本发明属于微生物肥料领域，具体地说，涉及一种甲基营养型芽孢杆菌菌剂及其制备方法。
背景技术：
甲基营养型芽孢杆菌是一类嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，该菌广泛存在于自然界及植物根茎等内部器官中，安全无毒，且具有广谱的抗菌活性和极强的抗逆能力。近年来，国内学者对甲基营养型芽孢杆菌在植物生防、促生等方面应用研究较多，Munusamy Madhaiyan等人(Munusamy Madhaiyan,Selvaraj Poonguzhali,Soon-WoKwon,et al.Bacillus methylotrophicus sp.nov.,a methanol utilizing,plant-growth promoting bacterium isolated from rice rhizosphere siol[J].IJSEM,2010,60(10):2490-2495)从水稻根际土壤中分离筛选出一株甲基营养型芽孢杆菌，该菌不仅能促进水稻生长，而且也能抑制水稻青枯病的发生；周登博等人(周登博，井涛，谭昕等，6种基质拮抗菌发酵液对香蕉枯萎病及相关防御酶的影响[J]，热带作物学报，2013,34(5)：947-951)从土壤中分离的一株甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16，对香蕉枯萎病有显著的防治效果。吕倩等人(吕倩，胡江春，王楠等，南海深海甲基营养型芽孢杆菌SHB114抗真菌脂肽活性产物的研究[J]，中国生物防治学报，2014,30(1)：113-120)在南海深海分离出一株甲基型营养型芽孢杆菌，该菌对黄瓜炭疽病菌、立枯丝核菌、黄瓜枯萎病菌等具有较强的抑制作用。可见，甲基营养型芽孢杆菌在防治病害发生、促进作物生长，改善农产品品质等方面显示出广阔的应用前景。也正因如此，甲基营养型芽孢杆菌被越来越多的企业看中，作为生产生物菌剂的功能菌所用。
生物菌剂的主要成分是活的有益微生物，由于液体发酵液有效活菌数下降快、不易保存，且物流运输不方便，所以除生物叶面肥外，一般生物菌剂均经过合适的载体吸附后，制备成为粉剂菌剂或颗粒菌剂。但由于活菌保活对载体的特性有一定的要求，需要载体细度大，具有一定空隙，并含有一定的有机质，所以长久以来菌剂生产大多选择草炭作为吸附载体。随着生物菌剂产业的不断扩大，草炭的开采量逐年增加，对环境造成一定破坏的同时单价也在逐年提高，因此，选择合适的替代载体成为生物菌剂生产环节的迫切需求。秸秆含有丰富的N、P、K、有机质及其他中微量元素，且资源丰富、价格低廉、易得，适合作为菌剂载体。近年来，随着秸秆囤积量的增加及因秸秆焚烧带来的大气污染等问题的频繁出现，如何将秸秆资源化应用于生物菌剂生产中，这也成为生物肥料产业各界的关注热点。
目前，市场上销售的或专利中涉及到的甲基营养型芽孢杆菌菌剂，其吸附载体多为草炭，而草炭为不可再生资源，长期大量开采终有枯竭的时候。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种甲基营养型芽孢杆菌菌剂及其制备方法，该菌剂一方面调节作物微生物生态区系，改善作物品质，另一方面减少草炭使用量，降低废弃农作物秸秆囤积量，缓解因秸秆焚烧带来的环境污染等问题。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌菌剂，包括质量份的原料：草炭10～14份、农作物秸秆粉40～56份、矿物质13～20份，以草炭、农作物秸秆粉和矿物质的质量总量计，该甲基营养型芽孢杆菌菌剂还包括250-450mL/kg的甲基营养型芽孢杆菌发酵液。
进一步地，甲基营养型芽孢杆菌发酵液含有效活菌数大于或等于5.5×108/ml。
进一步地，甲基营养型芽孢杆菌发酵液通过以下步骤制备得到：
1.1)将保存在-4℃环境下的甲基营养型芽孢杆菌菌株接种至牛肉蛋白胨平板上30℃培养48h；挑取单菌落接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃培养24h后的液体即为所需接种液；
1.2)将步骤1.1)中的接种液接种于装有种子培养基的300L种子罐中，接菌量为10％，接菌后进行发酵；初始pH值6.9-7.1、温度28-35℃、转速180-220r/min；
1.3)当种子罐发酵9-10小时，菌体生长处于对数期，此时将种子罐中的发酵液加入到装有发酵培养基的3000L发酵罐中继续发酵，控制条件同种子罐，培养28-30小时，当菌体芽孢形成90-95％时，结束发酵，即得甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
其中，所述牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，琼脂15-20g，pH 7.2-7.6；
所述种子培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；
所述发酵培养基：玉米粉30.0g/L，豆饼粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0；
各培养基灭菌条件为：0.1-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
进一步地，农作物秸秆粉为木薯茎秆、甘蔗叶、菠萝茎叶、玉米秸秆、香蕉叶、荔枝枝叶、龙眼枝叶中的一种或几种的混合物经粉碎，并过80目筛后所得的秸秆粉。
进一步地，矿物质为沸石粉、蛭石粉、硅藻土、白炭黑、轻质碳酸钙中的一种或几种的混合物。
本发明还公开了一种甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
2)称量：按照质量百分比称量以下组分：草炭10～14份、农作物秸秆粉40～56份、矿物质13～20份，以草炭、农作物秸秆粉和矿物质的质量总量计，该甲基营养型芽孢杆菌菌剂还包括250-450mL/kg的甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
3)将称量好的草炭、甲基营养型芽孢杆菌发酵液倒入混拌机里进行吸附，混合均匀后，往混拌机中逐步添加农作物秸秆粉进行稀释混匀，最后加入矿物质，搅拌均匀后将物料进行粉碎，过100目筛，调整物料水分含量及pH值，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂。
进一步地，制备甲基营养型芽孢杆菌发酵液具体为：
1.1)将保存在-4℃环境下的甲基营养型芽孢杆菌菌株接种至牛肉蛋白胨平板上30℃培养48h；挑取单菌落接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃培养24h后的液体即为所需接种液；
1.2)将步骤1.1)中的接种液接种于装有种子培养基的300L种子罐中，接菌量为10％，接菌后进行发酵；初始pH值6.9-7.1、温度28-35℃、转速180-220r/min；
1.3)当种子罐发酵9-10小时，菌体生长处于对数期，此时将种子罐中的发酵液加入到装有发酵培养基的3000L发酵罐中继续发酵，控制条件同种子罐，培养28-30小时，当菌体芽孢形成90-95％时，结束发酵，即得甲基营养型芽孢杆菌发酵液。
进一步地，牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，琼脂15-20g，pH 7.2-7.6；所述种子培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO40.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；所述发酵培养基：玉米粉30.0g/L，豆饼粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0；各培养基灭菌条件为：0.1-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
进一步地，甲基营养型芽孢杆菌菌剂的水分含量少于或等于29％，pH为6.9～7.5。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明选用草炭和农作物秸秆粉为复合载体，且复合载体组成比例已进行菌种保存实验验证，菌种保质期大于12月，符合农用微生物菌剂国家标准GB 20287-2006。
从产品的组成上看出，如果不添加40％-56％农作物秸秆，则这部分量需要由草炭补充。本方法采用农作物秸秆和草炭作为载体，可以减少40-56％草炭使用量，因此，该复合载体既可以保证功能菌剂与草炭的吸附量，延长功能菌种的保存时间，又可以减少约50％的草炭使用量，
草炭市场价格约340元/吨，而农作物秸秆粉价格约100-200元/吨，用农作物秸秆粉替代部分草炭，故可降低产品成本，因此，本发明消纳了大量农作物秸秆，既保障了产品质量，降低了产品成本，又缓解了因秸秆焚烧带来的环境污染等问题。
2)本发明添加了甲基营养型芽孢杆菌，该菌对人畜无毒害，可调节作物微生物生态区系，改善作物品质，且对植物枯萎病害表现出较强的防治效果。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌菌剂，包括质量份的原料：草炭10～14份、农作物秸秆粉40～56份、矿物质13～20份，以草炭、农作物秸秆粉和矿物质的质量总量计，该甲基营养型芽孢杆菌菌剂还包括250-450mL/kg的甲基营养型芽孢杆菌发酵液。
其中，由于菌在保存过程中有效活菌数会逐渐下降，若甲基营养型芽孢杆菌发酵液添加量小，产品有效活菌数会达不到农用微生物菌剂的国家标准GB 20287-2006；若添加量大，则会增加产品成本。
本发明选用草炭和农作物秸秆粉为复合载体，若农作物秸秆粉含量高于草炭，不利于菌的存活，若农作物秸秆粉含量低于草炭，则达不到消纳农作物秸秆的目的。
矿物质的添加，一方面能够维持产品中菌的生存，另一方面增加产品中微量元素的含量，添加量太少不足以维持菌的存活，添加太多，会增加产品成本。
本发明还公开了一种甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备甲基营养型芽孢杆菌发酵液：
1.1)将保存在-4℃环境下的甲基营养型芽孢杆菌菌株接种至牛肉蛋白胨平板上30℃培养48h；挑取单菌落接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃培养24h后的液体即为所需接种液；其中，所述牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，琼脂15-20g，pH 7.2-7.6；
1.2)将步骤1.1)中的接种液接种于装有种子培养基的300L种子罐中，接菌量为10％，接菌后进行发酵；初始pH值6.9-7.1、温度28-35℃、转速180-220r/min；所述种子培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO40.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；其中，初始pH值、温度、转速在上述范围内提高发酵液中菌的有效活菌数量。
1.3)当种子罐发酵9-10小时，菌体生长处于对数期，此时将种子罐中的发酵液加入到装有发酵培养基的3000L发酵罐中继续发酵，控制条件同种子罐，培养28-30小时，当菌体芽孢形成90％-95％时，结束发酵，即得甲基营养型芽孢杆菌发酵液；所述发酵培养基：玉米粉30.0g/L，豆饼粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO40.5g/L，pH 7.0；
各培养基灭菌条件为：0.1-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
2)称量：按照质量百分比称量以下组分：草炭10～14份、农作物秸秆粉40～56份、矿物质13～20份，以草炭、农作物秸秆粉和矿物质的质量总量计，该甲基营养型芽孢杆菌菌剂还包括250-450mL/kg的甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
3)将称量好的草炭、甲基营养型芽孢杆菌发酵液倒入混拌机里进行吸附，混合均匀后，往混拌机中逐步添加农作物秸秆粉进行稀释混匀，最后加入矿物质，搅拌均匀后将物料进行粉碎，过100目筛，调整物料水分含量少于或等于29％，pH为6.9～7.5，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂。
实施例1
配方：甲基营养型芽孢杆菌发酵液200L、草炭120kg、甘蔗叶粉550kg、蛭石粉130kg。
制备方法：准确称取上述甲基营养型芽孢杆菌发酵液、草炭倒入混拌机里进行吸附，混合均匀后，再往混拌机中添加甘蔗叶粉逐步稀释混匀，最后加入蛭石粉，搅拌均匀后将物料进行粉碎，过100目筛，调整物料水分含量为28.6％，pH为7.0，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂。
所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液是通过以下方法制备得到的：
(1)将保存在-4℃环境下的甲基营养型芽孢杆菌菌株接种至牛肉蛋白胨平板上30℃培养48h。挑取单菌落接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃培养24h后即得接种液。所述牛肉膏蛋白胨培养基为牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，琼脂15-20g，pH 7.2-7.6；
(2)将上述培养好的接种液接种于装有种子培养基的300L种子罐中，接菌量为10％，接菌后进行发酵。种子培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；培养条件：初始pH值为7.0，温度为30℃，转速200r/min。
(3)当种子罐发酵9-10小时，菌体生长处于对数期，此时将种子罐中的发酵液加入到装有发酵培养基的3000L发酵罐中继续发酵，控制条件同种子罐，培养28-30小时，当菌体芽孢形成90-95％时，结束发酵，即得甲基营养型芽孢杆菌发酵液，此时有效活菌数为5.8×108/ml。所述发酵培养基为玉米粉30.0g/L，豆饼粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0。
各培养基灭菌条件为：0.1-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
实施例2
配方：甲基营养型芽孢杆菌发酵液300L、草炭100kg、甘蔗叶粉400kg、蛭石粉200kg。
制备方法：准确称取上述甲基营养型芽孢杆菌发酵液、草炭倒入混拌机里进行吸附，混合均匀后，再往混拌机中添加甘蔗叶粉逐步稀释混匀，最后加入蛭石粉，搅拌均匀后将物料进行粉碎，过100目筛，调整物料水分含量为28.6％，pH为7.5，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂。
所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液是通过以下方法制备得到的：
(1)将保存在-4℃环境下的甲基营养型芽孢杆菌菌株接种至牛肉蛋白胨平板上30℃培养48h。挑取单菌落接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃培养24h后即得接种液。所述牛肉膏蛋白胨培养基为牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，琼脂15-20g，pH 7.2-7.6；
(2)将上述培养好的接种液接种于装有种子培养基的300L种子罐中，接菌量为10％，接菌后进行发酵。种子培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；培养条件：初始pH值6.9、温度35℃、转速180r/min。
(3)当种子罐发酵9-10小时，菌体生长处于对数期，此时将种子罐中的发酵液加入到装有发酵培养基的3000L发酵罐中继续发酵，控制条件同种子罐，培养28-30小时，当菌体芽孢形成90-95％时，结束发酵，即得甲基营养型芽孢杆菌发酵液，此时有效活菌数为5.5×108/ml。所述发酵培养基为玉米粉30.0g/L，豆饼粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0。
各培养基灭菌条件为：0.1-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
实施例3
配方：甲基营养型芽孢杆菌发酵液300L、草炭140kg、甘蔗叶粉560kg、蛭石粉150kg。
制备方法：准确称取上述甲基营养型芽孢杆菌发酵液、草炭倒入混拌机里进行吸附，混合均匀后，再往混拌机中添加甘蔗叶粉逐步稀释混匀，最后加入蛭石粉，搅拌均匀后将物料进行粉碎，过100目筛，调整物料水分含量为29.2％，pH为7.3，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂。
所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液是通过以下方法制备得到的：
(1)将保存在-4℃环境下的甲基营养型芽孢杆菌菌株接种至牛肉蛋白胨平板上30℃培养48h。挑取单菌落接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃培养24h后即得接种液。所述牛肉膏蛋白胨培养基为牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，琼脂15-20g，pH 7.2-7.6；
(2)将上述培养好的接种液接种于装有种子培养基的300L种子罐中，接菌量为10％，接菌后进行发酵。种子培养基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；培养条件：初始pH值6.9-7.1、温度28-35℃、转速180-220r/min。
(3)当种子罐发酵9-10小时，菌体生长处于对数期，此时将种子罐中的发酵液加入到装有发酵培养基的3000L发酵罐中继续发酵，控制条件同种子罐，培养28-30小时，当菌体芽孢形成90-95％时，结束发酵，即得甲基营养型芽孢杆菌发酵液，此时有效活菌数为6.6×108/ml。所述发酵培养基为玉米粉30.0g/L，豆饼粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0。
各培养基灭菌条件为：0.1-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
实施例4
配方：甲基营养型芽孢杆菌发酵液450L、草炭150kg、甘蔗叶粉625kg、蛭石粉225kg。
制备方法：准确称取上述甲基营养型芽孢杆菌发酵液、草炭倒入混拌机里进行吸附，混合均匀后，再往混拌机中添加甘蔗叶粉逐步稀释混匀，最后加入蛭石粉，搅拌均匀后将物料进行粉碎，过100目筛，调整物料水分含量为29％，pH为6.9，即得甲基营养型芽孢杆菌菌剂。
所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液按实施例一方法制备得到，且有效活菌数为5.5×108/ml。
下面结合具体的实验方案对本发明的技术效果进行说明：
选取长势一致的3叶甜瓜幼苗移栽到盆钵中，移栽7天后，对甜瓜苗进行接菌处理。处理1：先接种枯萎病病原菌，隔1天再分别施入实施例1、2、3中制备的菌剂，标记为实施例1、实施例2、实施例3；处理2：先分别施入实施例1、2、3中制备的菌剂，隔1天再接种枯萎病病原菌，标记为实施例Ⅰ、实施例Ⅱ、实施例Ⅲ；对照处理：只接种枯萎病病原菌，标记为CK。每个处理10盆，每盆1株甜瓜苗。病原菌接种量均为107cfu/mL孢子悬浮液10ml，甲基营养型芽孢杆菌菌剂施用量菌为1g/盆。接菌7天之后，记录甜瓜发病情况，计算其病情指数及相对防治效果，统计结果见表1。
甜瓜枯萎病发病情况按标准划分为5级：0级：全株无病；1级：植株1/4以下叶面表现萎蔫症状；2级：植株1/4到1/2叶面表现萎蔫症状；3级：植株1/2以上叶面表现萎蔫症状：4级：全株萎蔫死亡。
病情指数＝[Σ(病级株数×病害级数)/(该处理盆栽苗总和×发病最重级的代表数值)]×100。
相对防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。
表1本发明甲基营养型芽孢杆菌菌剂对甜瓜枯萎病的防治效果
以上结果表明，先施入甲基营养型芽孢杆菌菌剂后接病原菌处理的甜瓜病情指数要小于先接病原菌后施入菌剂的处理，说明在一定程度上甲基营养型芽孢杆菌菌剂对甜瓜枯萎病的发生有一定的预防作用。另外，不管是先病原菌之前或是之后施入菌剂，均高于对照防治效果。可见，本发明的甲基营养型芽孢杆菌菌剂对甜瓜枯萎病有一定的预防及防治效果。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。