，优选5个或更少碱基的缺口长度，更优选2个或更少碱基。替代并优选的是，在本发明中使用这一术语时，如果采用具有突变数据矩阵的ALIGN程序两条蛋白序列(或由它们衍生的长度至少30个氨基酸的多肽序列)具有超过5(以标准差单位表示)的对比得分和6或更大的缺口罚分，则它们是同源性的。参见，Dayhoff.M.O.，1972，第5卷，国家生物医学研究基金会，pp.101-110.及此卷的增补本2,pp.1-10。更优选地，当用ALIGN程序进行最佳序列对比时，如果它们的氨基酸有大于或等于50％相同，那么这两条序列或其部分是同源性的。
本发明使用的术语“相应于”是指一多核苷酸序列同源于(即，等同于，而不是在进化上严格地相关于)参考多核苷酸序列全长或部分，或者是指一多肽序列与参考多肽序列具有同一性。截然不同的是，本发明使用的术语“互补于”是指互补序列与参考多核苷酸序列的全长或部分之间具有同源性。举例说明，核苷酸序列″TATAC″相应于参考序列″TATAC″，且互补于参考序列″GTATA″。
使用下列术语描述两或多个多核苷酸之间的序列关系“参考序列”、“对比视窗(comparison window)”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“实质同一性”。“参考序列”是指用作序列比较的基准的特定序列；参考序列可以是一较大序列的子集，例如，作为一全长cDNA或序列表中给定基因序列的节段可以包括完整的cDNA或基因序列。参考序列长度普遍为至少20个核苷酸，经常为至少25个核苷酸，常常至少为50个核苷酸。由于两个多核苷酸可以每个(1)包括在这两个多核苷酸之间相似的一段序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，以及(2)进一步还可以包括在这两个多核苷酸之间离散的一段序列，所以典型地通过在一对比视窗上比较两个多核苷酸的序列来进行两(或多)个多核苷酸之间的序列比较，以鉴定并比较序列局部区域的相似性。本发明使用的“对比视窗”是指具有至少20个连续核苷酸位置的概念节段，其中可以将一多核苷酸序列与一至少20个连续核苷酸的参考序列进行比较，其中对比视窗中的多核苷酸序列部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包括20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以实现两序列的最佳对齐。用于对准对比视窗的序列最佳对齐可以通过下列方法进行局部同源性算法Smith和Waterman(1981)应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2482,同源性对齐算法Needleman和Wunsch(1970)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48443，相似性检索法Pearson和Lipman(1988)美国国家科学院院报852444，这些算法的电脑运行(威司康星遗传学软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison，WI)，或检验，选择用不同方法建立的及最优对齐(即，导致对比视窗上的最高同源性百分率)。术语“序列同一性”是指在对比视窗上两多核苷酸序列是相同的(即，在核苷酸逐一对比的基础上)。术语“序列同一性百分比”是通过下述方法计算而来的在对比视窗上比较两个最佳对齐的序列、测定在两序列中出现相同核苷酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置数目从而得到匹配位置数目、用匹配位置数目除以对比视窗中的位置总数(即，窗口大小)，把结果乘以100就得到序列同一性的百分比。术语“实质同一性”表示多核苷酸序列的特性，其中该多核苷酸包括一段序列，该序列在具有至少20个核苷酸位置的对比视窗上与参考序列之间具有至少85％序列同一性，优选至少90～95％序列同一性，通常更优选至少99％序列同一性，往往在至少25-50个核苷酸的视窗上，其中所述的序列同一性百分比可以用下述方法计算出来比较参考序列与所述多核苷酸序列，对比视窗中该序列相对于参考序列可以包括20％或更少的添加或缺失。所述参考序列可以是一较大序列的子集。
本发明使用的“基本上纯的”是指目的种形为占主导地位的种形(即以摩尔计量时它比组合物中任一其它种形含量都更丰富)，优选地一种基本上纯化的级分是这样一种组合物，即其中所述目的种形占所有大分子种形总量的至少约50％(以摩尔计量)。通常，一种基本上纯的组合物将构成组合物中存在的所有大分子种形约80％以上，更优选约85％、90％、95％及99％以上。最优选，所述目的种形被纯化至基本同质(用常规检测方法检测不到组合物中的污染物种形)，其中所述的组合物主要由单一的大分子种形所组成。
当用于多肽时，术语“实质同一性”是指当用GAP或BESTFIT等程序通过错误区间加权(default gap weights)达到最佳对齐时，两个肽序列之间具有至少80％的序列同一性，优选具有至少90％的序列同一性，更优选具有至少95％的序列同一性，最优选具有至少99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸的取代而不同。保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基之间的可交换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
本发明使用的术语“多肽片段”或“肽片段”是指氨基末端和/或羧基末端缺失，但剩余氨基酸序列与例如从全长cDNA序列中推导出的天然存在的序列相应位置相同的多肽，。典型地，片段长为8-10个氨基酸，优选至少10-20个氨基酸，甚至更优选长20-70个氨基酸。
本发明中的其它化学术语按照本领域的常规用法使用，例示参见McGraw-Hill化学名词词典(编者Parker,S.,1985)，McGraw-Hill,SanFrancisco，在此引入作为参考。
从用遗传工程构建的克隆基因制备蛋白质已为人们所熟知，参见，例如授予Bell等人的4,761,371号美国专利中第6栏，第3行至第9栏，第65行。因此，随后的讨论目的在于概述本领域，而非打算反映本领域的全貌。
从本发明说明书可知，通过下列方法可以得到编码蛋白质的DNA，该DNA可插入本发明所述腺病毒构建体E3区域化学合成，从合适的细胞或细胞系培养物中筛选基因组文库，或者通过这些方法的结合，说明如下。可以利用从已知基因序列信息制备的寡核苷酸探针筛选mRNA或基因组DNA。可以按照本领域已知方法用荧光基团、放射性原子或化学发光基团等可检测基团标记探针，并将其用于常规杂交试验，更详细的描述见下列实施例。
替代地，可以使用聚合酶链反应(PCR)方法回收基因序列。参见，授予Mullis等人的序号为4,683,195和授予Mullis的序号为4,683,202的美国专利。
载体为可复制的DNA构建体。本发明中实现腺病毒E3突变体的优选载体实例是以Promega公司的pGEM载体系列为基础的。使用载体是为了扩增编码目的蛋白质的DNA和/或表达编码该蛋白质的DNA。一种表达载体就是一种可复制DNA构建体，其中编码目的蛋白质的DNA序列优选地连接到能影响该蛋白质在合适宿主中表达的调控序列上。这类调控序列的需要因选择的宿主及选用的转化方法而不同。通常，调控序列包括转录启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列、以及控制转录和翻译终止的序列。扩增载体不需要表达调控结构域。需要的只是在宿主中复制的能力，通常通过一复制起点和有助于转化体识别的选择基因赋予。
用于实施本发明的载体包括质粒、病毒(包括噬菌体)、及可整合的DNA片段(即，可通过同源重组整合到宿主基因组中的片段)。所述载体独立于宿主基因组进行复制，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。合适载体包括来自与期望表达宿主相容的种形的复制子和调控序列。转化的宿主细胞是那些已被用重组DNA技术构建的载体转化或转染的细胞。
当DNA区域功能上彼此相关时，可将它们操作地连接在一起。例如，如果一个启动子能调控编码序列的转录，那么就将其操作地连接到该编码序列上，如果一核糖体结合位点的位置使得翻译能够实现，那么就将该位点操作地连接到这段被翻译的序列上。通常，操作连接是指连续的，在前导序列的情况下，连续的并且在阅读框中。一个优选的实施方案中，在特定的E3区域DNA缺失并在其中取代了DNA的这些情况下，本发明所述的启动子是组织特异性启动子，该启动子可操作地连接到一负选择基因上。
合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、或高等真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括按下述方法构建的哺乳动物来源的细胞系。作例证的宿主细胞有DH5a、大肠杆菌W3110 (ATCC 27,325)、大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌294(ATCC 31,446)。
可以获得多种多样的合适微生物载体，并可以用于构建本发明所述的腺病毒载体。通常，微生物载体包括一个可被期望宿主识别的复制起点、一个能在宿主体内发挥作用的启动子以及一个表型选择基因，例如编码可赋予抗生素抗性或可提供自养需要的蛋白质的基因。可以为其它宿主构建类似的构建体。典型地用pBR322转化大肠杆菌。参见，Bolivar等人，基因2,95(1977),pBR322中含有氨苄青霉素和四环素抗性的基因，因而提供一种易于鉴定转化细胞的手段。表达载体应该含有一个可被宿主生物体识别的启动子。通常这是指从期望宿主获得的启动子。重组微生物表达载体中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等人，自然275,615(1978)；和Goeddel等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)8，4057(1980)和EPO专利公开36,776)以及tac启动子(H.De Boer等人美国国家科学院院报80,21(1983))。虽然这些启动子常用，但是其它的微生物启动子也是合适的。关于许多启动子核苷酸序列的详细资料已公开，使得本领域技术人员可以将其操作地连接到质粒或病毒载体的DNA上(Siebenlist等人细胞20，269,1980))。
来自多细胞生物的细胞培养物是重组蛋白合成的理想宿主。原则上讲，任一高等真核细胞都可使用，不管是出自脊椎动物还是无脊椎动物培养物。但是，优选哺乳动物细胞。这类细胞在细胞培养物中的繁殖已是常规方法。参见组织培养，Academic Press，编者Kruse和Paterson(1973)。有用的宿主细胞系实例有VERO和HeLa细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系、以及FL5,12、WI 138、BHK、COS-7、CV、和MDCK细胞系。这类细胞的表达载体通常包括(如果必要)复制起点、位于欲表达基因上游的启动子、外加核糖体结合位点、RNA剪接位点(如果使用的是含内含子的基因组DNA)、聚腺苷酸化位点、以及转录终止序列。
复制起点可以用下述方法来提供构建一种包括一外源起点的载体，例如可来自SV40或其它病毒来源(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)，或者可利用宿主细胞染色体复制机制来提供。如果所述载体被整合到该宿主细胞染色体中，则后一种方法可能就足够了。
用于转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录及翻译调控序列经常通过腺病毒等病毒来源提供。多种病毒及哺乳动物组成型启动子元件可供使用。参见，Mittal等人，(1993)病毒研究vo1.28,pp.67-90。例如，常用启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、以及猿病毒40(SV40)。参见美国专利4,599,308。早期及晚期启动子都是有效的，因为二者都可以作为还含有SV40复制起点的片段从病毒中容易地获得。参见Fiers等人，自然273,113(1978)。
腺病毒E3突变体的构建构建腺病毒突变体的方法通常已为本领域已知。参见，S.K.，病毒研究，1993,vol28,pages 67-90。而且，腺病毒5基因组以Genbank登记号M73260被注册，该病毒可从美国典型培养物保藏中心(美国典型培养物保藏中心，Rockville,Maryland,U.S.A.)获得，登记号为VR-5。
通常，腺病毒载体构建体包括一个用常规技术在质粒表达盒中缺失或修饰腺病毒基因组目的区域，优选Ad5基因组。例如，可以从Ad5基因组切出与第19549-31089位碱基对应的Ad5的NdeⅠ片段，并将其插入到合适的质粒中，优选插入购自Promega公司的pGEM5zf+。得到的这一质粒命名为pNB，在下列实施例中有更详细的描述。
然后，将pNB中出现的对应于腺病毒E3区域的腺病毒DNA或其片段克隆到另一种质粒中，该质粒也可以是pGEM5zf+。例如，可以从pNB中切出对应于第27082-31089位碱基的腺病毒SpeⅠ-NdeⅠ片段，并将其克隆到pGEM5zf+多克隆位点(MCS)中的SpeⅠ和NdeⅠ位点。得到的这一载体命名为pSN，其中出现的腺病毒DNA第27082-31089位碱基可以用来构建到E3区域的目的预期限制性位点得到合适的E3载体、质粒及病毒，详细讨论见下。
用于构建腺病毒的特定材料及方法的描述参见，Hanke,T.，等人，(1990)病毒学vol,177.pages 437-444.和Bett，A.I.，等人，(1993)病毒学杂志Vol 67,pages 5911-5921，以及PCT/CA96/00375。位于341Bering Avenue,Toronto,Ontario Canada的Mierobix Biosystems,Inc.出售用于构建腺病毒突变体的多种材料，并且提供如何制备它们的产品资料页。
值得注意的是，虽然本发明描述的是腺病毒5型，但是也可以用其它类似血清型的腺病毒来实施本发明。腺病毒基因组的总体组构在各血清型间是保守的，并且特定功能的位置类似。
可以将本发明所述的E3区域突变体引入到E3以外区域已发生突变的腺病毒突变体中。优选地，这类突变发生在腺病毒基因组的E1b和/或E1a和/或E4或f6区域。这些优选突变可赋予腺病毒与正常细胞相比优先在成瘤细胞中复制的能力，其中所述的成瘤细胞是肿瘤抑制基因p53缺陷细胞。典型地，这类突变出现在编码55k蛋白的E1B区域。缺陷型p53可以多种方式出现，包括与p53相互作用的那些蛋白质中的缺陷；也就是说，能使p53功能失活的p53途径中的缺陷，参见美国专利5,677,178。因此，可以将本发明所述的E3突变体与腺病毒d1 1520中的E1 B缺失结合。该腺病毒的描述见Barker和Berk(1987)病毒学156107。
就E1 A突变体而言，可赋予腺病毒与正常细胞相比优先在成瘤细胞中复制的能力，其中所述的成瘤细胞为成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因产物或p105 Rb功能缺陷。这类失活突变典型地发生在E1 a CR1区域(Ad 5的第30-85位氨基酸；第697-790位核苷酸)和/或CR2结构域(Ad 5的第120-139位氨基酸；第920-967位核苷酸)，这些结构域参与结合p105 RB蛋白。优选地，腺病毒基因组CR3结构域(跨第150-186位氨基酸)保留，表达为截短的p289R多肽，并在腺病毒早期基因的反式激活中发挥作用。缺陷型Rb可以各种形式出现，包括与Rb相互作用的那些蛋白质的缺陷；也就是说，能使Rb功能失活的Rb途径上的缺陷，参见美国专利5,677,178。因此，可以将本发明所述的E3突变体与腺病毒Ad5 NT d1 1010中的E1 A缺失结合。
本发明另一方面为将异源基因引入到本发明所述E3突变体的E1 B、EIA、或E4或f6区域。因此，这类病毒在E3区，并且任选地在E1B、E1A或E4或f6中含有外源基因。这类外源基因或其编码生物活性肽的片段的实例包括免疫调节蛋白和前体药物活化剂(即，胞嘧啶脱氨酶、胸腺嘧啶激酶，美国专利5,358,866和5,677,178)。前者的实例包括白介素2，美国专利4,738,927或5,641,665；白介素7，美国专利4,965,195或5,328,988；以及白介素12，美国专利5,457,038；肿瘤坏死因子α，美国专利4,677,063或5,773,582；γ干扰素，美国专利4,727,138或4,762,791或者GM-CSF，美国专利5,393,870或5,391,45。另外的免疫调节蛋白还包括巨噬细胞炎性蛋白，其中包括MIP-3，(参见，Well,T.N.和Peitsch,MC.J.Leukoc.Biol.vol 61(5)pages 545-50,1997)；以及细胞自杀或凋亡诱导蛋白，其中包括BAD和BAX，参见，Yang,E.，等人，细胞vol 80.pages 285-291(1995)和Sandeep,R.，等人，细胞vol.91,pages 231-241(1997)。
如上所述，E3区域中含有能使该区域部分或全部缺失的限制位点或其中含有的选择基因的重组腺病毒载体，构建这种腺病毒载体的初始步骤是用分子生物学已有技术在质粒盒中制备腺病毒基因组突变体，参见本发明。下列限制性位点被构建入腺病毒5的E3区域中PacⅠ、ClaⅠ、PmeⅠ、SwaⅠ、BamHⅠ、BstBⅠ、SspⅠ、NheⅠ、以及StuⅠ和EcoRⅤ。它们在E3区域中的相关位置参见图4-7。限制性位点的位置确保不破坏关键剪接和聚腺苷酸化信号。另一需考虑的是蛋白质编码序列在E3区域中的位置；多数情况下，制备突变体添加新的限制位点应不改变编码序列；但是，当出现氨基酸变化时，它们性质上是保守的。
因此，重要的是指出，这类在E3区域中插入一个或多个外源基因的腺病毒具有下述的重大优势这些基因表现出的表达模式在定时和表达程度上都类似于它所取代的内源性腺病毒基因。
本发明所述的腺病毒载体也可以在已缺失的部分E3区域中引入一个组织特异性启动子，该启动子能够驱动另一基因，优选地为一负选择基因的表达。组织特异性启动子的实例包括前列腺特异性抗原启动子，参见，PCT/US95/14461。某些负选择基因的实例包括胞嘧啶脱脱氨酶和胸腺嘧啶激酶。有关胞嘧啶脱氨酶，参见，美国专利5,358,866和5,677,178。
例如，可以将HSV tk基因表达盒任选地连接到紧靠E3启动子的下游。经常，期望缺失非必要部分(即，病毒复制及包装相关部分)以适应所述的负选择基因，因此可以缺失E3基因的必要区域并用一负选择基因表达盒取代，例如任选连接到一组织特异性启动子(及增强子)或其它合适启动子/增强子上的HSV tk基因。替代地，可以将负选择基因任选连接到腺病毒晚期区域启动子以便在表达复制表型的细胞中提供足够表达量的负选择基因产物，所述表型的特征在于自晚期基因启动子转录。
HSV tk基因在一种细胞中的表达对该细胞并没有直接毒性，除非该细胞暴露于鸟嘌呤或FIAU等负选择试剂。表达复制表型的感染细胞中负选择基因基本上得到表达，加入有效量的负选择试剂之前，这类感染细胞可以基本不产生任何附加细胞毒性，当加入负选择试剂时，表达tk基因的感染细胞将被选择性地的溶解；因此，负选择可以用来使致细胞病变的杀伤增强和/或通过表现复制表型的杀伤细胞来抑制病毒进一步复制。
一个优选的实施方案是将HSV tk基因表达盒(Zjilstra等人(1989)自然342435；Mansour等人(1988)自然336 348；Johnson等人(1989)科学2451234；Adair等人(1989)美国国家科学院院报864574；Capecchi,M.(1989)科学2441288；在此引入作为参考)操作地连接到一带有聚腺苷酸化位点的合适启动子和/或增强子上形成tk表达盒。将该 tk表达盒(或其它负选择表达盒)插入腺病毒基因组，例如取代E3区域的实质缺失。
可以用本发明所述的编码目的蛋白质的腺病毒载体来转化合适的哺乳动物宿主细胞。可以采用本领域任一已知方法实施转化而将多核苷酸导入到宿主细胞中，包括，例如把多核苷酸包裹到病毒中，再用该病毒转导宿主细胞或者用本领域已知方法进行转染，例示参见美国专利4.399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455。根据要转化的宿主来决定使用的转化方法。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法为本领域已知，其中包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物介导的转染、电穿孔、将多核苷酸封装入脂质体、以及将DNA直接微注射到细胞核中。
治疗方法通过向患者施用含本发明腺病毒的组合物，可以治疗疾病，优选治疗肿瘤疾病，该组合物进一步还包括一种负选择基因。后者的实例包括胞嘧啶脱氨酶和胸腺嘧啶激酶。
本发明所述的腺病毒构建体可以用来治疗各种人类肿瘤，具体地说是这样的腺病毒构建体，它们的E3区域编码一种能够用于疾病的基因治疗的蛋白质。一个实例是细胞因子，优选为一种白介素。通过施用抗肿瘤有效量的适当腺病毒，可以治疗，例如但不限于，患有下列疾病的患者或非人哺乳动物支气管癌、鼻咽癌、喉癌、小细胞及非小细胞肺癌、肺腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、或淋巴细胞性白血病。可以通过各种途径将感染性腺病毒粒体的悬液施用于肿瘤组织，包括静脉内的、腹膜内的、肌内的、皮下的、以及局部的途径。每ml含约103～1012或更多个病毒粒体的腺病毒悬液可以作为细雾吸入(例如，肺部传输治疗支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、或喉癌)或者直接拭抹到肿瘤部位治疗肿瘤(例如，支气管癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌)或者可以通过输注(例如，输注到腹腔治疗卵巢癌，输注到门静脉治疗肝癌或其它非肝原发性肿瘤引发的肝转移)或以其它合适途径给药，包括向肿瘤组织直接注射(例如，乳腺癌)、灌肠剂(例如，结肠癌)，或导管(例如，膀胱癌)。
通过与移植了肿瘤细胞但未经处理的小鼠相比，进一步评定本发明所述腺病毒突变体在减小移植了肿瘤细胞的nu/nu小鼠体内肿瘤发生机率或降低肿瘤细胞数目方面的能力。
使用本发明所述E3病毒实施的腺病毒治疗可以与其它抗肿瘤方法，例如传统的化疗方法相结合。另外，当本发明所述的E3腺病毒载体或病毒能激发免疫应答从而减弱它们在宿主体内的作用时，可以将它们与一种适当的免疫抑制药物联合使用。
腺病毒突变体的繁殖典型地，将本发明所述的腺病毒突变体作为病毒原液在细胞系中繁殖(例如，293细胞系ATCC ＃CRL 1573，美国典型培养物保藏中心，Rockville,MD；Graham等人(1977)病毒遗传学杂志3659，或A549细胞)，所述细胞系应能提供某种期望的病毒功能，如果需要，运输中应能保证感染性突变体病毒粒体的复制和形成。
制剂腺病毒E3突变体可以配制成针对患者的治疗性和诊断性给药形式。就治疗或预防性用途而言，可以向患者或患病的非人脊椎动物施用一种含有药理学上有效量的一种或多种腺病毒突变体的无菌组合物，来治疗例如肿瘤疾病。通常，所述组合物在含水悬液中包含约103～1015或更多个腺病毒粒体。经常，向这类无菌组合物中加入一种药物学上可接受的载体或赋形剂。多种水溶液都可以使用，例如，水、缓冲水溶液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的并且一般不含除预期腺病毒粒体以外的任何其它颗粒状物质。当需要近似生理条件时，该组合物可以包含药物学上可接受的辅助物质，例如pH调节及缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。还可以包括能够增强腺病毒对细胞感染的赋形剂。
本发明的腺病毒或其中包含的DNA可以通过脂质体或免疫原性脂质体输送；这种输送可以根据肿瘤细胞群落上存在的细胞表面特性选择性地以肿瘤病毒为目标(例如，存在能够结合免疫原性脂质体中的免疫球蛋白的细胞表面蛋白质)。典型地，将含有病毒粒体的水悬液封装在脂质体或免疫原性脂质体中。例如，可以用常规方法，将腺病毒粒体悬液封装于微胶粒中形成免疫原性脂质体(美国专利5,043,164、4,957,735、4,925,661；Connor和Huang(1985)细胞生物学杂志101582；Lasic DD(1992)自然355279新的药物输送(编者Prescott LF和Nimmo WSWiley，纽约1989)Reddy等人(1992)免疫学杂志(J.Immunol.)148page 1585)。免疫原性脂质体中含有一种能够特异性结合所述个体癌细胞上存在的癌细胞抗原(例如，CALLA、CEA)的抗体，这样的免疫原性脂质体可以用来靶向所述细胞上的病毒粒体或病毒粒体DNA。
含有本发明腺病毒或其鸡尾酒配合的组合物可以用来预防和/或治疗肿瘤疾病。在治疗应用中，向已患有特定肿瘤疾病的患者施用组合物，其用量足以治愈或至少部分抑制病情及其并发症。足以实现这一目的的用量被定义为“治疗有效量”或“有效剂量”。对于这种用途有效的用量取决于病情的严重程度、患者总体状况、以及给药途径。
在预防应用中，向尚未出现肿瘤病情的患者施用含有本发明腺病毒或其鸡尾酒配合的组合物，以增强患者对于肿瘤复发的抗性或者延长缓解时间。这一用量被定义为“预防有效量”。对于这种用途，确切用量还取决于患者的健康状况以及一般免疫水平。
所述组合物可以单一或复合给药，剂量水平及给药方式由临床医师来选定。无论怎样，所述药物制剂都应该能保证本发明所述抗肿瘤腺病毒的量足以有效治疗患者。
本发明所述的抗肿瘤腺病毒治疗方法可以与其它抗肿瘤方法，例如与传统的化疗方法联用。
本发明的用途从以上讨论明显地可以看出，本发明所述的腺病毒载体/病毒具有包括基因治疗在内的多种用途。例如，在本发明的一个实施方案中，可以将编码一种医学上有用的蛋白质的基因克隆到本发明所述病毒粒体的E3区域中，然后可以将该病毒粒体直接用于基因治疗方法来治疗疾病。在本发明的另一实施方案中，如上讨论，所述E3突变体病毒粒体还可以在E1 b区域中具有缺失并代之以一种具有期望特性的基因。无论是在E3还是E1 B区域，这类基因都可以编码细胞因子，包括白介素、细胞周期调控蛋白、包括p16，或ras，或者能诱导细胞自杀或凋亡的蛋白、前体药物活化剂，包括胞嘧啶脱氨酶或胸腺嘧啶激酶。另外，还可以使用肿瘤坏死因子α、干扰素γ以及mip-3。
也可以使用本发明所述腺病毒载体表达可作为有效免疫原或疫苗的蛋白质，并且转化通常不表达特定蛋白质的细胞从而随后表达该蛋白。表达这些分子的细胞可以用作中间体制备用于结合试验的细胞膜制剂，其反过来可以用于药物筛选。
下列实施例目的在于说明本发明的具体实施方案及其各种用途。给出这些实施例只是为了说明的目的，而非限制本发明。
实施例1一般方法及操作载体构建及繁殖人腺病毒载体的方法为本领域已知，本领域普通技术人员明白如何将这些方法用于下列实施例。这类方法包括下列文献中的操作方法Hitt,M.，等人构建及繁殖腺病毒的方法。见细胞生物学实验室手册；J.Celis(Ed)，Academic Press,N.Y.(1996)；Graham,F.L.和Prevec,L.以腺病毒为基础的表达载体和重组疫苗。见疫苗解决免疫学问题的新方法。R.W.Ellis(ed)Butterworth.Pp.363-390；以及Graham,F.L.和Prevec,L.腺病毒载体的操作。见分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，Vol.7基因转移和表达技术E.J.Murray和J.M.Walker(eds)Humana Press lnc.,Clifton,N.J.pp109-128,1991。下面用到了这些文献中描述的材料和方法。
腺病毒载体
对以pGEM (Promega Corp.)为基础的载体进行修饰，并将其用于克隆、亚克隆、以及使Ad5合适的E3区域发生突变。该操作利用的是E3区域中的现有位点，这些位点见表1。
TableⅠAd5中存在的限制位点NdeⅠ19549和31089SpeⅠ27082EcoRI27295和30049SunⅠ28390EcoRⅤ 27295KpnⅠ28787MunⅠ29355NotⅠ29510Xho1 29791HpaⅠ30569将Ad5中对应第19549～31089位碱基的NdeⅠ片段插入到pGEM5Zf+(Promega Corp.)的NdeⅠ位点，构建出名为pNB的载体。通过把Ad5中的SpeⅠ(27082)～NdeⅠ(31089)片段克隆到pGEM5Zf多克隆位点(MCS)中的SpeⅠ和NdeⅠ位点，进一步亚克隆，得到的质粒命名为pSN。制备pNB载体的目的是为使病毒构建容易；可以分离Ad5 NdeⅠ片段并连接到NdeⅠ切割的Ad5 TP-DNA。然后如图2所示，用其转染细胞。由于重叠区域广泛，如图3所示，所以将该构建体用于同源重组进行病毒构建也是切实可行的。构建pSN质粒的理由在于它含有欲操作的E3区域以及它比pNB小因而限制了限制位点种类的多样性。
就pSN而言，由于载体pGEM5中含有3个SspⅠ位点(2199,2384,2408)，所以对其做了进一步的修饰；SspⅠ是E3穿梭载体中的工程位点之一。缺失载体中的SspⅠ位点后，由于不涉及部分限制性消化，所以有助于将基因插入到E3 SspⅠ位点。为了缺失载体位点，用SspⅠ和EcoRⅤ(位于多克隆位点(MCS)中第51位碱基)切割质粒pGEM5，并重新连接。不幸的是，第2199位上的SspⅠ遗憾地缺失了，在得到的改变的载体中已发现。所以得到的载体缺失范围为从第2384位的SspⅠ到第51位EcoRⅤ。尽管缺失这些位点中的两个就可以简化目的片段的分离，但是由于这一额外SspⅠ位点的存在，所以当在E3区域中使用SspⅠ时，仍还需要进行部分限制性消化。另外值得注意的是在E3区域第30172位有一SspⅠ位点，当要使用工程SspⅠ位点时，该位点存在于将被切除的同一区域中。因此，这不影响消化模式，并且这是无足轻重的。这种改变的pGEM载体用作载体将Ad 5中的SpeⅠ～NdeⅠ区域插入，并且用于随后E3区域中的操作，并用pG指示。
实施例2E3穿梭载体的构建使用上述载体，将下列限制位点构建到腺病毒5的E3区域PacⅠ、ClaⅠ、PmeⅠ、SwaⅠ、BamHⅠ、BstBⅠ、SspⅠ、NheⅠ、以及StuⅠ和EcoRⅤ。它们在E3区域中的相对位置见图7。仔细排列这些限制性位点，以便不有意地破坏关键的剪接和聚腺苷酸化信号(参见，图1)。另外对于蛋白质的编码序列要注意的是大多数情况下都不要改变编码的氨基酸，当必须改变时，这些改变应是保守性的。带有这些改变的病毒构建体构建完成以后，与野生型Ad5比较剪接、蛋白质水平以及功能，从而确证上述穿梭载体中的E3基因的功效。
由于工程位点位置的限制，一些突变不得不循序进行。用于诱变的所有寡核苷酸序列以及确切位置(在Ad5中的位置序号)列于表中。所有突变都用限制性消化来确证，并对所有构建体测序。表2中概括了加入到Ad5的E3区域中的限制位点。
表2加入到Ad5 E3中的限制位点在Ad5基因组中的位置序号PacⅠ28497NheⅠ28532PmeⅠ29310BstBⅠ 29484StuⅠ29718EcoRⅤ* 29781ClaⅠ29862SspⅠ30377BamH1** 30467SwaⅠ30830*这一突变使得10.4K的起始密码子被改变**这一突变使得14.7K的起始密码子被改变按照厂商提供的方法，利用Transformer定点诱变试剂盒(Clonetech#K 1600-1)，通过分别用突变寡核苷酸PacC加PacNC以及ClaC加ClaNC，同时创建出Pac1和ClaⅠ位点。完全按照厂商提供的方法，利用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene ＃200518)，分别用突变寡核苷酸PmeC加PmeNC以及SwaC加SwaNC，单独创建PmeⅠ和SwaⅠ位点。将含有KpnⅠ-XhoⅠ(天然的Ad5位点)片段插入到含有Pac1/ClaⅠ的质粒中从而将PmeⅠ位点克隆到该质粒中。用Hpal～NdeⅠ片段将SwaⅠ位点插入此构建体中。得到的构建体命名为pG-PPCS，用于下一轮的诱变。BamHⅠ下列的所有突变都是利用一种高保真的酶-Pfu聚合酶，通过以PCR为基础的诱变方法(参见核酸研究175404-1989，以及授予Mullis等人的序号为4,683,195和授予Mullis的序号为4,683,202的美国专利)来创建的，然后对用PCR制备的所有片段测序并确定无误。将该方法用于两个连续PCR反应，然后切割最终产物，以便插入期望质粒。
使用上述质粒pG-PPCS作模板，通过在第一轮PCR中使用寡核苷酸BamC和SwaNC以及在第二轮PCR中使用该产物和PmeC，创建出BamHⅠ位点。将该片段(第二轮PCR的产物)用PmeⅠ和SwaⅠ消化，插入到pG-PPCS，并将其命名为pG-PPCS+B。值得注意的是，这种突变还改变了14.7K的起始密码子以防止该位点中任一插入基因的超前启动，而且在E3穿梭载体最终的4个版本中，只有2个带有BamHⅠ位点。BstBⅠ、NheⅠ和StuⅠ在第一轮PCR中使用寡核苷酸BstBC和SwaNC以及第二轮PCR中使用PmeC加上第一轮产物，创建BstBⅠ位点。使用的模板为pG-PPCS。用MunⅠ和SwaⅠ消化第二轮PCR的产物，并插入到pG-PPCS得到pG-PPBCS。为了制备出该构建体一种含有BamHⅠ位点的版本，将带有该位点的ClaⅠ-HpaⅠ片段插入制备出pG-PPBCS+B。
在第一轮PCR中使用NheC和PmeNC以及第二轮PCR中使用SunC加上第一轮产物，创建NheⅠ位点，在这两个独立的反应中分别使用pG-PPBCS+/-B为模板。用PacⅠ和PmeⅠ消化该片段，并插入到上述构建体PPBCS+/-B的两个版本中。该构建体称为PG-PNPBCS+/-B。用pG-PPBCS+/-B为模板，通过在第一轮PCR中使用StuC和SwaNC以及第二轮PCR中使用PmeC和第一轮产物，添加入StuⅠ位点。用MunⅠ和SwaⅠ消化该片段，并插入上文(-或+BamHⅠ)所述质粒的两个版本，分别命名为pG-PPBSCS或pG-PPBSCS+B。通过用PacⅠ和PmeⅠ消化两质粒并将含有NheⅠ位点的片段(源自pG-PNPBCS)插入到含StuⅠ的质粒(pG-PPBSCS)，将新的StuⅠ和NheⅠ位点添加在一起。在含有和不合BamHⅠ位点的质粒中进行该项操作，得到的质粒分别命名为pG-PNPBSCS+B和pG-PNPBSCS。SspⅠ和EcoRⅤ用上述的质粒pG-PNPBSCS和pG-PNPBSCS+B作模板，制备后两个突变体。在第一轮PCR反应中使用EcoRVC和HpaNC引物以及在第二轮PCR中使用NheC和第一轮产物，创建SspⅠ位点。用XhoⅠ和HpaⅠ消化该片段插入含有或不含BamHⅠ位点的亲代质粒。在第一轮PCR反应中使用EcoRVC和HpaNC引物以及在第二轮PCR中使用NheC和第一轮产物，创建EcoRⅤ位点。用XhoⅠ和HpaⅠ消化该片段插入上文所述质粒。通过用PmeⅠ和ClaⅠ消化含有和不含BanHⅠ位点的质粒并将含有EcoRⅤ位点的片段插入到亲代质粒，从而将SspⅠ和EcoRⅤ位点添加在一起。值得注意的是，这种EcoRⅤ还改变了10.4K的起始密码子以防止插入到5’末端ClaⅠ位点的基因超前启动。由于含有EcoRⅤ位点的区域也参与剪接，所以使用ClaⅠ位点代替EcoRⅤ位点插入基因。该区域的缺失可能会破坏这一事件。
E3穿梭载体最终的这些版本示于图4～图7。它们称为pE3SV、pE3SV+V、pE3SV+B和pE3SV+V+B，差别之处在于EcoRⅤ和BamHⅠ位点的存在与否。这些穿梭载体被用来构建随后的所有质粒，这些质粒或插入了外源基因或缺失了Ad5 E3基因。
用于诱变目的E3区域的寡核苷酸示于表3。
表3用于诱变腺病毒5中E3区域的寡核苷酸的序列SunC CCTCTCCGAGCTCAGCTACTCCATCAGPaeC GGAGGTGAGCTTAATTAACCCTTAGGGPacNC CCCTAAGGGTTAATTAAGCTCACCTCCCD2-NdeC GCTGCAAGTGCTGCACATGGGGCTGCATGEcoRVCGATTAAATGAGATATCATTCCTCGAGHpaNC GGCGGTGTCCGGTGGTATTACTGTCGNheC GGGTATTAGGCCAAAGGCGCAGCTAGCGTGGGGStuC CCCAAACAATGAAGGCCTCCATAGATTGGSspC CAGCTACTTTAATATTACAGGAGGAGBstBC GCGACCCACCCTTTCGAACAGAGATGACCAACBamC GGAGACGACTGACACCCTGGATCCAGAAATGGClaC CACATCGATGTAGACTGCClaNCGCAGTCTACATCGATGTGPmeC TAGAATAGGGTTTAAACCCCCCGGPmeNCCCGGGGGGTTTAAACCCTATTCTASwaC CTCAAAGATCTTATTCCATTTAAATAATAAASwaNCTTTATTATTTAAATGGAATAAGATCTTFGAGCD-PacC GTGAGCTTAATTAAGGCTAGCAATGTCGAATAACGCCD-SwaNC GTGAGCATTTAAATCAGTCGTTCAACGTTTGTAATC所有序列均按5’～3’的顺序书写。所有发生变化的碱基用下划线显示，插入的碱基用粗体表示。
实施例3病毒及对照的构建构建病毒的最后一个步骤是将这些改变后的E3区域插入到pNB质粒。为了实现这一操作，用SpeⅠ切割质粒pG-PPCS和pNB。pNB含有两个SpeⅠ位点一个位于Ad5插入片段中，一个位于pGEMS MCS。来自pNB的片段中含有MCS的一部分和NdeⅠ19549～SpeⅠ27082，将该片段插入SpeⅠ切割的pG-PPCS质粒。确证方向的正确性，得到的质粒命名为pNB-PPCS。通过将较小质粒中的PacⅠ～SwaⅠ区域插入到较大的pNB-PPCS，将E3穿梭载体的所有最终版本克隆到该质粒中。得到的质粒命名为pNB-E3SV、pNB-E3SV+V、pNB-E3SV+B和pNB-E3SV+V+B。如图2所示，然后用这些质粒制备相应的腺病毒，命名为E3SV、E3SV+V、E3SV+B和E3SV+V+B。这些腺病毒保藏于美国典型微生物保藏中心，登记号分别为XXX、XXX、XXX和XXX。
值得注意的是，有不同的几套位点可以用于将基因插入到6.7-gp19K区域。它们是PacⅠ与PmeⅠ、SunⅠ与MunⅠ、以及NheⅠ与PmeⅠ。位点PacⅠ位点与y-前导序列重叠，该序列是后期基因产物翻译中的重要序列。破坏该序列可能会废除其在某些方面的效力。因此，将另一个不与前导序列重叠的NheⅠ位点插入。如果没有发现任何不良效应，那么也可以使用Ad5中天然出现的SunⅠ～MunⅠ位点，这是因为其具有更大的克隆本领。
空白对照的构建就对照而言，用构建的位点缺失掉所有的E3基因。为了实现这一目标，用下列成对的酶切割穿梭载体，并用T4DNA聚合酶补平，然后重新连接PacⅠ和PmeⅠ、SunⅠ和MunⅠ、NheⅠ和PneⅠ、BstBⅠ和StuⅠ(全部位于pG-E3SV)、ClaⅠ和SwaⅠ(全部位于pG-E3SV+V)、ClaⅠ和SspⅠ(位于pG-E3SV+V)、以及BanHⅠ和SwaⅠ(位于pG-E3SV+B)。这些位点都被植入pNB载体用于病毒的构建。
实施例4CD质粒的构建为了测试穿梭载体系统的治疗作用，使用大肠杆菌基因胞嘧啶脱氨基酶(CD)因为它具有治疗效用。从ATCC获得CD(#40999，质粒pCD2)，并用下述方法从中扩增出CD基因。另外值得注意的是，CD基因中含有一个NdeⅠ限制性位点，并且我们打算用这种特定的酶切割出现在最终质粒中的NdeⅠ位点(Ad5 NdeⅠ位点19549和31089)，因此有必要用PCR诱变的方法除去CD中的NdeⅠ位点。该技术与在E3区域中构建新的限制性位点的方法相同，使用高保真的Pfu聚合酶。表3和4给出的是用于扩增CD基因的寡核苷酸。
简要地说，在NdeⅠ位点进行保守突变，将碱基T变为C。第一轮PCR反应所用引物为CD-NdeC和SwaCDNC。用质粒pCD2作模板。用该产物加上同样的模板和引物CD-PacC进行第二轮PCR反应。这样可以实现两个目标改变了NdeⅠ位点，并且分别在5’和3’末端添加了位点PacⅠ和SwaⅠ。用PacⅠ和SwaⅠ切割该终产物；再用PacⅠ和SwaⅠ切割切割穿梭载体E3SV。用Qiagen凝胶提取试剂盒凝胶纯化上述片段，然后用NEB T4 DNA连接酶将其连接在一起。用连接混合物转化大肠杆菌的XL-1菌株，并用含氨苄青霉素的平板进行铺板筛选，挑取克隆并培养。分离DNA，然后限制性消化筛选验证插入和缺失的正确性。然后通过完整的CD基因和周围载体对表现出正确性的克隆进行测序，核实没有发生任何多余突变。这种正确的并经过核实的克隆命名为pG-CDpacSwa，用于随后的扩增插入其它区域的CD基因的PCR扩增反应中。值得注意的是，CD基因中含有一个细菌起始密码子GTG。在所有引物中，该起始密码子都被收入并被改变成真核密码子ATG。
通过设计在5’和3’末端含有期望限制性位点的引物制备另一种含有CD的载体5’端引物总是含有ATG起始密码子。利用下列限制性位点将该CD基因插入E3区域BstBⅠ-StuⅠ、NheⅠ-MunⅠ、NheⅠ-PmeⅠ、PacⅠ-PmeⅠ、SunⅠ-MunⅠ、ClaⅠ-SwaⅠ、以及BamHⅠ-SwaⅠ。这些质粒分别命名为pG-CDBstStu、pG-CDNheMun、pG-CDNhePme、pG-CDPacPme、pG-CDSunMun、pG-CDClaSwa、pG-CDBamSwa。使用的所有引物都列于表3，模板都是经确证的质粒pG-CDPacSwa。将ClaⅠ-SwaⅠ区域中的CD基因插入E35V+V质粒；将BamHⅠ-SwaⅠ区域中的CD基因插入E3SV+B质粒。对所有插入片段都完整测序以保证没有多余突变发生而且CD正确的插入。
为了实现病毒构建，用PacⅠ和SwaⅠ消化构建体pG-CDClaSwa、pG-CDPacSwa和pG-CDBamSwa，然后凝胶纯化含有CD基因的片段。同时，还用PacⅠ和SwaⅠ消化载体pNB-E3SV，并凝胶纯化。连接上述纯化后的产物，转化细菌，筛选克隆、选择出用于进一步病毒构建的克隆。
从用上述E3插入得到的病毒中可以预见出下述几点。首先，如上所述，除去了y-前导序列部分的构建体，例如pG-CDSunMun，可能会对感染过程产生副作用。尽管y-前导序列几乎没有缺失，但是对于插入到PacⅠ位点的基因确实也是这样。另一点可以预见的是，11.6K区域中的插入片段，例如pG-CDBstStu，会使感染大大弱化。如公开文献中所述，与野生型的感染不同，11.6K蛋白(ADP或腺病毒死亡蛋白)的缺失使得感染后的细胞不能在适当的时刻裂解。这种情况下，细胞继续代谢，细胞中的病毒产物增高，细胞基本上已变成外源基因的工厂。另外，由于在感染晚期用主要晚期启动子能够大量合成ADP，所以希望插入到该区域中的外源基因也具有同样的特性。用这些病毒得到的结果将在下文讨论。
实施例5TNF质粒的构建含有鼠肿瘤坏死因子的质粒来源于ATCC(#63169)。该序列中含有包括编码原序列的区域在内的完整mTNF基因。用PCR从该质粒中扩增出mTNF基因，并用凝胶纯化。用BstB Ⅰ和StuⅠ切割pGE3SV，并用凝胶纯化。同时，用ClaⅠ和SwaⅠ切割另一载体pG-E3SV+V，并用凝胶纯化。将纯化后的PCR产物插入到各自对应的载体中，由于末端匹配所以这种操作切实可行。这些构建体分别命名为pG-mTNFBstStu和pG-mTNFClaSwa。
再用ATCC质粒为模板，PCR扩增mTNF基因。用BarnHⅠ和SwaⅠ切割质粒pG-E3SV+B和PCR产物，凝胶纯化，然后将它们连接在一起。该构建体命名为pG-mTNFBamSwa。对所有构建体进行粗略测序，检查多余的突变。
实施例6CD和TNF病毒的构建为了将上述构建体引入Ad5基因组，使用BstLink TP-DNA由于它具有上述的优势。用于这项操作的质粒载体的有关描述参见实施例8。使用Ad5野生型TP-DNA，用制备重组病毒相同的方法制备病毒构建体。需要指出的是，所有转染都使用6cm平板，而且一式两份；本发明所述的量都是每个6cm平板的用量。
方法用下述方法制备病毒E3-CD-Pacpme(0nyx 301)、E3-CD-NhePme(Onyx 302)、E3-CD-SunMun(Onyx 303)、E3-CD-NheMun(Onyx304)、E3-CD-BstStu(Onyx 305)以及E3-mTNF-BstStu(Onyx 320)首先，取0.5μg BstLink TP-DNA和10μg质粒，37℃下用EcoRⅠ(20单位)切割5小时。(使用过量的质粒DNA以确保每次转染都约有5μg真正的插入DNA)在这一点上，留下TP-DNA室温过夜消化，切割后的质粒1％穷追糖凝胶电泳过夜。用Qiagen凝胶提取试剂盒凝胶纯化上述插入片段。取用切割后的TP-DNA和纯化后的片段，用高浓度的T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim)16℃下过夜连接。将该反应混合物直接用于转染。
对于构建病毒CDPacSwa、mTNFClaSwa、CDBamSwa、mTNFBamSwa、而言，由于E3区域中的这些突变位于EcoRⅠ限制位点之外，所以使用不同的方法同源重组。DNA和TP-DNA的用量同上所述。用BstBⅠ切割TP-DNABstLink用于转染。用SpeⅠ和NdeⅠ切割含CD的质粒，用PacⅠ和Nde切割含mTNF的质粒。凝胶纯化这些片段，并用水洗脱。就转染而言，不进行任何处理，直接使用切割后的TP-DNA和纯化后的片段。
转染方法就转染而言，在试验前一天，用A549细胞在6cm平板上铺板，以便在转染当天细胞能够铺满约70～80％。为了转染这些细胞，制备两种溶液并混合。溶液A含有连接混合物以及300μlOptiMEM(LifeTeehnologies)/6cm平板。溶液B含有300μlOPtiMEM和13μl脂转染胺试剂(Life Technologies)。将这两种溶液加到一起，轻轻混合，然后室温温育30～45分钟。温育接近结束时，用温的OptiMEM洗涤细胞，并向每种细胞中各加入2.4ml的OptiMEM。然后将这种最终的3ml混合物直接加入洗涤后的细胞单层，37℃下温育5小时。然后，在不除去转染混合物的情况下向每个平板中加入3ml含20％PBS的DME，使得最终的血清浓度为10％。37℃下温育过夜。用8ml DME/2％ FBS/1.0％优质琼脂(agarnoble) (Difco)覆盖细胞。这次覆盖5天后，加入另一层覆盖物，这层覆盖物中含有0.3％中性红(Life technologies)帮助显色噬菌斑。
病毒突变体的繁殖和验证当噬茵斑出现时(转染后10～20天)，用无菌的巴斯德吸管吸取含有噬菌斑的琼脂栓。为了繁殖上述琼脂栓中的病毒，在前一天用DME/10％FBS将A549细胞接种于3.5cm的平板上。感染的当天，培养基换成DME/2％FBS，将分离到的噬菌斑加到细胞上。每天检查感染的CPE(细胞病变效应，即由于病毒的感染细胞变圆并从平板上脱落下来)，这种现象通常发生在感染后第3～5天。收集全部培养基及细胞，-20℃冻存。为了查实病毒的突变，取用200μl细胞及培养基的混合物，用Qiagen Blood试剂盒分离病毒DNA(以及细胞DNA)。使用对应于CD基因本身或侧翼E3区域的引物，用PCR方法验证纯化的DNA。一旦重组病毒DNA的PCR反应生成大小正确的片段，另外的特征包括用限制位点切割PCR片段显示出与CD或mTNF相同的模式，另外还对PCR产物测序。另外为确证收获病毒的正确性，还进行了Hirt分析。
用从3.5cm平板上获得CPE500μl感染T150 A549细胞，扩大培养正确的病毒。大约3天后出现完整的CPE(此时约有75％以上的细胞不再贴附培养瓶表面)。然后，用这种细胞及培养基混合物7.5ml感染一3升转瓶的kB细胞，进行CeCl分带。进行噬斑试验测定单位体积的感染颗粒。
采用这样的方式命名病毒，即让人们明显地看出加入了什么样的插入片段以及插入片段的位置。为了方便引用，还用数字来命名并置于括号中。它们的名称为E3-CD-PacPme(Onyx 301)、E3-CD-NhePme(Onyx302)、E3-CD-SunMun(Onyx 303)、E3-CD-NheMun(Onyx 304)、E3-CD-BstStu(Onyx 305)、以及E3-mTNF-BstStu(Onyx 320)。
CD试验为了检验胞嘧啶脱氨基酶(CD)的活性，进行类似Rogulski等人1997一文中描述的试验。简而言之，用A549细胞接种10cm平板，以使得感染当天细胞达70～80％的融合度(每块板上约2～4百万个细胞)。每种E3-CD病毒，均按每个细胞10个pfu(噬斑形成单位)的MOI(感染复数)感染细胞。引入Ad5和感染模拟物作为对照。就感染而言，针对每个平板将适当体积的病毒悬于2ml DME，然后加到细胞单层上。1小时后，向每个平板加入8ml DME/2％FBS培养基。感染后的不同时刻(4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、120小时)，清洗细胞，加入1ml预冷PBS，捣碎细胞(使用可调细胞捣碎机)，置于1.5ml微量离心管中离心。除去所有的PBS，用干冰/乙醇急骤-冷冻细胞沉淀，保存于-80℃。向每管沉淀中加入200μl试验缓冲液(100mM TrisHCl(pH 8.0)、1mM EDTA，1mMβ-巯基乙醇)，冻融4个循环裂解细胞。4℃全速离心5分钟，澄清溶胞产物。用Bio-rad试剂，通过Bradford试验测定蛋白含量。就酶切试验而言，从每个样品中取5μg或0.6μg测定蛋白含量，使用2.5mM[2-14C]-胞嘧啶(1微居里；5微升；Moravek Biochemicals，#MC 131)并用试验缓冲液使反应体积达到10μl。让反应在37℃继续进行1小时。为了使反应淬火，加入10μl冷的胞嘧啶/尿嘧啶(每份用量为0.4mg/ml)。每份样品取10μl滴加到薄层层析板(Baker#7009-04)上，然后置于装有1-丁醇-水(86％/14％)的平衡槽中。让溶剂的前沿接近平板顶部(约2小时)后，干燥平板，然后曝光于胶片。然后将该放射自显影图扫描成图形。鼠TNFα试验用A549细胞接种6cm平板，以使得感染当天细胞达约80％的融合度。按上述方法以10MOI的量实施感染。在感染后的不同时刻，除去培养基代之以3ml新鲜的DME/2％FBS。让反应在37℃继续进行1小时。该间隔后，取出1ml的等分培养基，保存于-80℃直到所有样品被收集。将培养基置于每个平板上以使在下一个时间点之前终体积为4ml。用ELISA试验(Biosource #KMC3012)测试分泌到培养基中的mTNF。每种样品一式两份进行测定，每个时间点从两个不同平板的感染细胞中收集。Western印迹分析就western印迹分析而言，用10 M.O.I.的量感染生长于6cm平板上的A549细胞。感染后的不同时刻，捣碎细胞并照上法收集。细胞沉淀冻存于-80℃。向每份样品加入300ml裂解缓冲液，冻融3次，并通过一22号针头。用Bradford试验测定蛋白含量。将10μg的总蛋白上样于14％SDS凝胶，电泳。将蛋白转印到PVDF转印膜上，用3％脱脂乳PBS溶液封闭，加入适当抗体。抗E3蛋白和抗pⅧ(一种在感染后期生成的蛋白质)的抗体是多克隆鼠抗体。抗体的使用浓度为1∶400。抗鼠TNF抗体来自R和D系统，使用浓度为0.1μg/ml。使用合适的二级抗体，用ECL系统(Amersham)显色。
除对细胞溶胞产物进行western分析外，对每小时间隔收集的培养基也进行western印迹分析，使用同样的抗-mTNF抗体，每个泳道培养基的负载量为25μl。
表4用来扩增CD基因的寡核苷酸。PacCDGTGAGCTTAATTAAGGCTAGCAATGTCGAATAACGCPmeCDGTGAGCGTTTAAACAGTCGTTCAACGTTTGTAATCGNheCDGGCCGCTAGCGGCTAACAATGTCGAATAACGCSunCDGTGAGCCGTACGAGGCTAGCAATGTCGAATAACGCMunCDGTGAGCCAATTGCAGTCGTTCAACGTTTGTAATCGBstBICD GCGCTTCGAAGTGGAGGCTAACAATGTCGAATAStuICD GGCCAGGCCTCTAAGCTCGCTGTAACCCAGTCG所有序列均按5’～3’的顺序书写。所有发生变化的碱基用下划线显示。插入的碱基用粗体表示。
实施例7CD或mTNF的病毒表达含CD的病毒E3-CD-Pacpme(Onyx 301)、E3-CD-NhePme(Onyx 302)、E3-CD-SunMun(Onyx 303)、E3-CD-NheMun(Onyx 304)也分别称为301、302、303和304。取病毒301、302、303和304，各以10M.O.I.(感染复数)的量感染A549细胞系。在感染后(p.i.)的指定时间按照方法部分的描述收集样品用于CD活性的分析。另外，在每个时间点，制备细胞图片显示表型差异。
图8显示的是模拟感染的对照物及Ad5-感染细胞，图9显示的是用带有插入到gp19K区域的CD的病毒，即病毒301、302、303和304感染的细胞。野生型感染进展正常，在感染后48小时表现出近乎完整的CPE。304病毒感染后48小时表现出接近野生型水平的CPE，而303表现出些微的温和感染。另两个病毒301和302表现出中间表型。有趣的是，303是用SunⅠ位点实施的CD取代，正如所料，该病毒的感染较野生型慢，这是由于y-前导序列的部分缺失，废除了其中晚期信号的添加从而可能减弱其感染效力。病毒301和302较Ad5只是轻微滞后，这是由于y-前导序列在301病毒中大部分或者在302病毒中完全完整。
试验表明插入到本发明所述E3病毒构建体中的外源基因的表达时间近似于它们所取代的内源基因。病毒301,302,303和304是gp19K取代物。如图10所示，Western印迹试验表明，gp19K的合成开始于感染后4～8小时之间。这接近于公开的数值。Western印迹试验显示感染后48小时显而易见。图10还表明CD病毒不生成gp19K，与预料符合，这是由于该基因被缺失。
为了查看CD合成的表达时间与gp19K合成是否近似，对CD蛋白进行功能分析。按照上面部分中描述的方法建立CD试验。尽管该蛋白十分稳定，但是该试验的稳定性仍不及Western印迹。由于这个原因，用两个不同的试验查看CD活性，每个反应中使用两个不同量的蛋白质。为了核对CD首次表达时间，每个反应使用5μg总蛋白。结果见图11。与gp19K一样，病毒301～304中的CD活性都一样早在感染后的8小时。这验证了内源表达时间与插入的CD基因近似。
为了查明各个位置CD蛋白的合成量，每个反应使用0.6μg，结果见图12。为了查明病毒之间相比底物的不完全转化，使用更少量的蛋白质。图12表明301,302和304合成了近似量的CD。另一方面，在约24小时303表现了底物的完全转化，这表明出现了成比例增多的CD。因此，我们认为该病毒可能生成了较其它病毒更多的CD。
ADP取代CD和mTNF如上所述，用CD或mTNF取代E3-腺病毒死亡蛋白(ADP)基因。现已知道，与野生型相比，ADP缺失后的病毒不能在预期时间溶解细胞。因此，该基因在病毒释放中发挥重要作用。与ADP缺失病毒一样，本发明所述的取代了该区域其它基因的病毒表现出类似的表型。结果见图13和图14。在感染后的72小时，当野生型感染表现出完整CPE时，病毒305(CD插入)和病毒320(mTNF插入)表现出明显的CPE。但是该感染直到感染后的96小时仍不能达到完整的CPE(图14)。如果每隔24小时更换一次培养基，所述细胞继续吸附，并且甚至在感染后的120小时仍表现出几乎完全正常的表型。直到感染后的164小时(7天)以后，细胞才明显地表现出典型的CPE，并出现死亡。这是一个重要的观察结果，在治疗观念上很有意义，因为即使感染细胞不立即溶解，然而它们继续表达目的性的异源基因。
ADP是一种由主要晚期启动子合成的晚期蛋白，在晚期，也就是说，DNA复制后高水平表达。为了测定插入的外源基因是否表现类似动力学，用305进行CD试验，用320测试mTNF。如图11所示，直到感染后的12小时，305才表现出基本的CD活性，此时以后病毒已进入了晚期。图11还对照了与早期区域gp19K中的CD对比的结果。很显然在蛋白合成时间上存在着差异。
为了比较CD活性的量，用0.6μg的总蛋白进行CD试验。当用视觉检查并与图12(同一时间未作试验)相比时，可以看出305合成的量根本不及301～304那么多。但是应该注意的是，305感染的细胞具有温和的感染过程。为了检查晚期感染，用细胞裂解物进行western印迹分析，使用的抗体为抗一种晚期结构蛋白的抗体，pⅧ和ADP(11.6K)。感染后的24小时，Ad5和320感染中可观察到11.6K和pⅧ这两种蛋白的表达，这表明该病毒在12和24之间已进入晚期。另外还观察到305不生成ADP，这在意料之中，因为它不含该基因。
插入到ADP位置的CD表现出与ADP类似的时间。用Onyx 320进行类似观察，Onyx 320在ADP位置中插入了mTNF。简而言之，感染细胞，并在感染后的不同时间制备溶胞产物。对这些溶胞产物进行Western印迹分析，用模拟感染的和Ad5-感染的细胞作对照。发现细胞内的mTNF表达直到感染后的24小时才被观察到。这与我们以前的下述发现一致取代内源性腺病毒基因的外源基因表现出类似的表达模式。
实施例8BstLink病毒/TP-DNA的构建插入一个选择的基因是一个复杂的过程，由于它涉及首先克隆入较小的质粒然后将其添加到较大的pNB-为基础的载体中。这差不多总是因为较大的pNB质粒较较小的pSN-为基础的质粒有着更多的限制位点。本发明使得克隆更加容易，这是由于本发明避免了部分切割后的片段的分离，这些片段往往很难与无用片段分离开来，而且在操作中引入较小的质粒通常可以提高产量。但是，由于它只能提供有限量的同源重组必需的重叠序列，所以将它们用于病毒构建体的共转染是很难的。例如，当按标准方法用EeoRⅠ切割TP-DNA时，在5’末端只有240个重叠的碱基对。因此，为了增大重叠区域，用下述方法制备一种名为BstLink的病毒。用已知的pG-Bst→Stu作为空白对照，因为它具有选择优势。它缺失了可以导致噬菌斑数目大大减小的11.6K的死亡基因。因此，当在筛选应该含有11.6K基因(或另一死亡基因)的重组病毒噬斑时，野生型(小噬斑)和重组型(较大噬斑)之间表型的差异使得重组筛选一目了然。用MunⅠ消化该质粒，用T4 DNA聚合酶补平，用连接方法加入一个BstBⅠ接头。之所以选择该限制性位点是由于它在Ad5基因组之外的其它任一地方不存在。该操作的目的是将构建体(根本不含11.6K而含有外加BstBⅠ位点的E3区域)引入病毒(任何本底物)，制备来自病毒的TP-DNA，然后将它用于病毒构建。这可以通过下述操作来完成用BstB Ⅰ切割TP-DNA并用带有该期望改变的E3质粒共转染。这样就增加了5’末端到2273碱基对的同源性。由于质粒不需要从小质粒到大质粒的进一步构建，所以时间保持恒定。另外，重组病毒根据表型差异更容易筛选。还必须对噬斑进行突变筛选，但是预料中的正确病毒克隆的比例更高。
现已对本发明做了充分的描述，本领域的普通技术人员在不脱离所附权利要求的实质或范围的情况下，能够对本发明做出众多的变动和改进。
权利要求
1．一种含有重组腺病毒载体或其中所含的选择基因的物质组合物，所述腺病毒载体在E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点。
2．权利要求1中所述的物质组合物，其中所述的重组腺病毒载体在编码6.7k和gp 19k蛋白的E3区域早期区域基因中含有限制位点。
3．权利要求1中所述的物质组合物，其中所述的重组腺病毒载体在编码10.4k、14.5k和14.7k蛋白的E3区域早期区域基因中含有限制位点。
4．一种含有重组腺病毒或其中所含的选择基因的物质组合物，所述腺病毒在E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点。
5．一种含有重组腺病毒或其中所含的选择基因的物质组合物，所述腺病毒在E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点，所述选择基因编码6.7k和gp19k蛋白。
6．一种含有重组腺病毒的物质组合物，所述腺病毒在E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点，所述选择基因编码10.4k、14.5k和14.7k蛋白。
7．一种含有重组腺病毒载体的物质组合物，所述腺病毒载体选自pE3SV、pE3SV+V、pE3SV+B和pE3SV+V+B。
8．一种含有腺病毒的物质组合物，所述腺病毒选自E3SV、E3SV+V、E3SV+B和E3SV+V+B。
9．权利要求1中所述的物质组合物，其中所述的部分或全部缺失的E3区域被编码异源蛋白的基因所取代，并且所述基因任选地可操作地连接到组织特异性启动子上。
10．权利要求1中所述的物质组合物，另外在所述腺病毒载体的E1A或E1b区域中还有一处缺失，其中所述的E1b区域编码一55k蛋白质。
11．权利要求10中所述的物质组合物，其中所述的部分或全部缺失的E1b或E1A区域被编码异源蛋白的基因所取代。
12．权利要求9或11中所述的物质组合物，其中所述的异源蛋白选自肿瘤坏死因子α、干扰素γ、白介素、细胞自杀蛋白以及mip-3。
13．权利要求9中所述的物质组合物，其中所述的异源蛋白是一种负选择基因。
14．权利要求13中所述的物质组合物，其中所述的负选择基因选自胞嘧啶脱氨基酶和胸腺嘧啶激酶。
15．含有权利要求7中所述腺病毒载体的细胞。
16．含有权利要求8中所述腺病毒的细胞。
17．一种用于治疗哺乳动物癌症的方法，所述治疗方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求9或11所述组合物，其中所述的异源蛋白具有抗肿瘤活性。
18．权利要求17中所述的方法，其中所述的异源蛋白选自肿瘤坏死因子α、干扰素γ、白介素、细胞自杀蛋白以及mip-3。
19．权利要求17中所述的方法，该方法进一步还包括将所述组合物用于化疗或免疫抑制。
全文摘要
本发明公开了腺病毒载体,包括突变腺病毒,所述腺病毒载体的E3区域中含有可使该区域部分或全部缺失的限制位点,或者其中含有的选择基因,以及如有必要,取代外源基因的组合物和方法,该外源基因将会表现出在时间的选择和表达程度方面都类似于其所取代的内源腺病毒基因的表达模式,并且进一步可任选地包括该腺病毒基因组中其它部分的突变,包括E1B或E1A区域,所述腺病毒载体可以用于诊断或治疗疾病,优选涉及多余细胞生长的疾病,包括癌症。
文档编号A61K48/00GK1298451SQ99805402
公开日2001年6月6日 申请日期1999年4月19日 优先权日1998年4月24日
发明者T·汉密斯顿, L·K·霍金斯, L·约翰森 申请人:昂尼克斯药物公司