免疫保护性原代间充质干细胞和方法

免疫保护性原代间充质干细胞和方法
【专利说明】免疫保护性原代间充质干细胞和方法 发明领域
[0001] 本发明设及间充质干细胞。更具体而言，本发明设及用于递送多肤的原代间充质 干细胞（MSC)，所述多肤针对病理因子例如病原体和毒素，W及用于制备此类MSC和针对病 理因子采用此类MSC的方法。
[0002] 序列表并入 关于本申请的生物学序列信息包括在引入本文作为参考的ASCII文本文件中，所述ASCII文本文件具有文件名"TU-491-沈Q.txt"，于2013年3月11日创建，并且具有12, 954 字节的文件大小。
[000引背景 间充质干细胞(MSC)是独特的多潜能祖细胞，其目前用作用于各种状况包括癌症和自 身免疫疾病的基因治疗载体。尽管MSC主要因在同种异体MSC移植期间的抗炎特性已知， 但存在MSC实际上可W促进某些背景下的适应性免疫的证据。MSC已在广泛多样的组织中 得到鉴定，所述组织包括骨髓、脂肪组织、胎盘和厮带血。脂肪组织是MSC的最丰富的已知 来源之一。
[0004]MSC已在各种临床和临床前背景下成功地移植到同种异体宿主内。运些供体MSC 通常促进免疫耐受，包括移植物抗宿主病（Gv皿）的抑制，所述Gv皿可W在来自主要组织相 容性复合物（MHC)错配供体的细胞或组织移植后发展。在MSC移植后缩减的Gv皿症状是由 于T和B细胞增殖、静止天然杀伤细胞的细胞毒性，和树突状细胞（DC)成熟的直接MSC抑 审IJ。至少一项研究已报道针对移植的同种异体MSC的抗体的生成。然而，预防Gv皿的能力 也提示在仅针对由MSC表达的外来抗原而不是特异性针对供体MSC的选择性诱导免疫应答 中，表达外来抗原的MSC在细胞疫苗接种期间可能具有超过其他细胞类型（即DC)的优点。
[0005] 经修饰的MSC的使用还已在体内进行探究，W便增强MSC的免疫调节特性。经转导 为过度生产IL-IO的MSC压制小鼠模型中的胶原诱发性关节炎（化Oi等人，2008)。另外，移 植到阿尔茨海默氏病小鼠模型内的表达膜高血糖素样肤-1的MSC导致脑中的A-P沉积的 减少（Klinge等人，2011)。在骨质减少的小鼠模型中，具有骨形态发生蛋白的稳定过表达 的接受经转导的MSC的小鼠具有增加的骨密度（Kumar等人，2010)。在脊髓损伤的大鼠模型 中，稳定过表达脑源性神经营养因子的用MSC治疗的大鼠具有比施用单独的MSC更好的总 体结果（Sasaki等人，2009)。最近，在膀脫出口梗阻的大鼠模型中，具有肝细胞生长因子的 稳定过表达的接受经转导的MSC的大鼠在膀脫中具有减少的胶原累积（Song等人，2012)。 运些研究指示经修饰的MSC是用于蛋白质表达和递送的有用和可行的媒介物，W祀向各种 疾病和组织。
[0006] 由于其归巢至肿瘤微环境的先天性趋势，MSC已作为用于抗癌治疗剂的递送媒介 物进行研究，并且在（Loebinger和Janes, 2010)中充分综述。MSC也已通过IFNa或IFN丫 的表达用于促进致瘤细胞的细胞调亡（Li等人，2006 ;Ren等人，2008)。另外，MSC近期已 就肿瘤生成和转移的预防和抑制进行探究。通过Wei等人的研究检查了人乳头状瘤病毒 (HPV)永生化的MSC在其中施用转移性纤维肉瘤细胞的小鼠肿瘤模型中的使用，所述MSC表 达与经修饰的E7融合蛋白疫苗组合的HPV蛋白质E6/EWWei等人，2011)。运个团队发现仅 用E7表达MSC和经修饰的E7蛋白质疫苗两者进行免疫接种的小鼠显示了肿瘤生长中的减 少和E7特异性抗体应答。接受单独的MSC或蛋白质疫苗的小鼠不能产生抗E7应答或抑制 转移性肉瘤的肿瘤生长。尽管运些永生化的MSC先前确定为非致瘤的，但它们在小鼠中持 续长于21天，与在施用后仅极短时间可检测的原发性MSC巧日非永生化的)不同（6曰〇等人， 2001 ;Abr址am等人，2004;Ohtaki等人，2008 ;Prockop，2009)。因此，对于永生化的MSC的 使用在长期中可能存在无法预料的结果（即与内源MSC竞争中胜出和差异免疫调节能力， 其在该研究中未进行评价)，即使它们证明为非恶性的。其他研究已指出永生化的MSC可W 变成致瘤的，并且因此必须谨慎地进行研究W确定它们是否真正是使用安全的。移植的原 代非永生化的MSC在体内最多仅持续数天（Gao等人，2001 ;Ab;r址am等人，2004 ;化taki等 人，2008 !Prockop, 2009)。
[0007] 虽然MSC主要由于其免疫抑制特性而被吹捧，但几个公开的报道也已直接显示 MSC絕逆适应性免疫。在共同培养中，MSC在体外增强B细胞增殖、IL-6表达和IgG分泌性 浆细胞形成；运些B细胞应答可W用与TLR激动剂(脂多糖或CpGDNA)组合的MSC得到进 一步增强。用破伤风类毒素脉冲的MSC促进破伤风类毒素特异性CD4T细胞系的增殖和细 胞因子表达（比-4、比-IOJFN丫）。类似地，在抗原的存在下，与淋己细胞W低比率（1:100) 培养的MSC改善淋己细胞增殖和CD4化17子集形成，其是部分IL-6和TGFP依赖性的。 MSC也已发现表达MHC-I且交叉呈递抗原用于体外和体内的CD8T细胞扩增两者。
[0008] MSC免疫调节还已发现依赖于外部信号。在炎症细胞因子或刺激剂的存在下，先前 抑制性的MSC疗法可W变得免疫刺激的。例如，用特异性病原体相关分子模式（PAMP)分子 处理的MSC可W变得抗炎或促炎，取决于它们用其在体外进行处理的PAMP。在胶原诱发性 关节炎期间，炎性疾病背景、同种异体MSC的移植据报道增强Thl免疫应答和IL-6分泌，其 通过MSC的直接TNFa刺激在体外得到模拟。MSC的施用还据报道恶化胶原诱发性关节炎 疾病W及扩大的IL-6和IL-17脾细胞分泌。用IFN丫（在适度范围内）预处理MSC据报道 上调MHC-I和II表达且改善抗原吞隧作用和呈递能力，从而刺激CD4和CD8T细胞增殖， W及抗肿瘤CD8+细胞毒性T淋己细胞（CTL)的生成。
[0009] 疫苗通常是预防传染病的有效和成本效益的手段。疫苗已证实在根除一种破坏性 疾病天花的改革潜力，同时提供控制其他疾病包括白喉、脊髓灰质炎和麻疹的能力，所述疾 病W前引起广泛的发病率和死亡率。疫苗的开发设及测试减毒或灭活形式的病原体或者鉴 定引发免疫应答的病原体组分（即，亚基、类毒素和病毒样颗粒疫苗)，当接受者暴露于实际 病原体时，所述免疫应答保护他们免于疾病。在理想世界中，单一疫苗将能够祀向所有主要 人病原体(通用的)，引发针对运些病原体的强保护性免疫，而不诱导不必要的副作用，并且 仍是每剂量生产相当廉价的。在病毒或宿主细胞产生的蛋白质的情况下，模拟天然感染、包 括人翻译后加工的疫苗生产可能证明为优于细菌或其他表达系统。
[0010] 传统疫苗方法迄今未能提供针对HIV、肺结核、追疾和其他许多疾病包括登革热、 瘤疹且甚至普通感冒的保护。传统疫苗方法未能成功用于运些疾病的原因是复杂多样的。 例如，HIV将功能原病毒基因组整合到宿主细胞的DNA内，从而建立潜伏或持续性。一旦潜 伏/持续性建立，即使使用高度活跃的抗逆转录病毒疗法，也无法根除HIV。
[0011] 更新的替代免疫接种方法包括DNA和细胞疫苗两者。DNA疫苗设及在疫苗接种 的组织部位处用抗原编码质粒转染细胞，其允许局部细胞（即肌细胞）原位产生疫苗抗原。 细胞疫苗使用表达或呈递疫苗抗原的前脉冲或经转染的宿主抗原呈递细胞(例如树突状细 胞、DC)的直接转移。运些方法的优点是疫苗抗原在体内产生，并且可容易地用于免疫学加 工。尽管成功的临床前测试的众多报道，但运两种方法均遇到绛脚石。在人中的DNA疫苗接 种研究显示弱功效，其已与小鼠和人之间的先天性差异联系（Cavenau曲等人，2011;Wang 等人，2011)。DC疫苗接种策略已显示用于治疗性癌症疫苗接种的有限临床成功，并且由于 必要的个体定制而具有高生产成本（Bhargava等人，2012 ;Palucka和Banchereau, 2012)。 [0012] 关于目前的疫苗技术的进一步局限性在于开发针对给定病原体的疫苗中设及的 时间。运在暴露于新近出现的病原体W及有意或无意释放的病原体和毒素的情况下是特别 成问题的，其中需要用于快速保护化含有此类新出现的病原体和生物学威胁的手段。本文 描述的方法和附加型转染的MSC解决了运些需要。
[001引发明概述 本发明提供了免疫保护性原代间充质干细胞（IP-MSC)，其附加型表达特异性祀向病原 体(例如病毒、细菌或寄生虫的传染性物种）或毒素的多重免疫反应性多肤，W及制备和使 用IP-MSC的方法。IP-MSC用一种或多种附加型载体进行转染，所述附加型载体编码两种 或更多种(例如2至约100种)可表达的免疫反应性多肤(例如全长抗体、单链可变抗体片段 (ScFV)、F油或F(油'）2抗体片段、双抗体、S抗体等等)。任选地，IP-MSC可W表达一种 或多种其他免疫调节性多肤，例如细胞因子例如白细胞介素(例如比-2、比-4、比-6、比-7、 IL-9和IL-12)、干扰素(例如IFNa、IFNP或IFNco)等等，其可W增强抗原结合多肤中和 病原体或毒素的有效性。每种免疫反应性多肤含有来自或是中和抗体(例如来自暴露的受 试者的天然抗体）的抗原结合部分的氨基酸序列，所述中和抗体对于通过病原体产生的抗 原特异性或对于毒素特异性，或包含抗原结合区的变体的氨基酸序列，其包括在其氨基酸 序列中的一种或多种置换(例如保守置换)，并且优选与天然抗原结合区共享至少约50%的 序列同一性(例如至少约60、70、80、90或95%的序列同一性)。每种抗原结合区肤或其变体 排列且定向为特异性结合且中和病原体或毒素。
[0014] 在一些实施方案中，IP-MSC表达例如至少2、3、4、5或6免疫反应性多肤，例如最 高达约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100种免疫反应性多肤，其特异性祀向病原体或毒 素。例如，每种免疫反应性多肤可W特异性祀向且结合来自致病性生物的蛋白质或其片段 或者毒素(例如藍麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、炭痘毒素、肉毒杆菌毒素)，所述致病性生物的 蛋白质或其片段或者毒素可W通过生物原位产生或者可WW化学分离或纯化形式遇到。
[0015] IP-MSC可用于生成针对或治疗通过病原体的感染或暴露于毒素的被动免疫(例如 通过中和)。IP-MSC可W在药学可接受的载体(例如缓冲液，例如憐酸盐缓冲盐水，或适合于 维持活的经转染的原代MSC的任何其他缓冲材料)中提供，用作用于治疗或预防通过病原体 引起的传染病或改善毒素的有毒作用的药物组合物。在一些实施方案中，IP-MSC包含骨髓 衍生的MSC，而在一些其他实施方案中，IP-MSC包含脂肪MSC细胞、胎盘MSC细胞或厮带血 MSC细胞。
[0016] 本文描述的IP-MSC可特别用于针对病原体和毒素的至少部分的暂时被动保护， 因为原代MSC是低免疫原性细胞，其一般不被免疫系统祀向。因此，IP-MSC被经治疗的受 试者耐受，允许细胞存活足够的时间用于免疫反应性多肤表达、产生且释放，W结合且中和 受试者已暴露于或可能暴露于的致病性生物或毒素。另外，原代MSC-般在体内具有有限 的寿命，因此改善用MSC治疗的不期望有的长期副作用(例如致癌性)，所述长期副作用可W 是永生化MSC的问题。
[0017] 提供本发明的下述实施方案1-35,W进一步举例说明本发明的范围和各个方面。 运些实施方案作为本文描述的IP-MSC和方法的非限制性举例说明提供。
[0018] 实施方案1包括免疫保护性原代间充质干细胞（IP-MSC)，其附加型表达特异性祀 向病原体或毒素的多重免疫反应性多肤。IP-MSC用编码免疫反应性多肤的一种或多种附加 型载体进行转染。每种免疫反应性多肤包含来自中和抗体的抗原结合区的氨基酸序列，所 述中和抗体对于通过病原体产生的抗原特异性或对于毒素特异性，或抗原结合区序列的变 体的氨基酸序列，所述变体在其氨基酸序列中包含一种或多种置换，且与抗原结合区的序 列共享至少约50%的序列同一性；并且抗原结合区序列或其变体排列且定向为特异性结合 且中和病原体或毒素；并且其中所述附加型载体任选包括可诱导的细胞调亡基因。
[0019] 实施方案2包括实施方案1的IP-MSC，其中所述IP-MSC附加型表达2至约100种 免疫反应性多肤。
[0020] 实施方案3包括实施方案1或2的IP-MSC，其中所述IP-MSC还表达一种或多种其 他免疫调节试剂。
[0021] 实施方案4包括实施方案3的IP-MSC，其中所述一种或多种免疫调节试剂选自白 介素和干扰素。
[0022] 实施方案5包括实施方案3的IP-MSC，其中所述一种或多种免疫调节试剂选自 心2、比-4、比-6、比-7、比-9、比-12、IFNa、IFNP和IFNo。
[0023] 实施方案6包括实施方案1-5中任一项的IP-MSC，其中每种免疫反应性多肤选自 全长抗体、单链可变抗体片段（ScFV)、单价抗体抗原结合片段（Fab)、二价抗体抗原结合片 段（的F(油'）2)、双抗体