用作丙型肝炎病毒ns3-丝氨酸蛋白酶抑制剂的新型肽的制作方法

专利名称：用作丙型肝炎病毒ns3-丝氨酸蛋白酶抑制剂的新型肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的丙型肝炎病毒(“HCV”)蛋白酶抑制剂、包含一种或多种所述抑制剂的药用组合物、制备所述抑制剂的方法和使用所述抑制剂治疗丙型肝炎和相关疾病的方法。本发明特别公开用作HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的新的肽化合物。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)为一种(+)-有义单链RNA病毒，它为非甲非乙型肝炎(NANBH)的主要病原体，尤其是血液相关性NANBH(BB-NANBH)(参见国际专利申请公布号WO 89/04669和欧洲专利申请公布号EP 381 216)。NANBH不同于其它类型的病毒诱导性肝疾病，例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丁型(δ)肝炎病毒(HDV)、巨细胞病毒(CMV)和埃-巴二氏病毒(EBV)、以及不同于其它形式的肝疾病，例如酒精中毒性肝疾病和原发性胆汁性肝硬化。
最近，已经鉴定、克隆和表达出了多肽加工和病毒复制所必需的HCV蛋白酶(参见例如美国专利号5,712,145)。这种约3000个氨基酸的多蛋白自氨基末端至羧基末端包含核壳蛋白(C)、包膜蛋白(E1和E2)以及几种非结构蛋白(NS1、2、3、4a、5a和5b)。NS3为约68kda的蛋白，由HCV基因组约1893个核苷酸编码，并且具有2个不同的结构域(a)由约200个N-末端氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶结构域；和(b)蛋白C-末端RNA依赖性ATP酶结构域。由于蛋白质序列、整体三维结构和催化机制的相似性，认为NS3蛋白酶是胰凝乳蛋白酶家族的一个成员。其它胰凝乳蛋白酶样酶有弹性蛋白酶、Xa因子、凝血酶、胰蛋白酶、纤溶酶、尿激酶、tPA和PSA。HCV NS3丝氨酸蛋白酶与所述多肽(多蛋白)于NS3/NS4a、NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接点水解有关，因此在病毒复制期间负责生成四种病毒蛋白。这使HCV NS3丝氨酸蛋白酶成为抗病毒化学治疗的令人关注的目标。
已经确定约6kda多肽的NS4a蛋白是NS3丝氨酸蛋白酶活性的辅因子。NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶对NS3/NS4a接点的自动裂解在分子内(即顺式)进行，而其它的裂解位点在分子间(即反式)进行。
对HCV蛋白酶的天然裂解位点的分析揭示，P1存在半胱氨酸和P1’存在丝氨酸，并且这些残基在NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接点中是严格保守的。NS3/NS4a接点包含P1的苏氨酸和P1’的丝氨酸。推定NS3/NS4a上的半胱氨酸→Thr取代解释该接点需要顺式而不是反式加工。参见例如Pizzi等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)91888-892，Failla等(1996)Folding & Design 135-42。NS3/NS4a裂解位点也比其它位点更耐受诱变。参见例如Kollykhalov等(1994)J.Virol.687525-7533。还发现，裂解位点上游区的酸性残基是有效裂解所需要的。参见例如Komoda等(1994)J.Virol.687351-7357。
已报道的HCV蛋白酶抑制剂包括抗氧化剂(参见国际专利申请公布号WO 98/14181)、某些肽类和肽类似物(参见国际专利申请公布号WO 98/17679，Landro等(1997)Biochem.369340-9348，Ingallinella等(1998)Biochem.378906-8914，Llinàs-Brunet等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.81713-1718)、基于70-氨基酸多肽水蛭蛋白酶抑制剂c的抑制剂(Martin等(1998)Biochem.3711459-11468，选自人胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂(hPSTI-C3)和小体所有组成成分(MBip)的抑制剂亲和性(Dimasi等(1997)J.Virol，717461-7469)，cVHE2(“camelized”可变结构域抗体片段)(Martin等(1997)Protein.Eng.10607-614)和α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)(Elzouki等)(1997)J.Hepat.2742-28)。最近公开了设计用来选择性破坏丙型肝炎病毒RNA的核酶(参见BioWorldToday9(217)4(1998年11月10日))。
另外参见1998年4月30日公开的PCT公布号WO 98/17679(Vertex Pharmaceuyticals Incorporated)、1998年5月28日公开的WO98/22496(F.Hoffmann-La Roche AG)和1999年2月18日公开的WO99/07734(Boehringer Ingelheim Canada Ltd)。
HCV与肝硬化有关，而且诱发肝细胞癌。目前HCV感染患者的预后很差。由于缺乏免疫性或者与HCV感染有关的豁免性(remission)，HCV感染比起其它形式的肝炎更难以治疗。目前的资料表明，肝硬化诊断后四年的存活率小于50％。诊断为患有局灶性可切除性肝细胞癌的患者的五年存活率为10-30％，而局灶性不可切除性肝细胞癌的患者的五年存活率小于1％。
参见A.Marchett等Synlett，S1，1000-1002(1999)，它介绍了HCVNS3蛋白酶抑制剂的二环类似物的合成，其中所公开的化合物的结构式如下 另参见W.Han等Bioorganic & medicinal Chem.Lett，(2000)10，711-713，它介绍了某些包含烯丙基和乙基官能团的α-酮酰胺类、α-酮酯类以及α-二酮类的制备。
另参见WO 00/09558(受让人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公开)，它公开了下式的肽衍生物 其中各单元在其文中作了定义。该系列的示例性化合物为
另参见WO 00/09543(受让人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公开)，它公开了下式的肽衍生物 其中各种单元在其文中作了定义。该系列的示例性化合物为 丙型肝炎的当前疗法包括干扰素-α(INFα)以及使用利巴韦林和干扰素的联合疗法。参见例如Beremguer等(1998)Proc.Assoc.Am.Physicians110(2)98-112。这些疗法存在低持续应答率并时常发生副作用的缺陷。参见例如Hoofnagle等(1997)N.Engl.J.Med.336347。目前，没有疫苗可用于HCV感染。
等待批准以及共同等待批准的美国专利申请序列号60/194,607(2000年4月5日申请)、序列号60/198,204(2000年4月19日申请)、序列号60/220,110(2000年7月21日申请)、序列号60/220,109(2000年7月21日申请)、序列号60/220,107(2000年7月21日申请)、序列号60/254,869(2000年11月12日申请)以及序列号60/220,101(2000年7月21日申请)，它们公开了作为丙型肝炎病毒NS-3丝氨酸蛋白酶抑制剂的各种类型肽和/或其它化合物。
HCV感染需要新的治疗药物及治疗方法。因此，本发明一个目的是提供有效治疗、预防或改善丙型肝炎的一种或多种症状的化合物。
本发明的另一目的是提供治疗、预防或改善丙型肝炎的一种或多种症状的方法。
本发明再一目的是提供使用本发明化合物调节丝氨酸蛋白酶活性、特别是HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶活性的方法。
本发明又一目的是提供使用本发明化合物调节HCV多肽加工的方法。
发明概述在许多实施方案中，本发明提供HCV蛋白酶的一类新型抑制剂、包含一种或多种化合物的药用组合物、包含一种或多种所述化合物的药物制剂的制备方法以及治疗、预防或者改善丙型肝炎的一种或多种症状的方法。还提供调节HCV多肽与HCV蛋白酶相互作用的方法。本发明提供的化合物中，优选抑制HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶活性的化合物。本申请公开一种化合物，包括所述化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、外消旋体和前体药物，以及所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化合物具有下式I的通用结构 式I其中Y选自以下部分烷基、烷基-芳基、杂烷基、杂芳基、芳基-杂芳基、烷基-杂芳基、环烷基、烷氧基、烷基-芳氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂环烷氧基、环烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、环烷基氨基和杂环烷基氨基，前提是Y可以任选被X11或X12取代；X11为烷基、链烯基、链炔基、环烷基、环烷基-烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂芳基、烷基杂芳基或杂芳基烷基，前提是X11还可以任选被X12取代；X12为羟基、烷氧基、芳氧基、硫代基、烷硫基、芳硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰氨基、芳基亚磺酰氨基、羧基、烷氧羰基、酰胺基、烷氧羰基氨基、烷氧羰基氧基、烷基脲基、芳基脲基、卤素、氰基或硝基，前提是所述烷基、烷氧基和芳基还可以任选被独立选自X12的部分取代；R1为COR5或B(OR)2，其中R5为H、OH、OR8、NR9R10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6或COR7，其中R7为H、OH、OR8、CHR9R10或NR9R10，其中R6、R8、R9和R10独立选自以下基团H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、环烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、[CH(R1’)]pCOOR11、[CH(R1’)]pCONR12R13、[CH(R1’)]pSO2R11、[CH(R1’)]pCOR11、[CH(R1’)]pCH(OH)R11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH((R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’独立选自以下基团H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、芳基-烷基和杂芳烷基；Z选自O、N、CH或CR；W可以存在或者不存在，当W存在时，W选自C＝O、C＝S、C(＝N-CN)或SO2；Q可以存在或者不存在，当Q存在时，Q为CH、N、P、(CH2)p、(CHR)p、(CRR’)p、O、NR、S或SO2；当Q不存在时，M可以存在或不存在；当Q和M不存在时，A直接连结到L；A为O、CH2、(CHR)p、(CHR-CHR’)p、(CRR’)p、NR、S、SO2或化学键；E为CH、N、CR或朝向A、L或G的双键；G可以存在或不存在，当G存在时，G为(CH2)p、(CHR)p或(CRR’)p；当G不存在时，则J存在并且E直接连结到G连结的式I碳原子上；J可以存在或不存在，当J存在时，J为(CH2)p、(CHR)p或(CRR’)p、SO2、NH、NR或O；当J不存在时，则G存在并且E直接连结到J连结的式I所示氮原子上；L可以存在或不存在，当L存在时，L为CH、CR、O、S或NR；当L不存在时，则M可以存在或不存在；当M存在而L不存在时，则M直接独立连结到E，并且J直接独立连结到E；M可以存在或不存在，当M存在时，M为O、NR、S、SO2、(CH2)p、(CHR)p(CHR-CHR’)p或(CRR’)p；p为数字0-6；R、R’、R2、R3和R4独立选自以下基团H；C1-C10烷基；C2-C10链烯基；C3-C8环烷基；C3-C8杂环烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、卤素；(环烷基)烷基和(杂环烷基)烷基，其中所述环烷基由3-8个碳原子和0-6个氧、氮、硫或磷原子组成，并且所述烷基具有1-6个碳原子；芳基；杂芳基；烷基-芳基；以及烷基-杂芳基；其中所述烷基、杂烷基、链烯基、杂链烯基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基部分可任选进行化学上适当的取代，所述术语“取代”指任选并且化学上适当的被1个或多个选自以下的部分取代烷基、链烯基、链炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环基、卤素、羟基、硫代基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、亚磺酰氨基、亚砜、砜、磺酰脲、酰肼和异羟肟酸酯。
进一步，其中所述N-C-G-E-L-J-N单元为五元或六元环结构，前提是当所述N-C-G-E-L-J-N单元为五元环结构，或当式I中包括N、C、G、E、L、J、N、A、Q和M的双环结构为五元环结构时，则所述五元环结构没有羰基作为环的一部分。
在式I各部分的上述定义中，各部分的优选基团如下R1的优选定义为COR5，其中R5为H、OH、COOR8或CONR9R10，其中R8、R9和R10的定义同上。R1的更优选部分为COCONR9R10，其中R9为H，R10为H、R14、[CH(R1’)]pCOOR11、[CH(R1’)]pCONR12R13、[CH(R1’)]pSO2R11、[CH(R1’)]pSO2NR12R13、[CH(R1’)]pCOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R14为H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、芳基-烷基、链烯基、链炔基或杂芳烷基。在上述R10基团中，R10优选部分为H、R14、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CH(R1’)SO2R11、CH(R1’)CH(R1’)SO2NR12R13、CH(R1’)CH(R1’)COR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R1’为H或烷基，R2’为苯基、取代的苯基、杂原子-取代的苯基、苯硫基、环烷基、哌啶基或吡啶基。
更优选部分为R1’为H，R11为H、甲基、乙基、烯丙基、叔丁基、苄基、α-甲基苄基、α，α-二甲基苄基、1-甲基环丙基或1-甲基环戊基；R’更优选部分为羟甲基或CH2CONR12R13，其中
NR12R13选自以下基团 和 其中U6为H、OH或CH2OH；R14优选自以下基团H、Me、Et、正丙基、甲氧基、环丙基、正丁基、1-丁-3-炔基、苄基、α-甲基苄基、苯乙基、烯丙基、1-丁-3-烯基、OMe、环丙基甲基；
R2’优选独立选自以下的基团 其中U1和U2可以相同或不同并且选自以下基团H、F、CH2COOH、CH2COOMe、CH2CONH2、CH2CONHMe、CH2CONMe2、叠氮基、氨基、羟基、取代的氨基、取代的羟基；U3和U4可以相同或不同并且选自O和S；U5选自以下部分烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂烷基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂烷基羰基、杂芳基羰基、烷氧羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基或其组合；
R2优选部分为

R3优选部分为
其中R31＝OH或O-烷基；
Y19选自以下部分 Y20选自以下部分
R3的最优选部分为 一些其它优选部分为Z为N，R4为H，W为C＝O。此外，R4不存在时，式I中Z-C-R3部分可以为以下结构 和
Y的优选部分为



其中Y11选自H、COOH、COOEt、OMe、Ph、OPh、NHMe、NHAc、NHPh、CH(Me)2、1-三唑基、1-咪唑基和NHCH2COOH；Y12选自H、COOH、COOMe、OMe、F、Cl或Br；Y13选自以下部分
Y14选自MeSO2、Ac、Boc、iBoc、Cbz或Alloc；Y15和Y16独立选自烷基、芳基、杂烷基和杂芳基；Y17为CF3、NO2、CONH2、OH、COOCH3、OCH3、OC6H5、C6H5、COC6H5、NH2或COOH；Y18为COOCH3、NO2、N(CH3)2、F、OCH3、CH2COOH、COOH、SO2NH2或NHCOCH3。
Y可以更优选为

其中Y17＝CF3、NO2、CONH2、OH、NH2或COOH；
Y18＝F、COOH；Y的更加优选部分为
式I所示的以下单元 为环结构，它可以为五元或六元环结构。但此环为五元环时，本发明要求五元环不包含羰基基团作为环结构的一部分。优选五元环结构为 其中R和R’定义同上。优选的五元环结构为
其中R20选自以下部分 此外，所述五元环与其相邻的两个环外羰基一起可以表示如下
本发明情况下，R21和R22可以相同或不同并且独立选自以下部分
以下五元环结构
的一些优选实例如下
此外，式中的以下单元 可以表示为以下结构b和c b的优选定义为
在c中，G和J独立选自以下基团(CH2)p、(CHR)p、(CHR-CHR’)p和(CRR’)p；A和M独立选自以下基团O、S、SO2、NR、(CH2)p、(CHR)p、(CHR-CHR’)p和(CRR’)p；Q为CH2、CHR、CRR’、NH、NR、O、S、SO2、NR、(CH2)p、(CHR)p和(CRR’)p。
c的优选定义为

当环结构如下图示时 其最优选的实例如下

以下单元 的一些更优选部分为
除非另有定义，否则本发明使用的所有科技术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。因此，例如术语烷基(包括烷氧基的烷基部分)指由具有1-8个，优选1-6个碳原子的直链或支链饱和烃除去一个原子后获得的单价基团；芳基-表示具有6-14个碳原子且具有至少1个苯型环的碳环基团，碳环基团的所有可取代的芳香族碳原子均可作为连接点。优选芳基包括苯基、1-萘基、2-萘基和茚满基，尤其是苯基和取代的苯基；芳烷基-表示含有芳基并通过低级烷基连接的部分；烷基芳基-表示含有低级烷基并通过芳基连接的部分；环烷基-表示具有3-8个，优选5个或6个碳原子的饱和碳环，其任选被取代；杂环-表示(除以下定义的杂芳基以外)具有至少1个插入碳环结构(由1个环或者2个稠环组成，其中每个环为5元、6元或7元环且可具有或者不具有不含离域pi电子的双键)的O、S和/或N原子的饱和及不饱和环状有机基团，其环结构具有2-8个、优选3-6个碳原子，例如2-或3-哌啶基、2-或3-哌嗪基、2-或3-吗啉基、或者2-或3-硫代吗啉基；卤素-表示氟、氯、溴和碘；杂芳基-表示具有至少1个插入碳环结构的O、S和/或N原子且具有足够数量的离域pi电子以提供芳族性质的环状有机基团，其中芳族杂环具有2-14个、优选4或5个碳原子，例如2-、3-或4-吡啶基，2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、2-、4-或5-噻唑基、2-或4-咪唑基、2-、4-或5-嘧啶基、2-吡嗪基、或者3-或4-哒嗪基等。优选杂芳基为2-、3-和4-吡啶基；所述杂芳基也可被任选取代。此外，如上所述，除有特别定义，术语“取代或未取代(的)”或“任选取代(的)”是指相关部分任选被属于R12或R13的部分进行化学上适当的取代。本发明使用的“前体药物”为药物前体化合物，它在给予患者后在体内通过一些化学或生理过程(例如前体药物在生理pH或酶作用下转换成需要的药物形式)释放出药物。
本发明还包括式I化合物及其前体药物的互变异构体、旋转异构体、对映异构体和其它旋光异构体，及其药学上可接受的盐、溶剂化物和衍生物。
本发明的又一特征是包含作为活性成分的式I化合物(或其盐、溶剂化物或异构体)和药学上可接受的载体或赋形剂的药用组合物。
本发明还提供制备式I化合物的方法以及治疗诸如HCV、AIDS(获得性免疫缺陷综合症)的疾病及相关疾病的方法。所述治疗方法包括给予患有一种或多种所述疾病的患者治疗有效量的式I化合物或者包含式I化合物的药用组合物。
还公开了式I化合物在制备治疗HCV、AIDS和相关疾病的药物中的用途。
还公开了治疗丙型肝炎病毒相关性疾病的方法，该方法包括给予有效量的一种或多种本发明化合物。
还公开了调节丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性的方法，该方法包括使HCV蛋白酶与一种或多种本发明化合物接触。
还公开了治疗、预防或改善丙型肝炎的一种或多种症状的方法，该方法包括给予有效量的一种或多种本发明化合物。HCV蛋白酶为NS3或NS4a蛋白酶。本发明化合物抑制所述蛋白酶。它们还调节丙型肝炎(HCV)多肽的加工。
优选实施方案的详细描述在一个实施方案中，本发明公开了作为HCV蛋白酶抑制剂、尤其是HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的式I化合物或其药学上可接受的衍生物，其各种定义见上文。
具有优良的HCV蛋白酶抑制活性的本发明代表性化合物与它们的活性一并列于下表1-5(Ki*值范围为纳摩尔，nM)。几个化合物以及补充的化合物另外在权利要求中公开。
表1化合物和HCV蛋白酶连续检测结果
HCV连续检测的Ki*范围类别A＝1-100nM；类别B＝101-1000nM；类别C＞1000nM。
一些类型的本发明化合物以及合成不同类型的本发明式I化合物的方法列于下面，接着用示意图说明，之后是示例性的实施例。
(R＝叔丁基，X＝NH2)(R＝异丁基，X＝NH2)(R＝叔丁基，X＝OH)(R＝三氯乙基，X＝OH) (X＝OtBu) (X＝OH)(X＝OH) (X＝OtBu)(X＝NH2)(X＝NHMe)(X＝NMe2)
(X＝NH2)(X＝NMe2)(X＝NHMe)(X＝OH)(X＝OtBu)(X＝OH)(X＝NH2)(X＝NMe2) (X＝OtBu)(R＝叔丁基)(X＝OH) (R＝异丁基)(X＝NH2)(X＝NMe2)(X＝NMeOMe)
(X＝Me，Y＝CH2Me)(X＝OAc，Y＝Me)

































根据它们的结构，本发明化合物可与有机酸或无机酸、或者有机碱或无机碱形成药学上可接受的盐。用于此类盐形成的合适的酸的实例为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、丙二酸、水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、甲磺酸和本领域技术人员熟知的其它的矿物酸以及羧酸类。对于与碱形成盐的合适碱为例如NaOH、KOH、NH4OH、氢氧化四烷基铵等。
在另一实施方案中，本发明提供包含作为活性成分的本发明肽的药用组合物。药用组合物通常还包含药学上可接受的载体稀释剂、赋形剂或载体(本发明统称为载体材料)。由于它们的HCV抑制活性，所述药用组合物具有治疗丙型肝炎和相关疾病的用途。
在另一实施方案中，本发明公开了制备包含作为活性成分的本发明化合物的药用组合物的方法。在本发明的药用组合物和方法中，活性成分一般以与适合的载体材料的混合物给药，根据需要的给药形式适当地选择载体材料，即口服片剂、胶囊剂(固体填充、半固体填充或液体填充)、使用时配制用粉剂、口服凝胶剂、酏剂、可分散颗粒剂、糖浆剂、混悬剂等，并且符合常规制药实践。举例来说，对于以片剂或胶囊剂形式口服给药，活性药物成分可与任何口服非毒性的药学上可接受的惰性载体组合，例如乳糖、淀粉、蔗糖、纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、滑石粉、甘露糖醇、乙醇(液体形式)等。此外，当要求或者需要时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺和到混合物中。粉剂和片剂也可包含约5-95％的本发明组分。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖、玉米甜味剂、天然及合成树胶如阿拉伯树胶、藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡。可用于上述剂型的润滑剂实例有硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、瓜尔胶等。
合适的情况下也可包含甜味剂、增香剂和防腐剂。下面更详细地讨论以上提及的一些术语，即崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂等。
另外，本发明的组合物可配制成持续释放形式，从而控制任何一种或者多种成分或活性成分的释放速率以达到最优化的治疗效果即HCV抑制活性等。持续释放的合适剂型包括多层片剂，它包含多层不同崩解速率或者控释聚合物基质，活性成分浸渍在聚合物基质中，加工成片剂形式，或者包含所述浸渍或囊化多孔聚合物基质的胶囊剂。
液态制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂。可列举的实例有用于肠胃外注射的水溶液剂或者水-丙二醇溶液剂或者加入甜味剂和遮光剂(pacifiers)的口服溶液剂、混悬剂和乳剂。液态制剂还可包括鼻内给药的溶液剂。
适于吸入的气雾制剂可包括溶液剂和粉末形式的固体，它们可以与药学上可接受的载体例如惰性压缩气体(如氮气)联合应用。
制备栓剂时，首先熔融低熔点的蜡，例如脂肪酸甘油酯(如可可脂)的混合物，并且通过搅拌或者类似的混合使活性成分均匀分散于其中。然后将熔融的均匀混合物倾入到适当大小的模具中，使之冷却并由此固化。
也包括这样的固态制剂可在临用前配制成口服或肠胃外给药的液态制剂。所述液态制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂。
本发明化合物也可经皮给药。经皮给药的组合物可采用乳膏、洗剂、气雾剂和/或乳剂形式，并且作为用于此目的的本领域常规技术，所述组合物可包含在基质型或者贮库型贴剂中。
本发明化合物优选口服、静脉内或皮下给药。
药用制剂优选单位剂型。在所述剂型中，制剂细分为包含适量活性成分的适当大小的单位剂量，例如包含达到所需目的的有效量。
根据特定的应用，单位剂量制剂中的本发明活性成分剂量通常可以不同或调整，从约1.0毫克到约1,000毫克，优选从约1.0到约950毫克，更优选从约1.0到约500毫克，一般为约1到约250毫克。实际使用剂量可根据患者的年龄、性别、体重以及所治疗的病情严重程度而变化。所述技术是本领域的熟练技术人员众所周知的。
通常，包含活性成分的用于人的口服剂型可以每天给药1次或2次。给药量和给药频率需要根据主治医师的判断调节。口服给药的一般推荐日剂量范围从约1.0毫克/天到1,000毫克/天，可以一次或分次给药。
一些有用的术语说明如下胶囊剂-指特殊容器或者包封物，它们由甲基纤维素、聚乙烯醇、或变性明胶或淀粉制成用于保持或容纳包含活性成分的组合物。硬壳胶囊一般由相对高强度的明胶骨架和猪皮明胶的掺合物制成。胶囊本身可包含少量染料、不透明剂、增塑剂和防腐剂。
片剂-指包含活性成分及合适稀释剂的压缩或模压固体剂型。通过压缩混合物或经湿法制粒、干法制粒或压缩获得的颗粒制备片剂。
口服凝胶剂-指活性成分分散于或溶于亲水性半固体基质中。
使用时配制用粉剂指包含活性成分和合适稀释剂的粉末掺合物，它可用水或果汁混悬。
稀释剂-指通常构成组合物或者剂型的主要部分的物质。合适的稀释剂包括糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇；从小麦、玉米、大米和马铃薯获得的淀粉；以及纤维素，例如微晶纤维素。组合物中稀释剂含量占总组合物的重量百分比从约10％到约90％，优选约25％到约75％，更优选约30％到约60％，更优选约12％到约60％。
崩解剂-指加入到组合物中以便促使其分开(崩解)并释放出药物的物质。合适的崩解剂包括淀粉；“冷水可溶性”改性淀粉，例如羧甲基钠淀粉；天然和合成树胶类，如槐树豆胶、卡拉牙胶、瓜尔胶、黄蓍胶和琼脂；纤维素衍生物，如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；微晶纤维素和交联微晶纤维素如交联羧甲基纤维素钠；藻酸盐如藻酸和藻酸钠；粘土如膨润土；以及泡腾混合物。组合物中崩解剂含量占组合物的重量百分比从约2％到约15％，更优选约4％到约10％。
粘合剂-指使粉末粘合或者“胶着”在一起并使它们粘聚形成颗粒的物质，因此在配制中用作“胶粘剂”。粘合剂增加稀释剂或增量剂已有的粘性强度。合适的粘合剂包括糖类如蔗糖；从小麦、玉米、大米和马铃薯获得的淀粉；天然树胶类如阿拉伯树胶、明胶和黄蓍胶；海藻衍生物如藻酸、藻酸钠和藻酸钙铵；纤维素材料如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠和羟基丙基甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；以及无机物例如硅酸镁铝。组合物中粘合剂含量可占组合物的重量百分比从约2％到约20％，更优选从约3％到约10％，更优选从约3％到约6％。
润滑剂-指加入到剂型中以便在其被压制后通过减少摩擦或磨损使片剂、颗粒剂等自模具或者冲模中脱出的物质。合适的润滑剂包括金属硬脂酸盐如硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸钾；硬脂酸；高熔点蜡；以及水溶性润滑剂，例如氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠、油酸钠、聚乙二醇和d’1-亮氨酸。润滑剂通常在压制前的最后步骤加入，因为它们必须存在于颗粒的表面并介于颗粒与压片机组件之间。组合物中润滑剂含量可占组合物重量百分比从约0.2％到约5％，优选约0.5％到约2％，更优选从约0.3％到约1.5％。
助流剂(glident)-防止结块并改善颗粒的流动性以使流动平滑均匀的物质。合适的助流剂包括二氧化硅和滑石粉。组合物中助流剂含量可占组合物的总重量百分比从约0.1％到约5％，优选从约0.5％到约2％。
着色剂-使组合物或者剂型着色的赋形剂。所述赋形剂可包括食品级染料和吸附到合适吸附剂(例如粘土或氧化铝)上的食品级染料。着色剂含量可占组合物的重量百分比从约0.1％到约5％，优选从约0.1％到约1％。
生物利用度-指与标准物或者对照物相比，给药剂型的活性药物成分或者治疗部分吸收进入体循环的速率和程度。
制备片剂的常规方法是人们已知的。所述方法包括干法例如直接压缩和压制紧压生产的颗粒，或者湿法或其它特殊方法。制备其它给药形式例如胶囊剂、栓剂等的常规方法也是人们熟知的。
本发明的另一个实施方案公开了上文公开的药用组合物在治疗疾病例如丙型肝炎等中的用途。该方法包括给予患有一种或多种这种疾病并需要这种治疗的患者治疗有效量的本发明药用组合物。
在另一实施方案中，本发明化合物可以用于治疗人类HCV，其治疗模式可以是单一疗法或联合疗法(例如双重联合、三重联合等)，例如联合应用抗病毒剂和/或免疫调节剂。所述抗病毒剂和/或免疫调节剂实例包括利巴韦林(Schering-Plough Corporation，Madison，NewJersey)和LevovirinTM(ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，California)、VP50406TM(Viropharma，Incorporated，Exton，Pennsylvania)、ISIS 14803TM(ISIS Pharmaceuticals，Carlsbad，California)、HeptazymeTM(RibozymePharmaceuticals，Boulder，Colorado)、VX 497TM(Vertex Pharmaceuticals，Cambridge，Massachusetts)、ThymosinTM(SciClone Pharmaceuticals，SanMateo，California)、MaxamineTM(Maxim Pharmaceuticals，San Diego，California)、霉酚酸莫非替克(Hoffman-LaRoche，Nutley，New Jersey)、干扰素(例如干扰素α，聚乙二醇-干扰素α缀合物)等。“聚乙二醇-干扰素α缀合物”为共价连结的干扰素α分子和聚乙二醇分子。聚乙二醇-干扰素α缀合物的实例包括干扰素α-2a(RoferonTM，HoffmanLa-Roche，Nutley，New Jersey)(其形式为聚乙二醇化干扰素α-2a(例如以商品名PegasysTM出售))、干扰素α-2b(IntronTM，Schering-PloughCorporation)(其为聚乙二醇化干扰素α-2b形式(例如以商品名PEG-IntronTM出售))、干扰素α-2c(Berofor AlphaTM，Boehringer Ingelheim，Ingelheim，Germany)或通过测定天然干扰素α的共有序列定义的共有干扰素(InfergenTM，Amgen，Thousand Oaks，California)。
如前所述，本发明还包括本发明化合物的互变异构体、旋转异构体、对映异构体和其它立体异构体。因此，本领域技术人员知道，本发明的一些化合物可能存在适当的异构体形式。这样的变化形式考虑在本发明范围内。
本发明另一个实施方案公开了本发明公开的化合物的制备方法。所述化合物可通过本领域已知的几种技术制备。代表性的示例方法在以下反应流程中概述。应当理解，虽然以下的示例性流程介绍了少量代表性本发明化合物的制备，但是适当替代任何天然及非天然氨基酸将会形成基于所述替代的所需化合物。这样的变化已考虑在本发明范围内。
在以下流程、制备和实施例的说明中所使用的缩写如下THF四氢呋喃DMFN，N-二甲基甲酰胺EtOAc乙酸乙酯AcOH乙酸HOOBt3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮EDCl1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐NMMN-甲基吗啉ADDP1，1’-(偶氮二羰基(azodicarbobyl))二哌啶DEAD二乙基偶氮二羧酸酯MeOH甲醇EtOH乙醇Et2O乙醚DMSO二甲基亚砜HOBtN-羟基苯并三唑PyBrOP溴-三-吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐
DCM二氯甲烷DCC1，3-二环己基碳二亚胺TEMPO2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基Phg苯基甘氨酸Chg环己基甘氨酸Bn苄基Bzl苄基Et乙基Ph苯基iBoc异叔丁氧基羰基iPr异丙基tBu或But叔丁基Boc叔丁氧基羰基Cbz苄氧基羰基Cp环戊二烯基Ts对甲苯磺酰基Me甲基HATUO-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐Bop苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)六氟磷酸酯一般制备流程以下流程介绍中间体单元的合成方法
流程1
流程2
流程4
流程5
流程7
流程8 其中R＝ 和
流程9 其中R＝ 和
流程10
流程11
流程12 流程13
流程14
流程16 流程17

流程18 流程19 流程20
制备中间体制备实施例1步骤A化合物(1.1) 将化合物(1.08)(3.00g，12.0mmol；(S.L.Harbeson等J.Med.Chem.；37(18)1994；2918-2929；)的DMF(15mL)和CH2Cl2(15mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOOBt(1.97g，12.0mmol)、N-甲基吗啉(4.0mL，36.0mmol)和EDCl(2.79g，14.5mmol)，搅拌10分钟，然后加入HCl·H2N-Gly-OBn(2.56g，13.0mmol)。将所得溶液在-20℃搅拌2小时，冷藏保存过夜，然后浓缩至干，接着用EtOAc(150mL)稀释。将EtOAc溶液用饱和NaHCO3、H2O、5％H3PO4、盐水洗涤两次，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(1.09)(4.5g，94％)。LRMSm/z MH+＝395.1。
步骤B化合物(1.1) 将化合物(1.09)(7.00g，17.8mmol)的无水乙醇(300mL)溶液在室温于氢气氛并存在Pd-C(300mg，10％)下搅拌。反应进度通过tlc监测。在2小时后，将混合物通过硅藻土垫过滤，所得溶液经真空浓缩获得化合物(1.1)(5.40g，定量)。LRMS m/z MH+＝305.1。
制备实施例2步骤A化合物(1.3) 将以上制备实施例1步骤B的化合物(1.1)(1eq.)、化合物(1.2)(Novabiochem，第04-12-5147号)(1.03eq.)、HOOBt(1.03eq.)、N-甲基吗啉(2.2eq.)和二甲基甲酰胺(70mL/g)的混合物在-20℃搅拌。加入EDCl(1.04eq.)，反应物搅拌48小时。将反应混合物倾入5％KH2PO4水溶液，用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的有机物依次用5％K2CO3冷水溶液、5％KH2PO4水溶液、盐水洗涤，有机层用无水MgSO4干燥。过滤混合物，然后蒸发，真空干燥滤液，残余物用Et2O-己烷研磨，过滤获得标题化合物(1.3)(86％收率)，C25H39N3O7(493.60)，质谱(FAB)M+1＝494.3。
步骤B化合物(1.4) 将制备实施例2步骤A的化合物(1.3)(3.0g)用4N HCl/二氧六环(36mL)处理，在室温下搅拌7分钟。将混合物倾入1.5L冷(5℃)己烷并搅拌，然后保持低温0.5小时。混合物在干燥空气中抽滤，将收集的固体进一步干燥获得标题化合物(1.4)(2.3g，88％收率)，C20H31N3O5·HCl，H1NMR(DMSO-d6/NaOD)δ7.38(m，5H)，5.25(m，1H)，4.3-4.1(m，1H)，3.8(m，2H)，3.4-3.3(m，被D2O屏蔽)，1.7-1.1(m，4H)，1.35(s，9H)，0.83(m，3H)。
制备实施例3化合物(1.5) 制备实施例2步骤A的化合物(1.3)按照以下制备实施例7步骤A基本相同的方法获得化合物(1.5)。
制备实施例4化合物(1.6) 制备实施例3的化合物(1.5)按照制备实施例2步骤B基本相同的方法处理获得化合物(1.6)。
制备实施例5步骤A化合物(2.09) 二甲胺盐酸盐(1.61g，19.7mmol)、N-Boc-苯基甘氨酸、化合物(2.08)(4.50g，17.9mmol，Bachem Co.#A-2225)、HOOBt(3.07g，18.8mmol)和EDCl(4.12g，21.5mmol)的无水DMF(200mL)和CH2Cl2(150mL)溶液在-20℃加入NMM(5.90mL，53.7mmol)。在上述温度搅拌30分钟后，将反应混合物保存在冰箱中过夜(18h)。然后加温至室温，加入EtOAc(450mL)、盐水(100mL)和5％H3PO4(100mL)。分出各层后，有机层用5％H3PO4(100mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2×150mL)、水(150mL)和盐水(150mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，然后真空浓缩获得白色固体化合物(2.09)(4.86g)，使用时无需再提纯。
步骤B化合物(2.1) 将制备实施例5步骤A的化合物(2.09)(4.70g，粗品)溶于4N HCl(60mL，240mmol)，所得溶液在室温下搅拌。反应进度通过TLC监测。4小时后，真空浓缩上述溶液获得白色固体化合物(2.1)，它在下一步反应中直接使用无需再提纯。LRMS m/z MH+＝179.0。
制备实施例6步骤A化合物(2.2) 按照制备实施例2步骤A基本相同的方法，用苯基甘氨酸N，N-二甲基酰胺盐酸盐代替苯基甘氨酸叔丁酯盐酸盐制备化合物(2.2)。质谱(FAB)M+1＝465.3。
步骤B化合物(2.3) 使步骤A的化合物(2.2)(1.85g)与4N HCl/二氧六环(50mL)在室温下反应1小时。混合物在20℃水浴中真空蒸发，用异丙醚研磨，过滤，干燥获得化合物(2.3)(1.57g，98％收率)，C18H28N4O4·HCl，质谱。(FAB)M+1＝365.3
制备实施例7步骤A化合物(2.4) 将制备实施例5步骤A的化合物(2.2)(2.0g)的二氯甲烷(60mL)溶液用二甲基亚砜(3.0mL)和2，2-二氯乙酸(0.70mL)处理。混合物在搅拌下冷却至5℃，然后加入1M二环己基碳二亚胺/二氯甲烷溶液(8.5mL)。除去冷却浴，搅拌混合物22小时。然后加入2-丙醇(0.5mL)，再搅拌1小时。过滤混合物，依次用冰冷的0.1N NaOH(50mL)、冰冷的0.1N HCl(50mL)、5％KH2PO4水溶液、饱和盐水洗涤。有机溶液用无水硫酸镁干燥，然后过滤。蒸发滤液，然后在硅胶上用色谱法提纯，用乙酸乙酯洗脱获得化合物(2.3)(1.87g，94％收率)，C23H34N4O6，质谱(FAB)M+1＝463.3。
步骤B化合物(2.5) 按照制备实施例2步骤B基本相同的方法制备化合物(2.5)。
制备实施例8步骤A化合物(3.1) 在烧瓶中混合N-Cbz-羟脯氨酸甲酯(Bachem Biosciences，Incorporated，King of Prussia，Pennsylvania)、化合物(3.01)(3.0g)、甲苯(30mL)和乙酸乙酯(30mL)。将混合物剧烈地搅拌，然后加入NaBr/水溶液(1.28g/5mL)。向此溶液加入2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基自由基(TEMPO，17mg，Aldich Chemicals，Milwaukee，Wisconsin)。混合物在搅拌下冷却至5℃，然后在0.5小时内滴加制备好的氧化剂溶液[用商业上可得到的漂白剂Clorox_(18mL)、NaHCO3(2.75g)和水配制成40mL]。向此溶液加入2-丙醇(0.2mL)。分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并有机层，先用2％硫代硫酸钠洗涤，然后用饱和盐水洗涤。有机溶液用无水MgSO4干燥，过滤，然后真空蒸发滤液，获得适合下一步反应用的浅黄色树胶(2.9g，97％收率)，C14H15NO5(277.28)，质谱(FAB)M+1＝278.1。
步骤B化合物(3.2)
将上述步骤A的化合物(3.1)(7.8g)溶于二氯甲烷(100mL)，冷却至15℃。在混合物中先加入1，3-丙二硫醇(3.1mL)，接着加入新蒸馏的醚合三氟化硼(3.7mL)。将混合物在室温下搅拌18小时。在剧烈搅拌的同时，小心地加入K2CO3/水溶液(2g/30mL)，接着加入饱和NaHCO3(10mL)。将有机层从水层(pH～7.4)分出，依次用水(10mL)，盐水洗涤。有机溶液用无水MgSO4干燥，过滤，真空蒸发。残余物在硅胶上用色谱法提纯，洗脱时先用甲苯，再用梯度的己烷-Et2O(2∶3至0∶1)获得褐色油状物(7.0g，68％收率)，C17H21NO4S2(367.48)，质谱(FAB)M+1＝368.1。
步骤C化合物(3.3) 将以上步骤B的化合物(3.2)(45g)的乙腈(800mL)溶液立刻在20℃用新蒸馏的碘代三甲基硅烷(53mL)处理。将反应物搅拌30分钟，然后倾入新制备的二碳酸二叔丁酯(107g)、乙醚(150mL)和二异丙基乙胺(66.5mL)溶液。将混合物再搅拌30分钟，然后用己烷(2×500mL)洗涤。将乙酸乙酯(1000mL)加入下面的乙腈层，然后将此层用10％KH2PO4水溶液(2×700mL)和盐水洗涤。滤液在25℃的水浴中真空蒸发，再溶解于新的乙酸乙酯(1000mL)，然后依次用0.1N HCl、0.1NNaOH、10％KH2PO4和盐水洗涤。有机溶液用无水MgSO4干燥，过滤，真空蒸发。残余物(66g)在硅胶(2kg)上用色谱法提纯，洗脱时先用己烷(2L)，然后用Et2O/己烷(55∶45，2L)，再用Et2O(2L)洗脱，获得橙色树胶，它在放置时缓慢地结晶(28g，69％收率)，C14H23NO4S2(333.46)，质谱(FAB)M+1＝334.1。
步骤D化合物(3.4) 以上步骤C的化合物(3.3)(11g)的二氧六环(150mL)溶液在20℃用1N LiOH水溶液(47mL)处理，搅拌30小时。在30℃水浴中真空浓缩混合物至一半的体积。将残留物用水(300mL)稀释，用Et2O(2×200mL)萃取。将水层用12N HCl(3-4mL)酸化至pH～4，用乙酸乙酯萃取，然后用盐水洗涤。有机溶液用无水MgSO4干燥，过滤，然后真空蒸发获得化合物(3.4)(8.1g，78％)，C13H21NO4S2(319.44)，质谱(FAB)M+1＝320.1。
步骤E化合物(3.5) 在以上步骤C的化合物(3.3)(1g)的二氧六环(5mL)溶液中加入4N HCl-二氧六环溶液(50mL)。将混合物剧烈地搅拌1小时。在25℃的水浴中真空蒸发混合物。残余物用Et2O研磨，然后过滤获得标题化合物(0.76g，93％收率)，C9H15NO2S2·HCl(269.81)，质谱(FAB)M+1＝234.0。
制备实施例9步骤A化合物(3.6) 按照制备实施例8步骤B的基本相同的方法，用乙烷二硫醇代替丙烷二硫醇，获得化合物(3.6)。
步骤B化合物(3.7) 按照制备实施例8步骤C的基本相同的方法，用化合物(3.6)代替化合物(3.2)，获得产物化合物(3.7)。
步骤C化合物(3.8)
按照制备实施例8步骤D的基本相同的方法，用化合物(3.7)代替化合物(3.3)，获得产物化合物(3.8)。
步骤D化合物(3.9) 按照制备实施例8步骤E的基本相同的方法，用化合物(3.7)代替化合物(3.3)获得产物化合物(3.9)。
制备实施例10步骤A化合物(4.1) 按照制备实施例2步骤A的基本相同的方法制备化合物(4.1)C33H48N4O9S2(708.89)。
步骤B化合物(4.2) 按照制备实施例2步骤B的基本相同的方法制备化合物(4.2)，质谱(FAB)M+1＝609.3。
步骤C化合物(4.3) 按照制备实施例2步骤A的基本相同的方法制备化合物(4.3)，C41H61N5O10S2(708.89)，质谱(FAB)M+1＝709.3。
步骤D化合物(4.4) 按照制备实施例7步骤A的基本相同的方法制备化合物(4.4)。
制备实施例11步骤A化合物(4.5) 按照制备实施例2步骤A的基本相同的方法制备化合物(4.5)。
步骤B化合物(4.6) 按照制备实施例2步骤B的基本相同的方法制备化合物(4.6)。
步骤C化合物(4.7) 按照制备实施例2步骤A的基本相同的方法，使制备实施例12的化合物(4.9)与以上步骤B的化合物(4.6)反应获得化合物(4.7)。
步骤D化合物(4.8) 按照制备实施例7步骤A基本相同的方法制备化合物(4.8)。
制备实施例12化合物(4.9)i-BuOCOCl+H-Chg-OH→lboc-Chg-OH(4.01) (4.02) (4.9)L-环己基甘氨酸(4.02)(1.0eq.)、二甲基甲酰胺(20mL/g)和二异丙基乙胺(1.1eq.)的溶液在5℃用氯甲酸异丁酯(4.01)(1.1eq.)处理。除去冷却浴，将其搅拌6小时。将反应混合物倾入5％KH2PO4水溶液，用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的有机层依次用5％K2CO3冷水溶液、5％KH2PO4水溶液、盐水洗涤，将有机层用无水MgSO4干燥。过滤混合物，真空蒸发滤液，如果需要残余物用色谱法提纯，否则残余物用Et2O-己烷研磨，过滤获得标题化合物(4.9)，C13H23NO4(257.33)。
制备实施例13化合物(13.1)i-BuOCOCl+H-Thr(Bzl)-OH→Iboc-Thr(Bzl)-OH(4.01) (13.02)(13.1)按照制备实施例12基本相同的方法，用L-O-苄基苏氨酸(13.02)(Wang等，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，(1997)No.5，621-624.)代替L-环己基甘氨酸(4.02)制备化合物(13.1)C16H23NO5(309.36)，质谱(FAB)M+1＝310.2。
制备实施例14 使制备实施例11步骤D的化合物(4.8)(1.0g)与无水三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，50mL)溶液反应2小时。将溶液用二甲苯(100mL)稀释，真空蒸发。将残余物用Et2O研磨，过滤获得标题化合物(5.1)(0.9g)，C37H53N5O9S2(775.98)，质谱(FAB)M+1＝776.5。
步骤B化合物(5.2) 按照制备实施例2步骤A基本相同的方法，使化合物(5.1)与氨(0.5M 1，4-二氧六环溶液)反应获得标题化合物(5.2)C37H54N6O8S2(774.99)，质谱(FAB)M+1＝775.4。
制备实施例15 将制备实施例14步骤A的化合物(5.1)(0.15g)、N，N-二甲胺(0.12mL的2M THF溶液)、二甲基甲酰胺(10mL)和PyBrOP偶合试剂(0.11g)的混合物冷却至5℃，然后加入二异丙基乙胺(DIEA或DIPEA，0.12mL)。混合物在低温搅拌1分钟，然后在室温下搅拌6小时。将反应混合物倾入5％H3PO4冷水溶液(50mL)，用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的有机层依次用5％K2CO3冷水溶液、5％KH2PO4水溶液、盐水洗涤。有机溶液用无水MgSO4干燥，过滤，真空蒸发。残余物在硅胶上用色谱法提纯，洗脱时用MeOH-CH2Cl2获得标题化合物(5.3)，C39H58N6O8S2(803.05)，质谱(FAB)M+1＝803.5。
制备实施例16步骤A化合物(6.2) 按照制备实施例2步骤A基本相同的方法，使化合物(6.1)羟脯氨酸苄酯盐酸盐与制备实施例12的化合物(4.9)反应获得标题化合物(6.2)C25H36N2O6(460.56)，质谱(FAB)M+1＝461.2。
步骤B化合物(6.3) 按照制备实施例8基本相同的方法制备化合物(6.3)C25H34N2O6(458.55)，质谱(FAB)M+1＝459.2。
步骤C化合物(6.4) 将步骤B的化合物(6.3)(1g)、10％Pd/C(0.05g)和EtOH(100mL)的混合物在1个大气压H2气氛下搅拌6小时。将混合物过滤，然后真空蒸发至干，获得标题化合物(6.4)(0.77g)，C18H28N2O6(368.42)，质谱(FAB)M+1＝369.2。
制备实施例17步骤A化合物(7.1) 按照制备实施例2步骤A基本相同的方法，使制备实施例16步骤C的化合物(6.4)与制备实施例6步骤B的化合物(2.3)反应获得化合物(7.1)，C36H54N6O9(714.85)，质谱(FAB)M+1＝715.9。
步骤B化合物(7.2) 化合物(7.1)按照制备实施例7步骤A的基本相同的方法反应获得化合物(7.2)，C36H52N6O9(712.83)，质谱(FAB)M+1＝713.5。
步骤C化合物(7.3) 以上步骤B的化合物(7.2)按照制备实施例8步骤B的基本相同的方法与1，4-丁二硫醇反应获得标题化合物(7.3)，C40H60N6O8S2(817.07)，质谱(FAB)M+1＝817.5。
利用上述方法制备附表2中的化合物。作为至此所有表格以及本说明书中的实施例和流程的总注释在实施例和表格中化学结构化合价不够的任何开端氮原子是指NH，为末端氮时指-NH2。同样，在实施例和表中化合价不够的任何开端氧原子是指-OH。
固相合成固相偶合反应的一般方法合成是在反应容器中完成，容器由在底部装配有聚丙烯滤板(frit)的聚丙烯注射针筒构成。Fmoc-保护的氨基酸在标准固相技术下偶合。每个反应容器中装有100mg的初始Fmoc-Sieber树脂(大约0.03mmol)。树脂用每份2mL的DMF(2次)洗涤。用2mL20％v/v的哌啶DMF溶液处理20分钟去除Fmoc保护基团。树脂用每份2mL的DMF(4次)洗涤。偶合在DMF(2mL)中完成，使用0.1mmol Fmoc-氨基酸、0.1mmol HATU[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟膦酸盐]和0.2mmol DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)。振荡2小时后，排干反应容器，将树脂用每份2mL的DMF(4次)洗涤。用下一个Fmoc-氨基酸或封端基团重复偶合过程。
固相Dess-Martin氧化的一般方法合成是在反应容器中进行，容器由在底部装配有聚丙烯滤板的聚乙烯注射针筒构成。结合在树脂上的羟基化合物(大约0.03mmol)用0.12mmol Dess-Martin全碘烷(Periodinane)和0.12mmol t-BuOH的2mL DCM溶液处理4小时。树脂用每份2mL的20％v/v iPrOH的DCM溶液、THF、50％v/v THF水溶液(4次)、THF(4次)和DCM(4次)洗涤。
制备实施例18制备N-Fmoc-2’，3’-二甲氧基苯基甘氨酸化合物(901) 氰化钾(1.465g，22.5mmol)和碳酸铵(5.045g，52.5mmol)的水(15mL)溶液中加入2，3-二甲氧基苯甲醛901A(2.5g，15mmol)的乙醇(15mL)溶液。将反应物混合物在40℃加热24小时。减压蒸发使溶液体积减至10mL。加入浓盐酸(15mL)，获得白色沉淀化合物901B。过滤分离出化合物901B(2.2g，9.3mmol)。将化合物901B溶于10％w/w氢氧化钠水溶液(15mL)，所得溶液加热回流24小时。加入浓盐酸，调节pH值至中性(pH7)。将所得包含化合物901C的溶液减压蒸发。将残余物溶于5％w/w碳酸氢钠水溶液(150mL)。溶液在冰浴中冷却至0℃，并在0℃加入1，4-二氧六环(30mL)和9-芴基甲基琥珀酰亚胺基碳酸酯(2.7g，8mmol)的1，4-二氧六环(30mL)溶液。将反应混合物加温至室温，在室温下搅拌24小时。减压蒸去1，4-二氧六环。用乙醚洗涤水溶液。加入浓盐酸调节pH值至酸性(pH1)。加入乙酸乙酯，有机层用水和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂获得所需的白色泡沫状固体化合物901(3.44g，7.9mmol)。MS(LCMS-电喷雾)434.1MH+。
制备实施例19化合物(801) 将N-Fmoc-苯基丙氨酸801A(5g，12.9mmol)的无水DCM(22mL)溶液在干冰-丙酮浴中冷却至-30℃，依次加入N-甲基吡咯烷(1.96mL，16.1mmol)和氯甲酸甲酯(1.2mL，15.5mmol)。反应混合物在-30℃搅拌1小时，加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐(1.51g，15.5mol)和N-甲基吡咯烷(1.96mL，16.1mmol)的无水DCM(8mL)溶液。将反应混合物加温至室温，并在室温下搅拌过夜。加入甲苯，将有机层用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂获得化合物801B(4g，9.29mmol)。
Red-Al(6.28mL，21.4mmol)的无水甲苯(8mL)溶液在干冰-丙酮浴中冷却至-20℃，加入化合物801B(4g，9.29mmol)的无水甲苯(12mL)溶液。将反应混合物在-20℃搅拌1.5小时。有机层用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂，粗产物801C在下一步反应直接使用无需再提纯。
化合物801C(大约9.29mmol)的己烷(15mL)溶液中依次加入氰化钾(24mg，0.37mmol)和叔丁基碘化铵(34mg，0.092mmol)的水(4mL)溶液以及丙酮合氰化氢(1.27mL，13.9mmol)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。加入乙酸乙酯，有机层用水和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂获得化合物801D(2.4g，6.03mmol)。
化合物801D(2.4g，6.03mmol)的1，4-二氧六环(11mL)溶液中加入浓盐酸(11mL)。将反应混合物在80℃加热3小时。加入乙酸乙酯(25mL)和水(25mL)。有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂获得所需白色泡沫状固体化合物801(2g，4.8mmol)。MS(LCMS-电喷雾)418.1MH+。
流程8
实施例(301J)流程8化合物(301J) 从100mg Fmoc-Sieber树脂(0.03mmol)开始，结合在树脂上的化合物301B、301C、301D、301E、301F和301G按照固相偶合反应的一般方法制备。按照固相Dess-Martin氧化的一般方法，将结合在树脂上的化合物301G氧化成结合在树脂上的化合物301H。将结合在树脂上的化合物301H用4mL 2％v/v TFA的DCM溶液处理5分钟。滤液加入到1mL AcOH中，将溶液真空离心浓缩获得化合物301J(0.0069g，29％收率)。MS(LCMS-电喷雾)771.2MH+。
利用上文详细说明的固相合成技术和以下式I化合物的各种官能团部分，制备表3中的化合物-W- Y-W-



-R4 -Z- -R3

-R2 -R1 -R5 -R7 -R9
-R10 -R1’ -R2’

表3.固相合成制备的化合物





































制备的其它化合物及其活性(Ki*)范围在附表4和附表5中列出。制备表4和表5中化合物的方法概述如下
I)合成表4和表5化合物的中间体实施例I.合成4，4-二甲基脯氨酸甲酯(H-Pro(4，4-diMe)-OMe) 步骤1.合成N-叔丁氧基羰基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯(Boc-PyroGlu(4-甲基)-OtBu) N-叔丁氧基羰基-焦谷氨酸叔丁酯(11.5g，40mmol)的THF(200mL)溶液在-78℃搅拌下于5分钟内滴加1M六甲基二硅叠氮化(disilazide)锂的THF(42mL，42mmol)溶液。在30分钟后，加入甲基碘(3.11mL，50mmol)。再在-78℃经过2小时后，除去冷却浴，加入50％氯化铵饱和水溶液(200mL)。将溶液搅拌20分钟，然后用乙醚(3×200mL)萃取。合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。残余物色谱法(1∶1乙酸乙酯/己烷)获得Boc-PyroGlu(4-甲基)-OtBu(10.6g，35.4mmol，88％)的异构体混合物(2∶1顺式∶反式)。
步骤2.合成N-叔丁氧基羰基-4，4-二甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯(Boc-PyroGlu(4，4-二甲基)-OtBu) N-叔丁氧基羰基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯(1.2g，4.0mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液在-78℃搅拌下于5分钟内滴加1M六甲基二硅叠氮化锂的四氢呋喃(4.4mL，4.4mmol)溶液。在30分钟后，加入甲基碘(0.33mL，5.2mmol)。再在-78℃经过3小时后，除去冷却浴，加入50％氯化铵饱和水溶液(40mL)。将溶液搅拌20分钟，然后用乙醚(2×50mL)萃取。合并的有机层用水(2×25mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2×25mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩获得Boc-PyroGlu(4，4-二甲基)-OtBu(0.673g，54％)步骤3.合成N-叔丁氧基羰基-4，4-二甲基脯氨酸叔丁酯(Boc-Pro(4，4-二甲基)-OtBu) 改进已知方法Pedregal，C.；Ezquerra，J.；Escribano，A.；Carreno，M.C.；Garcia Ruano，J.L.Tetrahedron Letters 1994，35(13)，2053-2056)。
N-叔丁氧基羰基-4，4-二甲基焦谷氨酸叔丁酯(2.0mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液在-78℃搅拌下于5分钟内滴加1M三乙基硼氢化锂的四氢呋喃(2.4mL，2.4mmol)溶液。在30分钟后，除去冷却浴，加入饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)。将反应混合物浸入冰/水浴中，加入30％的过氧化氢水溶液(10滴)。将溶液在0℃搅拌20分钟，然后真空浓缩反应混合物以除去四氢呋喃。将水溶液用水(10mL)稀释，用二氯甲烷(3×40mL)萃取。干燥(Na2SO4)有机层，过滤并浓缩。将残余物溶于二氯甲烷(20mL)和三乙基硅烷(310μL，2.0mmol)，然后冷却至-78℃，滴加三氟化硼合乙醚(270μL，2.13mmol)。继续搅拌30分钟，本发明期间再加入三乙基硅烷(310μL，2.0mmol)和三氟化硼合乙醚(270μL，2.13mmol)。在-78℃再搅拌2小时，除去冷却浴，加入饱和碳酸氢钠水溶液(4mL)。5分钟后将混合物用二氯甲烷(3×40mL)萃取。干燥(Na2SO4)有机层，过滤并浓缩获得Boc-Pro(4，4-二甲基)-OtBu。
步骤4.合成4，4-二甲基脯氨酸(H-Pro(4，4-二甲基)-OH) N-叔丁氧基羰基-4，4-二甲基脯氨酸叔丁酯的二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(5mL)溶液在室温下搅拌5小时。将溶液浓缩，高真空下干燥，在下一步直接使用无需再提纯。
步骤5.合成N-叔丁氧基羰基4，4-二甲基脯氨酸(Boc-Pro(4，4-二甲基)-OH) 在4，4-二甲基脯氨酸三氟乙酸盐(1.5mmol)的二氧六环(7mL)、乙腈(12mL)和二异丙基乙胺(700μL，4mmol)溶液中加入二碳酸二叔丁酯(475mg，2.18mmol)的乙腈(5mL)溶液。在室温下搅拌12小时后，将溶液真空浓缩，溶于饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)，然后用乙醚(3×40mL)洗涤。水层用柠檬酸酸化至pH＝3，然后用二氯甲烷(3×40mL)萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。
步骤6.合成4，4-二甲基脯氨酸甲酯盐酸盐(HCl·H-Pro(4，4-二甲基)-OMe) Boc-Pro(4，4-diMe)-OH(0.5g，2.06mmol)的无水甲醇(8ml)溶液中滴加亚硫酰氯(448 l，6.18mmol)，将反应物在室温下搅拌6小时。将反应混合物浓缩获得无定形固体(377mg，95％)。
实施例II.合成N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基脯氨酸的一般方法 R基团为烯丙基和苄基的化合物按照以下步骤1-4合成步骤1.合成N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯 N-叔丁氧基羰基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯(10.2g，mmol)(参见实施例I步骤1)的四氢呋喃(170mL)溶液在-78℃搅拌下于5分钟内滴加1M六甲基二硅叠氮化锂的四氢呋喃(37.5mL，37.5mmol)溶液。在40分钟后，加入烷基卤(61.4mmol)。在-78℃经过3小时后，除去冷却浴，加入50％饱和氯化铵水溶液(200mL)。将溶液搅拌20分钟，然后用乙醚(2×200mL)萃取。合并的有机层用己烷(150mL)稀释，然后用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)、水(2×100mL)和盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。残余物用快速色谱法(用含20％乙酸乙酯的己烷)获得纯N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯。
步骤2.合成N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基脯氨酸叔丁酯 改进已知方法Pedregal，C.；Ezquerra，J.；Escribano，A.；Carreno，M.C.；Garcia Ruano，J.L.Tetrahedron Letters(1994)35(13)，2053-2056)。
N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基焦谷氨酸叔丁酯(16.6mmol)的四氢呋喃(40mL)溶液在-78℃搅拌下于10分钟内滴加1M三乙基硼氢化锂的四氢呋喃(20mL，20mmol)溶液。在120分钟后，将冷却浴加温至-25℃，本发明温度加入饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)。将反应混合物浸入冰／水浴中，加入30％的过氧化氢水溶液(4mL)。将溶液在0℃搅拌10分钟，然后将反应混合物真空浓缩以除去四氢呋喃。将水溶液用水(300mL)稀释，用二氯甲烷(3×200mL)萃取。干燥有机层(硫酸钠)，过滤并浓缩。将残余物溶于二氯甲烷(100mL)和三乙基硅烷(2.6mL，mmol)，然后冷却至-78℃，滴加三氟化硼合乙醚(2.2mL，mmol)。继续搅拌1小时，本发明期间再加入三乙基硅烷(2.6mL，mmol)和三氟化硼合乙醚(2.2mL，mmol)。在-78℃再搅拌小时，除去冷却浴，加入饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)和水(150mL)。5分钟后将混合物用二氯甲烷(3×200mL)萃取。干燥有机层(Na2SO4)，过滤并浓缩。
步骤3.合成4-烷基-4-甲基脯氨酸 将N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基脯氨酸叔丁酯的二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(5mL)溶液在室温下搅拌5小时。加入甲苯，将溶液浓缩，然后在高真空下干燥。
步骤4.合成N-叔丁氧基羰基4-烷基-4-甲基脯氨酸 4-烷基-4-甲基脯氨酸三氟乙酸盐(1.5mmol)的二氧六环(7mL)、乙腈(12mL)和二异丙基乙胺(700μL，4mmol)溶液中加入二碳酸二叔丁酯(475mg，2.18mmol)的乙腈(5mL)溶液。在室温下搅拌12小时后，将溶液真空浓缩，溶于饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)，然后用乙醚(3×40mL)洗涤。将水相用1N盐酸酸化至pH＝3，然后用二氯甲烷(3×40mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。残余物用快速色谱法提纯，使用1∶1乙酸乙酯/己烷和1％乙酸。
实施例III.合成N-叔丁氧基羰基4-丙基-4-甲基脯氨酸 N-叔丁氧基羰基-4-烯丙基-4-甲基脯氨酸(400mg，1.48mmol)(参见实施例II步骤4)和10％碳载钯(400mg)的甲醇(20mL)溶液在50psi氢化4小时。将混合物过滤并浓缩。
实施例IV.合成Boc-4-环己基脯氨酸 商业得到的Boc-4-苯基脯氨酸(750mg)和5％碳载Rh(750mg)的甲醇(15mL)溶液在50psi氢化24小时。将混合物过滤并浓缩获得730mg产物。
实施例V制备芴基甲氧羰基-脯氨酸(4-螺环戊烷)-羰酸 步骤1.合成Boc-焦谷氨酸(4-烯丙基)-叔丁酯 商业上得到的N-Boc-叔丁基焦谷氨酸酯(10g，35.1mmol)的THF(175ml)冷却(-78℃)溶液中在5分钟内加入六甲基二硅叠氮化锂(36.8mL，36.8mmol)。继续搅拌30分钟。将烯丙基溴(6.1ml，70.2mmol)的THF(39mL)溶液滴加到第一种溶液中。在-78℃经过两小时后，反应物中缓慢地加入饱和氯化铵(50mL)溶液猝灭。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，将各层分离。有机层用硫酸钠干燥后浓缩。快速柱色谱法利用2∶8乙酸乙酯∶己烷获得产物(6g，53％)。NMRδppm(CDCl3)5.7(m，1H)，5.1(dd，2H)，4.4(m，1H)，2.6(m，2H)，2.4(m，1H)，1.8-2.2(m，1H)，1.45(s，9H)，1.4(s，9H)。
步骤2.合成N-Boc-焦谷氨酸(4，4-二烯丙基)-叔丁酯
将以上步骤1获得的N-Boc-焦谷氨酸(4-烯丙基)-叔丁酯(2.68g，8.24mmol)在同样条件下用烯丙基溴第二次烷基化。快速色谱法利用15∶85乙酸乙酯∶己烷获得2.13g澄清油状产物(71％)。
步骤3.合成Boc-脯氨酸(4，4-二烯丙基)-叔丁酯 步骤aBoc-PyroGlu(4，4-二烯丙基)-叔丁酯(2.l3g，5.83mmol)的四氢呋喃(14ml)冷却(-78℃)溶液在5分钟内加入三乙基硼氢化锂(1M的四氢呋喃溶液，7.29ml，7.29mmol)。在-78℃经过2小时后，将反应物加温至0℃，缓慢地加入饱和碳酸氢钠水溶液(20ml)和30％过氧化氢(20滴)猝灭。继续搅拌20分钟。减压除去四氢呋喃，获得的白色稠厚残余物用水(80ml)稀释，用二氯甲烷萃取三次。干燥有机层，过滤并浓缩后用于下一步无需再提纯。
步聚b)在步骤(a)获得的产物的二氯甲烷(14ml)溶液中加入三乙基硅烷(931μl，5.83mmol)，接着加入三氟化硼合乙醚(776μl，6.12mmol)。在30分钟后再加入三乙基硅烷(931μl，5.83mmol)和三氟化硼合乙醚(776μl，6.12mmol)，将反应物在-78℃搅拌3小时，本发明期间缓慢地加入饱和碳酸氢钠溶液和水猝灭。将反应混合物用二氯甲烷萃取，干燥有机层，过滤并浓缩。用快速柱色谱法(含15％乙酸乙酯的己烷)获得1.07无色油状物(57％)。NMRδppm(CDCl3)5.7-5.8(m，2H)，5.1(m，4H)，4.1-4.2(2dd’s，1H旋转异构体)，3.5-3.3(dd，1H)和3.2(dd，1H)旋转异构体，2.2-2.0(m，5H)，1.7(m，1H)，1.46(s，9H)，1.43(s，9H)。
步骤4.合成Boc-脯氨酸(4-螺环戊烯)-叔丁酯 Boc-脯氨酸(4，4-二烯丙基)-叔丁酯(1.07g，3.31mmol)的二氯甲烷(66ml)溶液中加入5％二氯化二(三环己基膦基)亚苄基钌IV(Grubbs催化剂)，将混合物回流加热1.5小时。浓缩反应混合物，残余物用快速柱色谱法(用含15％乙酸乙酯的己烷)提纯。获得黄色油状物(0.57g，53％)。NMRδppm(CDCl3)5.56(bs，2H)，4.2和4.1(t，1H，旋转异构体)，3.2-3.5(m，2H)，2.2-2.5(m，5H)，1.9(dd，1H)1.47和1.46(2s’s，9H，旋转异构体)，1.45和1.44(2s’s，9H，旋转异构体)。
步骤5.合成Boc-脯氨酸(4-螺环戊烷)-叔丁酯 将Boc-脯氨酸(4-螺环戊烯)-叔丁酯(1.12g)的甲醇(18ml)、水(4ml)和乙酸(4ml)溶液置于Parr振荡器中，在35psi并存在10％碳载钯(300mg)下氢化3小时。将催化剂滤除，浓缩滤液至无色油状物(1.26g)。NMRδppm(CDCl3)4.1和4.2(t，1H，旋转异构体，3.4(d，1H)，3.2(d，1H)，2.1(m，1H)，1.9(m，1H)，1.6-1.7(m，10H)，1.5(3s’s，18H，旋转异构体)。
步骤6.合成Fmoc-脯氨酸(4-螺环戊烷)羧酸 将Boc-脯氨酸(4-螺环戊烷)-叔丁酯(1.26，3.9mmol)用二氯甲烷(10ml)和三氟乙酸(15ml)处理3小时。浓缩反应混合物，将获得得黄色油状物溶于水(6ml)。分次加入溶于二氧六环(6ml)的芴基甲基琥珀酰碳酸酯(1.45g，4.3mmol)，接着加入碳酸钾(2.16g，15.6mmol)。将反应物搅拌18小时后浓缩。残余物用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)稀释，然后用乙醚(3×10ml)洗涤。将水层用1N硫酸氢钠溶液酸化至pH～1，用乙酸乙酯萃取。有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩获得淡棕色泡沫物(1.3g，100％)。
实施例VI.合成Boc-Pro(4t-NH(Fmoc))-OH
步骤1.合成Nα-叔丁氧基羰基-顺式-4-氯-L-脯氨酸苄酯 将商业性获得的N-叔丁氧基羰基-反式-4-羟基-脯氨酸(8.79g，38mmol)、碳酸钾(13.0g，94mmol)、苄基溴(4.5ml，38mmol)和二甲基甲酰胺(150mL)的混合物搅拌18小时。加入乙酸乙酯(100mL)后过滤。加入1M HCl(100mL)使白色混浊滤液变澄清。将各层分离，水层再加入乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并的有机层用水洗涤(2×50mL)，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。将甲苯加入粗制的苄基酯，将溶液过滤后再浓缩。加入二氯甲烷(70mL)和四氯化碳(70mL)，接着加入三苯膦(21.11g，80mmol)。将反应混合物搅拌10小时，用乙醇(7mL)猝灭，再搅拌5小时。将溶液浓缩至约100ml，然后加入二氯甲烷(40mL)，接着搅拌下加入乙醚(200mL)。将溶液冷却4小时，过滤并浓缩获得黄褐色油状物，将它用快速色谱法提纯(用乙醚/己烷/二氯甲烷2∶2∶1)获得白色固体标题化合物(9.13g，26.9mmol，71％)。
步骤2.合成Nα-叔丁氧基羰基-反式-4-叠氮基-L-脯氨酸苄酯
将Nα-叔丁氧基羰基-顺式-4-氯-L-脯氨酸苄酯(9.0g，26.5mmol)和叠氮化钠(7.36g，113mmol)的二甲基甲酰胺(270mL)溶液在75℃加热2天。加入水(100mL)，将反应混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并的有机层用水洗涤(3×50mL)，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。油状物用快速色谱法提纯(乙酸乙酯/己烷1∶1)获得标题化合物(8.59g，24.8mmol，94％)。
步骤3.合成Boc-Pro(4t-NH(Fmoc))-OH N-α-叔丁氧基羰基-反式-4-叠氮基-L-脯氨酸苄酯(8.59g，24.8mmol)和10％碳载钯(900mg)在乙醇(500mL)中的混合物用Parr氢化装置于50psi氢化14小时。将混合物过滤，浓缩，溶于甲醇(60mL)，再过滤并浓缩获得无色油状物。将油状物溶于包含碳酸钠(5.31g，50.1mmol)的水(53mL)中，在40分钟内加入芴基甲基琥珀酰碳酸酯(8.37g，29.8mmol)的二氧六环(60mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌17小时，然后浓缩除去二氧六环，用水(200mL)稀释。溶液用乙醚(3×100mL)洗涤。加入柠檬酸(小心！发泡！)和水(100mL)调节水溶液的pH至2。混合物用二氯甲烷(400mL，100mL，100mL)萃取，将合并的有机层干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩获得标题化合物。
实施例VII.合成N-叔丁氧基羰基-4-反式-(N-芴基甲氧羰基氨基甲基)-L-脯氨酸(Boc-Pro(4t-MeNHFmoc)-OH) 步骤1.合成叔丁氧基羰基顺式-4-羟基-L-脯氨酸苄酯(Boc-Pro(4-cis-OH)-OBn) 顺式-羟基-L-脯氨酸(5g，38.1mmol)的苯(45mL)和苄醇(45mL)混合物中加入一水合对甲苯磺酸(7.6g，40.0mmol)。将反应混合物在125℃加热20小时，同时用Dean-Stark捕集器除去水(2ml)。趁热过滤溶液，然后加入乙醚(150ml)。将溶液在室温冷却3小时，然后在4℃冷却3小时。收集所得固体，用乙醚(100mL)洗涤，真空干燥1小时获得13.5g白色固体。将固体溶于二氧六环(40mL)和二异丙基乙胺(7.6mL)，然后在5分钟内加入二碳酸二叔丁酯(10g，45.8mmol)，同时用冰浴保持恒定的反应温度。在室温经过10小时后，将反应混合物倾入冷水(200mL)中，用乙酸乙酯(3×200mL)萃取。合并的有机层用水(3×100mL)和饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。粗产物用快速色谱法(用40-60％乙酸乙酯的己烷)提纯获得标题化合物(10.04g，31.24mmol，82％)。
步骤2.合成N-叔丁氧基羰基顺式-4-甲磺酰氧基-L-脯氨酸苄酯(Boc-Pro(4-cis-OMS)-OBn) Boc-Pro(4-cis-OH)-OBn(8.45g，26.3mmol)的吡啶(65mL)溶液在0℃于7分钟内滴加甲磺酰氯(3.4mL，44mmol)。将反应混合物在2小时内加温至室温，然后搅拌过夜。在15分钟内加入10％水的吡啶(20mL)溶液，浓缩反应混合物。将残余物溶于水，用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。合并的有机层用水(2×50mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)和饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。将所得残余物溶于甲苯(100mL)，浓缩除去痕量吡啶。真空干燥残余物30分钟，获得标题化合物(10.7g，102％)，然后用于下一步骤而无需提纯。
步骤3.N-叔丁氧基羰基-反式-4R-氰基-L-脯氨酸苄酯(Boc-Pro(4-trans-CN)-OBn) 将Boc-Pro(4-cis-OMs)-OBn(10.7g，26.3mmol)和四丁基氰化铵(15.0g，56mmol)的二甲基甲酰胺(100mL)溶液用油浴在55℃加热28小时。冷却后，加入水(150mL)，混合物用乙酸乙酯(3×200mL)萃取。合并的有机层用水(3×100mL)和饱和氯化钠水溶液(100mL)洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。将所得残余物用快速色谱法(1∶1乙醚/己烷)提纯，然后用乙酸乙酯/己烷重结晶获得标题化合物(2.40g，7.26mmol，28％)。
步骤4.N-叔丁氧基羰基-4-反式-(N-芴基甲氧羰基氨基甲基)-L-脯氨酸(Boc-Pro(4t-MeNHFmoc)-OH) 以上步骤3的化合物(2.31g，7mmol)、水(10mL)、甲醇(85mL)和10％碳载钯(700mg)的混合物用Parr氢化装置在50psi氢化11小时。过滤并浓缩混合物。将水(15mL)和碳酸钠(1.5g，14.2mmol)加入残余物。在5分钟内加入芴基甲基琥珀酰碳酸酯(2.36g，7.0mmol)的二氧六环(17mL)溶液，在室温下连续搅拌28小时。真空浓缩反应物至体积为15mL，加入水(100mL)。溶液用乙醚(3×75mL)洗涤。加入柠檬酸(约20g，小心！发泡！)和水(100mL)调节水溶液的pH至2。混合物用二氯甲烷(4×100mL)萃取，干燥(硫酸钠)合并的有机层，过滤并浓缩。粗产物包含一种必须经3步纯化的主要杂质。将粗产物溶于二氯甲烷(50mL)和三氟乙酸(50mL)，搅拌5小时后浓缩。残余物用制备型反相HPLC提纯。将纯4-(N-芴基甲氧羰基氨基甲基)脯氨酸三氟乙酸盐(1.887g，3.93mmol)溶于二氧六环(10mL)、乙腈(20mL)和二异丙基乙胺(1.4mL，8mmol)。反应混合物中加入二碳酸二叔丁酯(1.1g，5mmol)的二氧六环(5mL)溶液。在搅拌18小时后，加入柠檬酸(小心发泡！)和水(100mL)调节溶液的pH至2。混合物用乙酸乙酯(3×150mL)萃取，合并的有机层用饱和氯化钠水溶液(100mL)洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。将粗产物溶于饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)，然后用乙醚(3×75mL)洗涤。水相中加入柠檬酸调节pH＝3，然后用二氯甲烷(4×100mL)萃取。干燥(硫酸钠)合并的有机层，过滤并浓缩获得标题化合物(1.373g，2.94mmol，42％)。
实施例VIII.合成3，4-亚异丙基脯氨醇
步骤1.环丙烷化反应(Tetrahedron Lett.1993.34(16)2691和2695) 异丙基三苯基碘化鏻(4.14g，9.58mmol)的四氢呋喃(60mL)溶液在0℃搅拌下于5分钟加入正丁基锂(1.6M的己烷溶液，5.64mL，9.02mmol)。30分钟后，在10分钟内加入烯酰胺((5R，7S)-5-苯基-5，6，7，7a-四氢-6-氧杂pyrrolizin-3-酮)(1.206g，6.0mmol)(关于合成烯酰胺原料参见J.Org.Chem.1999，64(2)，547)的四氢呋喃(40mL)溶液。再经过10分钟后，除去冷却浴，在室温下搅拌反应混合物4小时。将反应物倾入水(400mL)中，用乙醚(400mL)和乙酸乙酯(2×400mL)萃取。用硫酸钠干燥合并的有机萃取液，过滤并浓缩获得所需的粗产物。残余物用快速色谱法提纯，洗脱时用3∶5∶2乙酸乙酯/己烷/二氯甲烷获得纯环丙烷化产物(750mg，3.08mmol，51％)。
步骤2.合成3，4-亚异丙基脯氨醇(P[3，4-(diMe-环丙基)]-乙醇)(J.Org.Chem.(1999)64(2)，330)
将以上步骤1获得的产物(1.23g，5.06mmol)和氢化锂铝(1.0M的THF溶液，15mL，15mmol)的混合物加热回流5小时。在冷却至0℃后，在15分钟内滴加饱和硫酸钠水溶液(1.5mL)小心地猝灭残留的氢化铝。用乙酸乙酯(40mL)稀释混合物，然后用硅藻土过滤。用硫酸钠干燥滤液，过滤并浓缩获得粗制的N-苄基氨基醇(1.25g)，将其用于下一步无需再提纯。粗制的N-苄基氨基醇(1.25g，5.06mmol)的1∶1乙酸/乙酸乙酯(30mL)溶液与10％Pd/C(1g)用Parr氢化装置在50psi氢化16小时。过滤反应混合物以除去碳载催化剂，浓缩滤液。将残余物溶于水(30mL)，用50％NaOH调节pH至13。混合物用乙醚(3×60mL)萃取。用硫酸钠干燥合并的萃取液，过滤并浓缩获得粗制的氨基醇(485mg，3.43mmol)。此产物用于下一步无需再提纯。
实施例IX.合成iBoc-G(Chx)-Pro(3，4-亚异丙基)-羰酸 步骤1.合成异丁氧基羰基-环己基甘氨酸(Boc-G(Chx)-OH)
商业上可得到的环己基甘氨酸盐酸盐(15g，77.4mmol)的乙腈(320ml)和水(320ml)溶液中加入碳酸钾。将氯甲酸异丁酯(11.1ml，85.1mmol)在15分钟内加入澄清的溶液中，搅拌反应物17小时。减压除去乙腈，残留的水层用乙醚(100ml)萃取两次。然后用6N盐酸酸化水层至pH为1，用二氯甲烷(3×300ml)萃取。有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩获得18.64g(94％)白色固体产物。
步骤2.合成异丁氧基羰基-环己基甘氨酰基-3，4-亚异丙基脯氨酸(iBoc-G(Chx)-P[3，4-(diMe-环丙基)]-OH) a)偶合步骤iBoc-G(Chx)-OH(890mg，3.45mmol)的乙腈(20mL)溶液中加入HATU(1.33g，3.5mmol)、HOAt(476mg，3.5g)，然后加入二异丙基乙胺(2.5mL，14mmol)。2分钟后，加入3，4-亚异丙基脯氨醇(485mg，3.43mmol)，搅拌反应混合物过夜。加入饱和碳酸氢钠水溶液后用乙醚和乙酸乙酯萃取。干燥合并的有机层，过滤并浓缩。残余物用快速色谱法提纯，洗脱时用1∶1乙酸乙酯/己烷获得纯二肽醇iBoc-G(Chx)-3，4-亚异丙基脯氨醇(870mg，2.3mmol，67％)。
b)琼斯氧化步骤二肽醇iBoc-G(Chx)-3，4-亚异丙基脯氨醇(100mg，0.26mmol)的丙酮(2mL)溶液在0℃搅拌下于5分钟内滴加琼斯试剂(300μL)。[琼斯试剂用三氧化铬(13.4g)和浓硫酸(11.5mL)用水稀释至总体积为50mL制备]。在0℃搅拌3小时后，加入异丙醇(500μL)，继续搅拌10分钟。用水(20mL)稀释反应混合物，用乙酸乙酯(3×70mL)萃取。将合并的有机层干燥，过滤并浓缩获得二肽iBoc-G(Chx)-3，4-亚异丙基脯氨酸(100mg，0.25mmol，96％)。
实施例X.合成N-Cbz-3，4-桥亚甲基脯氨酸 步骤1.合成N-苄基-3，4-桥亚甲基脯氨醇 将亚苄基原料(J.Org.Chem.1999，64(2)，547)(4.6g，21.4mmol)和氢化锂铝(1.0M的THF溶液，64mL，64mmol)混合物加热回流5小时。冷却到0℃后，在15分钟内滴加饱和硫酸钠水溶液(5mL)小心地猝灭残留的氢化铝。用乙酸乙酯(200mL)稀释混合物，然后通过硅藻土过滤。滤液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩获得粗制的N-苄基氨基醇(3.45g)，它用于下一步无需再提纯。
步骤2.合成N-苄氧基羰基-3，4-桥亚甲基脯氨醇(CBz-P(3，4-CH2)-醇) 粗制的N-苄基氨基醇(3g，14.76mmol)的甲醇(120mL)和浓HCl(1.5mL)溶液与10％Pd/C(300mg)在50psi氢化16小时。将反应混合物过滤除去碳载催化剂，浓缩滤液。将残余物溶于水/二氧六环(100mL)，加入二异丙基乙胺(3.2mL)。加入氯甲酸苄酯(2.76mL，16.2mmol)，搅拌反应物过夜。将反应混合物浓缩，溶于1M HCl(100mL)，用乙酸乙酯(3×200mL)萃取。合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残余物用快速色谱法(1∶3乙酸乙酯/己烷)提纯获得N-Cbz-3，4-桥亚甲基脯氨醇(2.4g)。
步骤3.合成N-苄氧基羰基-3，4-桥亚甲基脯氨酸(CBz-P(3，4-CH2)-OH) N-Cbz-3，4-桥亚甲基脯氨醇(2.2g，8.90mmol)的丙酮(68mL)溶液在0℃搅拌下于5分钟内滴加琼斯试剂(6.6mL)。[琼斯试剂三氧化铬(13.4g)和浓硫酸(11.5mL)用水稀释至总体积为50mL制备]在0℃搅拌3小时后，加入异丙醇(11mL)，再继续搅拌10分钟。反应混合物用水(400mL)稀释，用乙酸乙酯(3×500mL)萃取。合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤并浓缩获得N-Cbz-3，4-桥亚甲基脯氨酸(2.25g，96％)实施例XI.合成Boc-(6S-乙酯基桥亚甲基)脯氨酸 按照公开的方法合成标题化合物Marrinozzi，M.；Nataini，B.；Ni，M.H.；Costantino，G.；Pellicciari R.IL Farmaco(1995)50(5)，327-331。
实施例XII.合成Boc-3-吗啉羧酸 按照公开的方法合成标题化合物Kogami Y.，Okawa，K.Bull.Chem.Soc.Jpn.(1987)60，2963-2965。
实施例XIII.合成N-叔丁氧基羰基2-氮杂-3S-羟基羰基-[2，2，2]-二环辛烷 粗制的2-氮杂-2-(1-苯乙基)-3S-甲氧羰基-[2，2，2]-二环辛-5-烯(10mmol)(Tetrahedron(1992)48(44)9707-9718)和10％碳载钯(1g)的甲醇(30mL)溶液用12N HCl酸化，然后用Parr氢化装置在50psi氢化16小时。过滤反应混合物除去碳载催化剂，浓缩滤液。残余物溶于浓HCl，搅拌过夜。将溶液浓缩，再溶于乙腈(50mL)。加入二异丙基乙胺(3.5mL)和二碳酸二叔丁酯(1g)。将反应混合物搅拌24小时，然后浓缩。残余物溶于CH2Cl2和5％硫酸水溶液。反应混合物用CH2Cl2萃取，浓缩合并的有机层。将残余物溶于10％饱和碳酸氢钠，用乙醚(2×)洗涤，用5％硫酸水溶液酸化。水层用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的乙酸乙酯层经干燥，过滤，浓缩获得N-叔丁氧基羰基2-氮杂-3S-羟基羰基-[2，2，2]-二环辛烷(650mg)。
实施例XIV.合成异丁氧基羰基-环己基甘氨酰基-4，4-二甲基脯氨酸(iBoc-G(Chx)-P(4，4-二甲基)-OH) 步骤1.合成iBoc-G(Chx)-P(4，4-二甲基)-OMe iBoc-G(Chx)-OH(实施例IX步骤1.)(377mg，1.95mmol)的乙腈(7mL)溶液中依次加入HCl·HN-Pro(4，4-二甲基)-OMe(实施例I步骤6)(377mg，1.95mmol)、N-羟基苯并三唑(239mg，1.75mmol)、TBTU(845mg，2.63mmol)和二异丙基乙胺(1.35mL，7.8mmol)。反应混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物浓缩，残留的残余物溶于乙酸乙酯。有机层用每份10ml的饱和碳酸氢钠溶液、1N盐酸溶液和盐水洗涤两次。有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩获得白色固体(612mg，79％)。
步骤2.合成iBoc-G(Chx)-P(4，4-二甲基)-OH 以上步骤1获得的甲酯(612mg，1.54mmol)的甲醇(6ml)溶液在存在2M氢氧化锂(1.16ml)下皂化3小时。减压除去甲醇，残余物用乙酸乙酯稀释，用1N盐酸酸化至pH＝2。将各层分离，有机层用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。
实施例XV.合成L-苯基甘氨酸二甲基酰胺 步骤1.合成N-苄氧基羰基-L-苯基甘氨酸二甲基酰胺(CBz-Phg-NMe2)
将N-苄氧基羰基-L-苯基甘氨酸(25g，88mmols)溶于THF(800mL)并冷却至-10℃。加入N-甲基吗啉(9.7mL，88mmols)和氯甲酸异丁酯(11.4mL ，88.0mmols)，将混合物搅拌1分钟。加入二甲胺(100mL，2M的THF溶液)，将反应物加温至室温。过滤混合物，真空浓缩滤液获得黄色油状物N-苄氧基羰基-L-苯基甘氨酸二甲基酰胺(32.5g)。
步骤2.合成L-苯基甘氨酸二甲基酰胺(H-Phg-NMe2)将以上获得的N-苄氧基羰基-L-苯基甘氨酸二甲基酰胺(32.5g)溶于甲醇(750ml)，加入10％活性碳载钯(3.3g)。此混合物用Parr装置在35psi氢气氛下氢化2小时。过滤反应混合物，真空除去溶剂，残余物用甲醇-己烷重结晶获得乳白色固体苯基甘氨酸二甲基酰胺(26g)。通过HPLC分析2，3，4，6-四-O-乙酰基吡喃葡萄糖基硫代异氰酸酯衍生物测定此产物的对映体过量(ee)＞99％。
实施例XVI.合成(1-甲基环己基)甘氨酸
步骤1.1-甲基-1-羟甲基环己烷 1-甲基-L-羟基羰基环己烷(10g，70mmol)的四氢呋喃(300mL)溶液在0℃于90分钟内加入1M乙硼烷的四氢呋喃(200mL，200mmol)溶液。除去冷却浴，反应混合物在室温下搅拌2天。在冷却下，90分钟内缓慢地加入饱和硫酸氢钠(10mL)猝灭残留硼烷。再加入饱和硫酸氢钠(200mL)，搅拌20分钟后除去水层。有机层用水和饱和氯化钠洗涤，干燥，过滤并浓缩。残余物用快速色谱法(含20％乙醚的己烷)提纯获得1-甲基-1-羟甲基环己烷(6.17g，48mmol，69％)。
步骤2.1-甲基环己基甲醛 1-甲基-1-羟甲基环己烷(6.17g，48mmol)和三乙胺(20.1mL，144mmol)的二氯甲烷(150mL)溶液在0℃于15分钟内加入吡啶三氧化硫络合物(22.9g，144mmol)的二甲基亚砜(150mL)溶液。在2小时内将冷却浴加温至室温，本发明期间将反应混合物倾入冰盐水(400mL)。将各层分离，水层用二氯甲烷(200mL)萃取。合并的有机层用己烷(600mL)稀释，然后用1M HCl(2×150mL)、饱和氯化钠(2×100mL)洗涤，干燥，过滤并浓缩。残余物用快速色谱法提纯获得1-甲基环己基甲醛(1.77g，13.8mmol，29％)。
步骤3.合成N-甲酰基-N-葡萄糖基-1-甲基环己基-叔丁基酰胺 合成2，3，4-三-O-新戊酰-D-阿拉伯糖基胺按照公开的方法进行(Kunz.H.；Pfrengle，W.；Ruck，K.；Wilfried，S.Synthesis(1991)1039-1042)。
1-甲基环己基甲醛(1.17g，8.34mmol)、2，3，4-三-O-新戊酰-D-阿拉伯糖基胺(8.3g，20.7mmol)、甲酸(850μL，22.2mmol)和叔丁基胩(2.4mL，21.2mmol)的四氢呋喃(170mL)溶液在-30℃加入0.5M氯化锌的四氢呋喃(41mL，20.57mmol)溶液。将溶液在-20℃搅拌3天，然后浓缩。残余物用CH2Cl2(500mL)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液(2×500mL)、水(500mL)洗涤。将有机层干燥，过滤并浓缩获得澄清油状物。用快速色谱法(含20％乙酸乙酯的己烷)获得纯产物(4.3g，6.6mmol，33％)。
步骤4.合成(1-甲基环己基)甘氨酸
将以上步骤3获得产物(4.3g，6.6mmol)的二氯甲烷(30mL)和饱和无水甲醇的HCl(30mL)溶液搅拌过夜。浓缩溶液，残余物溶于水(100mL)，然后用戊烷(2×100mL)洗涤。浓缩水层，残余物溶于6N HCl(50mL)，加热回流30小时。浓缩溶液获得粗制的(1-甲基环己基)甘氨酸盐酸盐(790mg，3.82mmol，58％)。
实施例XVII.合成(4，4-二甲基环己基)甘氨酸 步骤1.合成4，4-二甲基环己酮 将4，4-二甲基环己-2-烯-1-酮(12mL，91.2mmol)和Degussa型10％碳载钯(2g)的混合物在40psi氢化18小时。将混合物过滤并浓缩(1H NMR显示比例为5∶3的酮和醇混合物)。将混合物溶于丙酮(400mL)，冷却至0℃。在30分钟内加入琼斯试剂(40mL)，然后除去冷却浴。2天后，蒸去过量的丙酮，将所得残余物溶于水和乙醚。乙醚层用水洗涤至无色，干燥，过滤并浓缩获得4，4-二甲基环己酮(7.4g，58.6mmol，64％)。
步骤2.合成4，4-二甲基环己基甲醛的甲基烯醇醚 甲氧基甲基三苯基氯化鏻(8.6g)的四氢呋喃(125mL)溶液在0℃于10分钟内加入正丁基锂(1.6M的己烷溶液，14.3mL)。在30分钟后，将反应混合物冷却至-78℃，在20分钟内加入4，4-二甲基环己酮(2.45g，19.1mmol)的四氢呋喃(50mL)溶液。1小时后除去冷却浴，将反应混合物缓慢地加温至0℃。反应物用饱和氯化铵(50mL)、乙酸乙酯(100mL)和己烷(100mL)稀释。有机层用水和盐水洗涤，干燥过滤并浓缩。将残余物与己烷(70mL)搅拌10分钟，过滤。浓缩滤液，用色谱法(含25％乙酸乙酯的己烷)获得标题化合物(1.925g，12.5mmol，65％)。
步骤34，4-二甲基环己基甲醛 将4，4-二甲基环己基甲醛的甲基烯醇醚(1.925g，12.5mmol)(以上步骤II)、四氢呋喃(100mL)和6M HCl(20mL)的溶液在室温下搅拌4小时。反应混合物用己烷、乙醚、盐水和水稀释。将有机层干燥，过滤并浓缩获得4，4-二甲基环己基甲醛(1.0g，7.1mmol，57％)。
步骤4.合成N-甲酰基-N-葡萄糖基-4，4-二甲基环己基-叔丁基酰胺 4，4-二甲基环己基甲醛(1.17g，8.34mmol)、2，3，4-三-O-新戊酰-α-D-阿拉伯糖基胺(3.43g，8.55mmol)、甲酸(350μL，9.17mmol)和叔丁基胩(990μL，8.76mmol)的THF(70mL)溶液在-30℃加入0.5M氯化锌的四氢呋喃(17mL，8.5mmol)溶液。将溶液在-20℃搅拌2天，然后浓缩。残余物用二氯甲烷(200mL)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液(2×200mL)、水(200mL)洗涤。将有机层干燥，过滤并浓缩获得澄清油状物。用快速色谱法(含20％乙酸乙酯的己烷)获得纯产物(2.1g，3.3mmol，39％)。
步骤5.合成(4，4-二甲基环己基)甘氨酸 将以上步骤4获得的Ugi产物(2.1g，3.3mmol)的二氯甲烷(20mL)和饱和无水甲醇的HCl(20mL)的溶液搅拌过夜。将溶液浓缩，残余物溶于水(100mL)，然后用戊烷(2×100mL)洗涤。浓缩水层，将残余物溶于6N HCl(40mL)并加热回流30小时。浓缩溶液获得粗制的(1-甲基环己基)甘氨酸盐酸盐(300mg，1.36mmol，41％)。
实施例XVIII.合成Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OH 步骤1.制备Boc-正缬氨醇 将Boc-正缬氨酸(25.0g，0.115mol)的四氢呋喃(461mL)溶液冷却至0℃，滴加硼烷/四氢呋喃络合物(461mL 1.0M的四氢呋喃溶液)。在0℃经过1小时后，将溶液在1.5小时内加温至室温。TLC指示反应完成。加入甲醇猝灭反应。浓缩溶液获得泡沫浆状标题化合物(22.56g，96％)。产物的TLC显示获得满意的纯度。Rf＝0.34(40％乙酸乙酯/己烷)。
步骤2.制备Boc-正缬氨醛 Boc-正缬氨醇(7.77g，38mmol)的无水二甲基亚砜(153mL)和甲苯(153mL)溶液中加入EDC(73.32g，382mmol)。将溶液冷却至0℃后，滴加二氯乙酸(15.8mL，191mmol)。加入完毕后，将反应物搅拌15分钟。在2小时内将溶液加温至室温。浓缩反应混合物以除去甲苯，然后溶于乙酸乙酯。溶液依次用1N硫酸氢钠、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩获得粗制的Boc-正缬氨醛，它直接用于下一步骤。TLC Rf＝0.84(40％乙酸乙酯/己烷)。
步骤3.合成Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OEt 粗制的Boc-正缬氨醛(4.18g，20.77mmol)的二氯甲烷(83mL)溶液中加入异氰基乙酸乙酯(2.72ml，24.93mmol)和吡啶(6.72ml，83.09mmol)。将溶液冷却至0℃后，滴加三氟乙酸(4.15ml，41.54mmol)。搅拌1小时后，将溶液在室温下搅拌18小时，同时在无盖容器中的反应混合物在室温下蒸发除去溶剂。将反应混合物浓缩，然后溶于乙酸乙酯。溶液依次用1N硫酸氢钠、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤后浓缩。残余物用快速色谱法提纯，洗脱时用20％-40％乙酸乙酯/己烷获得2.8g黄色浆状标题化合物。用低分辨率质谱证实存在所需要的产物(MH+333)。
步骤4.合成Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OH 将获得的产物(Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OEt)(1.52g，4.70mmol)溶于乙醇(23ml)，用1N氢氧化锂(18.81ml)在室温下皂化2小时。将反应混合物用Dowex_50 WX8离子交换树脂酸化至pH≌2，搅拌20分钟后过滤。将树脂用乙醇和水充分洗涤，合并的滤液浓缩获得白色泡沫状物(0.48g，33％)。
实施例XVIV.合成(2R，3S，4S，5S)-N-CBz-3-氨基-2-羟基-4，5亚甲基-己酸叔丁酯 步骤1 二乙基膦酰基乙酸叔丁酯(4.7mL，20mmol)溶于THF(50mL)的溶液在-78℃加入1.6M正丁基锂的己烷(12.4mL)溶液。30分钟后，在10分钟内加入(1S，2S)-2-甲基环丙基甲醛(1g，12mmol)(Barrett，A.G.M.；Doubleday，W.W.；Kasdorf，K.；Tustin，G.J.，J.Org.Chem.(1996)61，3280)的乙醚(100mL)溶液。将反应混合物加温至0℃2小时，然后加温至6℃12小时。反应物用饱和氯化铵(20mL)猝灭，分出有机层，用50mL盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩获得3.5g澄清油状物。用快速色谱法(含20％乙酸乙酯的己烷)获得纯的不饱和叔丁酯(1.4g)。
步骤2 氨基甲酸苄酯(3.55g，23.5mmols)的正丙醇(24mL)溶液中加入氢氧化钠(900mg，22.7mmol)的水(48mL)溶液，接着加入次氯酸叔丁基酯(2.57mL，22.7mmol)。在15分钟后，将反应物冷却至0℃，加入(DHQ)2PHAL(350mg，0.45mmol)的正丙醇(24mL)溶液，接着加入上述不饱和叔丁酯(1.4g)的正丙醇(48mL)溶液。最后加入锇酸钾(110mg，0.30mmol)的水(2mL)溶液，溶液即刻形成深绿色，持续4小时。在6小时后，加入饱和硫酸钠(50mL)，混合物用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。快速色谱法(含20％乙酸乙酯的己烷)获得所需要的cBz保护氨基的叔丁酯白色固体(316mg)。
步骤3
将CBz保护氨基的叔丁酯(316mg，0.9mmol)和32mg 10％碳载钯在9mL甲醇中的混合物氢化8小时。过滤混合物并浓缩获得为澄清油状物的游离胺(195mg)。
实施例XX.合成1R，氯甲酸2-二甲基丙酯 商业上可得到的2R-羟基-3-甲基丁烷(410mg，4.65mmol)中加入20％碳酰氯的甲苯(1mL，2mmol)溶液。将溶液搅拌6小时产生氯甲酸酯(2mmol)，将它立即直接与需要的胺反应。S-异构体按照同样的方法制备。
II)典型的液相合成HCV抑制剂实施例XXI.液相合成iBoc-G(Chx)-Pro(4，4-二甲基)-Leu-(CO)-Gly-Phg-二甲基酰胺
步骤1.合成叔丁氧基羰基-亮氨醛(Boc-Leu-CHO) 商业上可获得的(Advanced Chem Tech)Boc-L-亮氨醇(O.78g，3.6mmol)的无水二氯甲烷(17.5ml)溶液中加入三乙胺(2ml，14.36mmol)，将混合物冷却至O℃。加入二甲基亚砜(17.5ml)，接着加入吡啶三氧化硫络合物(2.3g，14.36mmol)，将反应物搅拌2小时。用TLC(1∶1乙酸乙酯∶己烷)确认反应完成。浓缩反应混合物，残余物用乙酸乙酯稀释。乙酸乙酯层用1M盐酸(2×5ml)洗涤，接着用饱和碳酸氢钠溶液(2×75ml)和盐水(75ml)洗涤。干燥(硫酸钠)有机层，过滤并浓缩获得775mg产物。
步骤2.合成Boc-2-羟基-3-氨基-5-甲基己酰基-甘氨酸乙酯(Boc-Leu-(CHOH)-Gly-OEt) 溶液Boc-亮氨醛(0.77g，3.59mmol)的无水二氯甲烷(24ml)溶液中加入无水吡啶(1.16ml，14.36mmol)和异氰基乙酸乙酯(O.4ml，4.66mmol)。将反应混合物冷却至O℃，在2分钟内加入三氟乙酸(O.55ml，7/18mmol)。将反应混合物盖住，在4℃搅拌4天，在室温下搅拌1天。反应混合物用二氯甲烷(350ml)稀释，用每份75ml的1M盐酸、饱和碳酸氢钠和盐水各洗涤2次。将有机层干燥，过滤并浓缩。所得残余物在2”×6”硅胶柱用快速色谱法提纯，先用含10％乙酸乙酯的己烷(800ml)、接着用1∶1乙酸乙酯∶己烷(800ml)。合并产物相关部分，浓缩获得980mg(79％)产物。
步骤3.合成Boc-Leu-(CHOH)-Gly-OH Boc-Leu-(CHOH)-Gly-Oet(0.98g，2.83mmol)的乙醇(11.3ml)溶液中加入2M氢氧化锂(4.25ml)，将反应物在室温下搅拌5小时。减压除去乙醇，水层用乙酸乙酯稀释。有机层用1M盐酸洗涤，接着用盐水洗涤，干燥，过滤并浓缩获得775mg(86％)白色固体产物。
步骤4.合成Boc-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺 Boc-Leu-(CHOH)-Gly-OH(0.37g，1.18mmol)的乙腈(23ml)溶液中依次加入苯基甘氨酸二甲基酰胺(实施例XV步骤2获得)、EDC(0.34g，1.76mmol)、N-羟基苯并三唑(HOBt)(0.18g，1.18mmol)和二异丙基乙胺(DIEA)(0.82ml，4.7mmol)，将反应物在室温下搅拌18小时。浓缩反应混合物，残余物用乙酸乙酯稀释，依次用每份75ml的1M盐酸、饱和碳酸氢钠和盐水各洗涤两次。然后干燥有机层，过滤并浓缩。粗产物在2”×6”硅胶柱用快速色谱法提纯，先用4∶1乙酸乙酯∶己烷(700ml)、接着用乙酸乙酯(1000ml)和含10％甲醇的二氯甲烷(600ml)洗脱。合并产物相关部分，浓缩获得445mg(80％)白色固体。
步骤5.合成H-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺三氟乙酸盐 Boc-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺(70mg，0.146mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入三氟乙酸(1ml)，反应物在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩，在下一步骤中使用无需再提纯。
步骤6.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4，4-二甲基)-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺 iBoc-G(Chx)-P(4，4-diMe)-OH(实施例XIV步骤2)(53mg，0.148mmol)的乙腈(3ml)溶液中依次加入TFA·2HN-Leu(CHOH)-Gly-Phg-NMe2(61mg，0.148mmol)、N-羟基苯并三唑(HOBt)(23mg，0.148mmol)、TBTU(71.5mg，0.222mmol)和二异丙基乙胺(103 1，0.593mmol)。反应物在室温下搅拌18小时，浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯，然后用1M盐酸(2×5ml)、饱和碳酸氢钠溶液(2×5ml)和盐水(2×5ml)洗涤。干燥有机层，过滤并浓缩。产物(100mg)在下一步骤中使用无需再提纯。
步骤7.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4，4-二甲基)-Leu-(CO)-Gly-Phg-二甲基酰胺 iBoc-G(Chx)-Pro(4，4-二甲基)-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺(30mg，0.04mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入商业性获得的Dess-Martin试剂(Omega Chemical Company Inc.)(67.8mg，0.16mmol)，将反应物在室温下搅拌90分钟。浓缩反应混合物，将残余物在5％硫代硫酸钠中搅拌。然后将其用二氯甲烷稀释，分出各层。有机层用硫代硫酸钠(4×3ml)洗涤，接着用水和盐水洗涤。有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗产物溶于己烷和异丙醇，在正相Kromasil 5硅胶柱上(Phenomenex，250×21.20mm，100埃孔径，5μm胶粒)用HPLC提纯，用含0-25％异丙醇的己烷(25ml/分钟)进行30分钟梯度洗脱。合并产物相关部分，浓缩。用水冷冻干燥获得6.7mg白色粉末。用低分辨率质谱确认所需要的质谱(MH+＝741.4)。
III)固相合成固相合成可用于小量生产本发明的某些化合物。与常规固相合成肽一样，用于固相合成肽基酮酰胺的反应釜包括一个反应容器，反应容器至少有一面可渗透溶剂以及溶解的试剂，但不能渗透所选粒径的合成树脂。这样的反应釜包括带有烧结玻璃滤板的玻璃固相反应容器、带有滤板的聚丙烯管或柱、或者由Irori Inc.，San Diego CA生产的KansTM反应器。反应釜类型根据所需要的固相树脂体积选择，不同类型的反应釜可用在合成的不同阶段。下面的方法将在接下来的实施例中引用方法A偶合反应在树脂的N-甲基吡咯烷(NMP)(10-15mL/克树脂)悬浮液中加入N-Fmoc氨基酸(2eq)、HOAt(2eq)、HATU(2eq)和二异丙基乙胺(4eq)。让混合物反应4-48小时。将反应物排出，树脂依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和乙醚(用10-15mL溶剂/克树脂)洗涤。然后真空干燥树脂。
方法B去除Fmoc保护Fmoc-保护的树脂用20％哌啶的二甲基甲酰胺(10mL试剂/g树脂)处理30分钟。将反应物排出，树脂依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和乙醚(10mL溶剂/克树脂)洗涤。
方法C去除Boc保护Boc-保护的树脂用1∶1的二氯甲烷和三氟乙酸混合物处理20-60分钟(10mL溶剂/克树脂)。将反应物排出，树脂依次用二氯甲烷、二甲基甲酰胺、5％二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和二甲基甲酰胺(10mL溶剂/克树脂)洗涤。
方法D缩氨基脲水解将树脂悬浮于由三氟乙酸∶丙酮酸∶二氯甲烷∶水9∶2∶2∶1组成的裂解混合物(10mL/g树脂)处理2小时。将反应物排出，此步骤再重复3次。树脂依次用二氯甲烷、水和二氯甲烷洗涤，真空干燥。
方法EHF裂解经干燥的肽-nVal(CO)-G-O-PAM树脂(50mg)置于包含一根小型搅拌棒的HF容器。加入清除剂苯甲醚(总体积的10％)。在存在谷氨酸和半胱氨酸氨基酸下，还加入苯硫基甲烷(10％)和1，2-乙二硫醇(0.2％)。然后将HF容器安装在HF仪器(ImmunoDynamics)，系统充溢氮气5分钟。然后将其用干冰/异丙醇浴冷却至-78℃。20分钟后，蒸馏HF至所需体积(10mL HF/g树脂)。让反应物在0℃继续反应1.5小时。用氮气逐步移出所有HF。然后将二氯甲烷加入树脂中，搅拌此混合物5分钟。接着加入20％的乙酸水溶液(4mL)。搅拌20分钟后，树脂用多孔漏斗过滤，减压除去二氯甲烷。残余物和混合物用己烷(2×)洗涤除去清除剂。同时，将树脂在1mL甲醇中浸湿。将水层(20％HOAc)返回树脂中，将混合物搅拌5分钟后过滤。减压除去甲醇，冷冻干燥水层，然后将肽溶于10-25％甲醇(包含0.1％三氟乙酸)，用反相HPLC提纯。
实施例XXII丙型肝炎抑制剂的典型的固相合成(iBoc-G(Chx)-P(4t-NHSO2Ph)-nV-(CO)-G-G(Ph)-NH2)
步骤1.合成Fmoc-nV-(dpsc)-Gly-OHA)合成异氰基乙酸烯丙酯(以下的步骤a-b)a)合成异氰基乙酸钾盐 将异氰基乙酸乙酯(96.6ml，0.88mol)滴加入乙醇(1.5L)和氢氧化钾(59.52g，1.0mol)的冷冻溶液。将反应物缓慢地加温至室温。2小时后，用玻璃漏斗滤出沉淀产物，用几份冷冻乙醇洗涤。因此获得的异氰基乙酸的钾盐经过真空干燥获得金黄褐色固体(99.92g，91.8％)。
b)合成异氰基乙酸烯丙酯 步骤a产物(99.92g，0.81mol)溶解于乙腈(810ml)中，加入烯丙基溴(92ml，1.05mol)。加热回流4小时后获得深褐色溶液。将反应混合物浓缩，残余物溶于乙醚(1.5L)，用水(500ml)洗涤三次。干燥有机层，过滤，浓缩获得深褐色浆状物。粗产物在7mm Hg(98℃)下真空蒸馏提纯获得澄清的油状物(78.92g，78％)。NMRδppm(CDCl3)5.9(m，1H)，5.3(m，2H)，4.7(d，2H)，4.25(s，2H)。
B)合成9-芴基甲氧羰基-正缬氨醛(以下步骤a-c)a)合成9-芴基甲氧羰基-L-正缬氨酸甲酯(Fmoc-nVal-OMe)
商业获得性Fmoc-正缬氨酸(25g，73.75mmol)的无水甲醇(469ml)冷冻溶液在1小时内加入亚硫酰氯(53.76ml，737.5mmol)。TLC用乙酸乙酯经过1小时后确认反应完成(Rf＝0.85)。将反应混合物浓缩，残余物溶于乙酸乙酯。有机层用每份200ml的饱和碳酸氢钠、盐水洗涤几次。干燥有机层，过滤，浓缩获得定量收率的白色固体Fmoc-norVal-OMe(26.03g)。NMRδppm(CD3OD)7.7(m，2H)，7.6(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，4.3(m，2H)，4.1(m，2H)，3.7(s，3H)，1.7(m，1H)，1.6(m，1H)，1.4(m，2H)，0.95(t，3H)。
b)合成9-芴基甲氧羰基-正缬氨醇(Fmoc-nValinol) Fmoc-nVal-OMe(26.03g，73.75mmol)的四氢呋喃(123ml)和甲醇(246ml)溶液中加入氯化钙(16.37g，147.49mmol)。将反应混合物冷却至0℃，分几批加入硼氢化钠(11.16g，294.98mmol)。在获得的稠糊状物中加入甲醇(500ml)，反应物在室温下搅拌90分钟。TLC用2∶3乙酸乙酯∶己烷确认反应完成(Rf＝0.25)。反应通过缓慢加入0℃的100ml水猝灭。减压除去甲醇，保留的水相用乙酸乙酯稀释。有机层用水(3×500ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(3×500ml)和盐水(500mol)洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤并浓缩获得白色固体(21.70g，90.5％)。NMRδppm(CD3OD)7.8(m，2H)，7.7(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，4.3-4.5(m，2H)，4.2(m，1H)，3.6(s，1H)，3.5(s，2H)，1.5(m，1H)，1.3-1.4(m，3H)，0.99(m，3H)。
c)合成9-芴基甲氧羰基-正缬氨醛(Fmoc-nVal-CHO) 在Fmoc-正缬氨醇(21.70g，66.77mmol)的二氯甲烷(668ml)溶液中加入三乙胺(37.23ml，267mmol)，将溶液冷却至0℃。吡啶三氧化硫络合物(42.51g，267mmol)的二甲基亚砜(96ml)悬浮液加入到上述的冷冻溶液中。1小时后，TLC用2∶3乙酸乙酯∶己烷确认反应完成。减压除去二氯甲烷，将残余物溶于乙酸乙酯中，用水(2×50ml)、1N饱和硫酸氢钠(2×50ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(2×50ml)和盐水(50ml)洗涤。浓缩有机层获得白色固体。获得理论产量(21.57g)，反应物直接用于下一步骤而无需再提纯。
C)合成二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸盐(以下的步骤a-b)a)合成Boc-氨基脲-4-基二苯基甲烷 羰基二咪唑(16.2g，0.10mol)的二甲基甲酰胺(225ml)溶液在30分钟内滴加肼基甲酸叔丁酯(13.2g，0.100mol)的二甲基甲酰胺(225ml)溶液。在接下来的30分钟内加入二苯基甲胺(18.3g，0.10mol)。将反应物在室温下搅拌1小时。加入水(10ml)后将混合物减压浓缩至约150ml。将此溶液倾入水(500ml)中，用乙酸乙酯(400ml)萃取。乙酸乙酯相用每份75ml的1N HCl、H2O、饱和碳酸氢钠溶液和氯化钠各洗涤2次，用硫酸镁干燥。将混合物过滤，浓缩溶液获得白色泡沫状产物29.5g(85％收率)。所得产物可以用乙酸乙酯/己烷重结晶提纯，但是上述产物纯度足以在下一步直接使用mp 142-143℃。1HNMR(CDCl3)d 1.45(s，9H)，6.10(dd，2H)，6.42(s，1H)，6.67(bs，1H)，7.21-7.31(m，10H)。C19H23N3O3的分析值C，66.84；H，6.79；N，12.31。实测值C，66.46；H，6.75；N；12.90。
b)合成二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸盐 Boc-氨基脲-4-基二苯基甲烷(3.43g，10mmol)的二氯甲烷(12.5ml)溶液在室温下用三氟乙酸(12.5ml)处理，搅拌30分钟。将溶液滴加到75ml乙醚，过滤收集所得固体(2.7g，80％)。mp 182-184℃。1H NMR(CD3OD)d 6.05(s，1H)，7.21-7.35(m，10H)。13C NMR(CD3OD)d57.6，118.3(q，CF3)，126.7，127.9，141.6，156.9，160.9(q，CF3CO2H)。
D)合成Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-CHO(步骤1B)(5.47g，16.90mmol)的二氯甲烷(170ml)溶液中加入异氰基乙酸烯丙酯(步骤1A)(2.46ml，20.28mmol)和吡啶(5.47ml，67.61mmol)。将反应混合物冷却至0℃，滴加三氟乙酸(3.38ml，33.80mmol)。将反应物在0℃搅拌1小时，然后在室温下搅拌48小时。TLC采用乙酸乙酯确认反应完成。将反应混合物浓缩，并用快速色谱法(含20％-70％乙酸乙酯的己烷)提纯。合并包含所需产品部分，浓缩获得白色泡沫物(6.88g，87.3％)。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷显示出一个斑点(Rf＝0.37)。NMRδppm(CD3OD)7.8(m，2H)，7.65(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，5.9(m，1H)，5.1-5.4(m，2H)，4.55-4.65(m，2H)，4.3-4.4(m，2H)，4.15-4.25(m，1H)，4.01(s，1H)，3.9-4.0(m，3H)，1.5-1.6(m，2H)，1.35-1.45(m，3H)，0.9(m，3H)。
E)合成Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O烯丙基(步骤D)(5.01g，10.77mmol)的二甲基亚砜(100ml)和甲苯(100ml)溶液中加入EDC(20.6g，107.7mmol)。将反应混合物冷却至0℃，滴加二氯乙酸(4.44ml，53.83mmol)。反应物在0℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌1小时。再冷却至0℃后，加入水(70ml)，减压除去甲苯。残余物用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠溶液、再用1N硫酸氢钠和盐水各洗涤几次。用硫酸钠干燥有机层，过滤，浓缩。获得理论产量4.99g，反应物直接用于下一步骤而无需再提纯。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷显示出一个斑点(Rf＝0.73)。
F)合成Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O烯丙基(步骤E)(4.99g，10.75mmol)的乙醇(130ml)和水(42ml)溶液中依次加入二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸盐(步骤1C)(7.6g，21.5mmol)和乙酸钠3H2O(1.76g，12.9mmol)。将反应混合物加热回流90分钟。反应的完成用薄层色谱法用1∶1乙酸乙酯∶己烷确认。减压除去乙醇，残余物溶于乙酸乙酯，用1N硫酸氢钠(2×10ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(2×10ml)洗涤、接着用盐水(2×10ml)洗涤。干燥有机层，过滤，浓缩。所得残余物用快速色谱法提纯(含20％到50％乙酸乙酯的己烷)获得白色固体(5.76g，78％)。TLC用50∶50乙酸乙酯/己烷显示出两个斑点(顺式异构体和反式异构体)，Rf＝0.42和0.50。
G)合成Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基(步骤1G)(4.53g，6.59mmol)的四氢呋喃(300ml)溶液中先加入双甲酮(4.62g，32.97mmol)，然后加入四(三苯膦)钯(O)催化剂(0.76g，0.66mmol)。在90分钟后，反应的完成由TLC(9∶1二氯甲烷∶甲醇)确认。将反应混合物浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，用每份50ml的0.1M磷酸二氢钾洗涤三次。有机层用50ml亚硫酸氢钠处理，将两相体系搅拌15分钟。将两相分离，此步骤再重复两次。干燥有机层，浓缩，用快速柱色谱法(含20％-100％乙酸乙酯的己烷，然后用9∶1二氯甲烷∶甲醇)处理。合并纯产物相应部分，浓缩获得白色固体(3.99g，94％)。TLC用9∶1二氯甲烷∶甲醇显示出两个斑点(顺式异构体和反式异构体)。NMRδppm(CD3OD)7.75(m，2H)，7.6(m，3H)，7.2-7.4(m，14H)，6.1-6.2(m，1H)，4.25-4.4(m，2H)，4.1-4.2(m，2H)，3.85(s，2H)，1.6-1.8(m，2H)，1.3-1.5(m，2H)，0.95(t，3H)。
步骤2.合成H-Phg-MBHA树脂 将商业上可得到的MBHA树脂(2.6g，1.12mmol/g，2.91mmol)转移到250ml配置了氮气入口的烧结固相反应容器。将其用每份30ml的二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分洗涤，按照方法A将其与商业上可得到的Fmoc-Phg-OH(2.17g，5.82mmol)偶合18小时，反应效率为99.82％。然后按照方法B将树脂去除Fmoc保护。对少量试样的茚三酮定性分析呈现深蓝色的树脂和溶液，表明反应成功。
步骤3.合成H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 步骤II获得的树脂(2.6g，0.8mmol/g，2.91mmol)按照方法A与Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基(步骤1G)(5.82mmol，3.77g)反应。在18小时后，用茚三酮定量分析显示偶合效率为99.91％。将树脂按照方法B除去Fmoc保护。对少量试样的定性茚三酮分析呈现深蓝色的树脂和溶液，表明反应成功。
步骤4.合成Boc-Pro(4t-NHFmoc)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将化合物H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂(以上的步骤3)(600mg，0.8mmol/g，0.67mmol)转移到滤板型聚丙烯管中，按照方法A与Boc-Pro(4t-NHFmoc)-OH(实施例VI步骤3)(610mg，1.34mmol)偶合。在18小时后，用茚三酮定量分析偶合效率为99.96％。
步骤5.合成Boc-Pro(4t-NH2)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将前一步骤获得的树脂(Boc-Pro(4t-NHFmoc)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂)按照方法B除去Fmoc保护。对小量样品的茚三酮定性分析呈现深蓝色的树脂和溶液，表明反应成功。
步骤6.合成Boc-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将前一步骤获得的树脂(Boc-Pro(4t-NH2)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂)(0.2g，0.22mmol)悬浮于NMP(2ml)，加入2，4，6-三甲基吡啶(0.24ml，1.79mmol)和苯磺酰氯，将反应物振荡18小时。排出溶剂，树脂用每份2ml的二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分洗涤。茚三酮定性分析显示无色的珠粒和溶液。
步骤7.合成Fmoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将前一步骤获得的树脂(Boc-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂)按照方法C除去Boc保护。然后按照方法A偶合Fmoc-G(Chx)(0.17g，0.45mmol)。18小时后，茚三酮定性分析显示无色珠粒，茚三酮定量分析显示偶合效率为99.79％。
步骤8.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将上一步获得的树脂(Fmoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂)按照方法B除去Fmoc保护。对小量样品的茚三酮分析呈现深蓝色的树脂和溶液，表明反应成功。将树脂(0.2g，0.22mmol)悬浮于2ml NMP中，加入氯甲酸异丁酯(0.12ml，0.90mmol)，接着加入二异丙基乙胺(0.31ml，1.79mmol)，将反应混合物在室温下振荡18小时。茚三酮定性分析显示无色的珠粒和溶液，表明反应成功。
步骤9.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA树脂 将前一步骤的化合物(iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂)(200mg)按照方法D进行缩氨基脲水解。
步骤10.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(CO)-Gly-Phg-NH2 将前一步骤的树脂(iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA树脂)(100mg)置于HF裂解条件(方法E)获得所需的粗产物。粗产物用HPLC(2.2×25cm反相柱，包含由300埃孔径的10微米硅胶粒组成的C-18树脂，洗脱用梯度含20-50％乙腈的水)提纯。分析型HPLC(4.6×250mm反相柱，包含由300埃孔径的5微米硅胶粒组成的C-18树脂，洗脱时用25-75％乙腈(包含0.1％三氟乙酸))在13.5分钟显示一个峰。用低分辨率质谱确认所需要的物质(MH+826.4)。
IV.用液相合成制备另外的化合物制备本发明另外的化合物的典型方法如下，由这样的方法制备的化合物列于表5中。
实施例XXIII制备式XXIII化合物 步骤1.
将酮亚胺(ketimime)XXIIIa(50g，187.1mmol)的氮气氛下的无水THF(400mL)溶液搅拌冷却至-78℃，用1M K-tBuO(220mL，1.15当量)的THF溶液处理。将反应混合物加温至0℃，搅拌1小时，用溴甲基环丁烷(28mL，249mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌48小时，真空浓缩。残余物溶于Et2O(300mL)，用HCl水溶液(2M，300mL)处理。所得溶液在室温下搅拌5小时，用Et2O(1L)萃取。水层用NaOH(50％aq.)碱化至pH～12-14，用CH2Cl2(3×300mL)萃取。干燥合并的有机层(MgSO4)，过滤，浓缩获得无色油状的纯胺(XXIIIb，18g)。
步骤2 胺XXIIIb(18g，105.2mmol)的CH2Cl2(350mL)溶液在0℃用二碳酸二叔丁基酯(23g，105.4mmol)处理，在室温下搅拌12小时。在完成反应后(TLC)，将反应混合物真空浓缩，残余物溶于THF/H2O(200ml，1∶1)，用LiOH·H2O(6.5g，158.5mmol)处理，在室温下搅拌3小时。将反应混合物浓缩，碱性水层用Et2O萃取。水层用浓盐酸酸化至pH～1-2，用CH2Cl2萃取。干燥(MgSO4)合并的有机层，过滤，真空浓缩获得无色粘性油状物XXIIIc，它直接用于下一步骤无需任何提纯。
步骤3.

酸XXIIIc(15.0g，62mmol)的CH2Cl2(250mL)溶液用用BOP试剂(41.1g，93mmol)、N-甲基吗啉(27mL)、N，O-二甲基羟胺盐酸盐(9.07g，93mmol)处理，在室温下搅拌过夜。将反应混合物用1N HCl水溶液(250mL)稀释，然后分离过层，水层用CH2Cl2(3×300ml)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，用色谱法(SiO2，乙酸乙酯/己烷2∶3)提纯获得无色固体酰胺XXIIId(15.0g)。
步骤4
酰胺XXIIId(15g，52.1mmol)的无水THF(200mL)溶液在0℃滴加LiAiH4(1M，93mL，93mmol)溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，在0℃用KHSO4溶液(10％aq.)小心地猝灭，搅拌0.5小时。反应混合物用HCl水溶液(1M，150mL)稀释，用CH2Cl2(3×200mL)萃取，合并的有机层用HCl水溶液(1M)、饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥(MgSO4)。将混合物过滤并真空浓缩，获得无色粘性油状物XXIIIe(14g)。
步骤5.

醛XXIIIe(14g，61.6mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液用Et3N(10.73mL，74.4mmol)和丙酮氰醇(10.86g，127.57mmol)处理，在室温下搅拌24小时。将反应混合物真空浓缩，用HCl水溶液(1M，200mL)洗涤，用CH2Cl2(3×200mL)萃取。合并的有机层用H2O、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，真空干燥，用色谱法(SiO2，乙酸乙酯/己烷1∶4)提纯获得无色液体XXIIIf(10.3g)。
步骤6 HCl*饱和的甲醇溶液(其制备是在0℃通入HCl气体至CH3OH(700ml))用上述氰醇XXIIIf处理，加热回流24小时。将反应物真空浓缩获得XXIIIg，它用于下一步骤无需再提纯。
*或者也可使用通过加入AcCl到无水甲醇制备的6M HCl。
步骤7.
上述胺的盐酸盐XXIIIg的CH2Cl2(200mL)溶液用Et3N(45.0mL，315mmol)和Boc2O(45.7g，209mmol)在-78℃处理。然后将反应混合物在室温下搅拌过夜，用HCl(2M，200mL)稀释，萃取入CH2Cl2，干燥(MgSO4)合并的有机层，过滤，真空浓缩，用色谱法(乙酸乙酯/环己烷1∶4)提纯获得羟基酯XXIIIh。
步骤8.
上述甲酯XXIIIh(3g，10.5mmol)的THF/H2O(1∶1)溶液用LiOH·H2O(645mg，15.75mmol)处理，在室温下搅拌2小时。反应混合物用HCl水溶液(1M，15mL)酸化，真空浓缩。真空干燥残余物。
上述酸的CH2Cl2(50mL)和DMF(25mL)溶液用NH4Cl(2.94g，55.5mmol)、EDCl(3.15g，16.5mmol)、HOOBt(2.69g，16.5mmol)和NMM(4.4g，44mmol)处理。反应混合物在室温下搅拌3天。真空除去溶剂，残余物用HCl水溶液(250mL)稀释，用CH2Cl2萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩获得XXIIIi，它直接用于下一步骤。(或者还可使XXIIIf(4.5g，17.7mmol)与H2O2(10mL)水溶液LiOH·H2O(820mg，20.8mmol)在0℃于50mL CH3OH中反应0.5小时直接得到XXIIIi)
步骤9.
将前一步骤获得的XXIIIi的溶液溶于4N HCl的二氧六环溶液，在室温下搅拌2小时。将反应混合物真空浓缩获得固体XXIIIj，它直接使用无需再提纯。
步骤10.
氨基酯XXIIII的制备按照R.Zhang和J.S.Madalengoitia(J.Org.Chem.1999，64，330)的方法制备，除了使Boc保护的氨基酸基团与HCl的甲醇溶液反应而使Boc基团脱去以外。
商品氨基酸Boc-Chg-OH XXIIIk(Senn chemicals，6.64g，24.1mmol)和胺的盐酸盐XXIIII(4.5g，22mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液在0℃用BOP试剂处理，在室温搅拌15小时。将反应混合物真空浓缩，然后用1M HCl水溶液稀释，萃取入EtOAc(3×200mL)。合并的有机层用饱和NaHCO3(200mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，用色谱法(SiO2，乙酸乙酯/环己烷3∶7)获得无色固体XXIIIm(6.0g)。
步骤11.
甲酯XXIIIm(4.0g，9.79mmol)的THF/H2O(1∶1)溶液用LiOH·H2O(401mg，9.79mmol)处理，在室温搅拌3小时。反应混合物用HCl水溶液酸化，真空浓缩获得游离酸。
酸(1.5g，3.74mmol)的DMF/CH2Cl2(1∶150mL)溶液用胺XXIIIj(772mg，3.74mmol)、EDCl(1.07g，5.61mmol)、HOOBt(959mg，5.61mmol)和NMM(2.15mL，14.96mmol)在-10℃处理。反应混合物在0℃搅拌48小时，真空浓缩。残余物用1M HCl水溶液稀释，用CH2Cl2萃取，合并的有机层用NaHCO3水溶液、HCl水溶液、盐水萃取，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩获得黄褐色固体XXIIIn(2.08g)。
步骤12.
酰胺XXIIIn(2.08g，3.79mmol)的甲苯和DMSO(1∶120mL)溶液在0℃用EDCl(7.24g，37.9mmol)和二氯乙酸(2.42g，19.9mmol)处理，在室温搅拌4小时。反应混合物用CH2Cl2稀释，用饱和NaHCO3和盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，然后用色谱法(SiO2，丙酮/己烷3∶7)提纯获得无色固体XXIII。
实施例XXIV制备式XXIV化合物
步骤1.
将Boc-tert-LeuXXIVa(Fluka，5.0g 21.6mmol)的无水CH2Cl2/DMF(50mL，1∶1)溶液冷却至0℃，用胺XXIIII(5.3g，25.7mmol)、NMM(6.5g，64.8mmol)和BOP试剂(11.6g，25.7mmol)处理。将反应物在室温搅拌24小时，用HCl水溶液(1M)稀释，用CH2Cl2萃取。合并的有机层用HCl(水溶液，1M)、饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，用色谱法(SiO2，丙酮/己烷1∶5)提纯获得无色固体XXIVb。
步骤2
将甲酯XXIVb(4.0g，10.46mmol)溶液溶于HCl(4M二氧六环溶液)，在室温下搅拌3小时。将反应混合物真空浓缩获得用于下一步骤的胺盐酸盐。
将上述胺盐酸盐(397mg，1.24mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液冷却至-78℃，用异氰酸叔丁酯(250mg，2.5mmol)处理，在室温下搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩，残余物用HCl水溶液(1M)稀释，用CH2Cl2萃取。合并的有机层用HCl水溶液(1M)、饱和NaHCO3和盐水洗涤。干燥有机层，过滤并真空浓缩，残余物用色谱法(SiO2，丙酮/环己烷1∶4)提纯获得无色固体XXIVc。
步骤3 甲酯XXIVc(381mg，1.0mmol)的THF/H2O(1∶1，5mL)溶液用LiOH·H2O(62mg，1.5mmol)处理，在室温下搅拌3小时。将反应混合物用HCl水溶液酸化，真空浓缩获得游离酸。
酸(254.9mg，0.69mmol)的DMF/CH2Cl2(1∶1，5.0mL)溶液用胺XXIIIj(159mg，0.763mmol)、EDCl(199mg，1.04mmol)、HOOBt(169.5mg，1.04mmol)和NMM(280mg，2.77mmol)在-20℃处理。将反应混合物在-20℃搅拌48小时，真空浓缩。残余物用1M HCl水溶液稀释，用EtOAc萃取，合并的有机层用NaHCO3水溶液、HCl水溶液、盐水萃取，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩获得黄褐色固体XXIVd(470mg)。
步骤4.
酰胺XXIVd(470mg，0.9mmol)的甲苯和DMSO(1∶120mL)溶液在0℃用EDCl(1.72g，9.0mmol)和二氯乙酸(0.37mL，4.5mmol)处理，在0℃搅拌4小时。将反应混合物用CH2Cl2稀释，然后用饱和NaHCO3和盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，用色谱法(SiO2，丙酮/己烷3∶7)提纯获得无色固体XXIV。
实施例XXV制备式XXV化合物
步骤1.
Fmoc-甘氨酸(Bachem，2.0g，6.87mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液用2-苯基-2-丙醇(Aldrich，3.36g，24.7mmol)、DCC(1M的CH2Cl2溶液，8.24mL)、DMAP(167mg，1.37mmol)处理，在室温下搅拌24小时。将反应混合物真空浓缩，用Et2O(100mL)稀释。过滤除去固体，滤液用饱和NaHCO3洗涤。
将有机层干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，用色谱法(SiO2，乙酸乙酯/环己烷1∶5)提纯获得无色粘性液体酯XXVc(1.1g)。
步骤2 XXVc的CH2Cl2(16.0mL)溶液用哌啶(4.0mL)处理，在室温下搅拌0.5小时。将反应混合物真空浓缩，用色谱法(SiO2，丙酮/己烷1∶10-1∶1)提纯获得无色液体胺XXVd(420mg)。
步骤3.
甲酯XXIVc(381mg，1.0mmol)的THF/H2O(1∶1，5mL)溶液用LiOH·H2O(62mg，1.5mmol)处理，在室温下搅拌3小时。将反应混合物用HCl水溶液酸化，真空浓缩获得游离酸。
酸(2.0g，5.5mmol)的DMF/CH2Cl2(1∶1，40.0ml)溶液在-10℃用胺XXIIIg(1.51g，6.8mmol)、EDCl(1.57g，8.25mmol)、HOOBt(1.41g，8.25mmol)和NMM(2.5g，24.7mmol)处理。反应混合物在0℃搅拌48小时，真空浓缩。残余物用1M HCl水溶液(100mL)稀释，用CH2Cl2萃取(3×100mL)。合并的有机层用NaHCO3水溶液、HCl水溶液、盐水萃取，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩获得黄褐色固体XXVe(3.17g)，使用时无需任何提纯。
步骤4
甲酯XXVe(2.5g，4.66mmol)的THF/H2O/CH3OH(1∶1∶1，60mL)溶液用LiOH·H2O(200mg，4.87mmol)处理，在室温下搅拌4小时。反应混合物用HCl水溶液酸化，真空浓缩获得游离酸。
酸(200.0mg，0.38mmol)的DMF/CH2Cl2(1∶1，6.0mL)溶液在-10℃用胺XXVd(78mg，0.4mmol)、EDCl(105mg，0.55mmol)、HOOBt(95mg，0.55mmol)和NMM(150mg，1.48mmol)处理。将反应混合物在0℃搅拌48小时，真空浓缩。残余物用1M HCl水溶液(30mL)稀释，用CH2Cl2(3×30mL)萃取。合并的有机层用NaHCO3水溶液(2×30mL)、HCl水溶液、盐水(30mL)萃取，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩获得黄褐色固体XXVf(240mg)。
步骤5.
XXVf(240mg，0.28mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液用Dess-Martin试剂(Omega，242mg，0.56mmol)处理，在室温下搅拌2小时。在氧化反应完成后(TLC，丙酮/己烷1∶4)，将反应混合物用饱和NaHCO3(20mL)和Na2S2O3(10％水溶液，20mL)稀释。将反应混合物搅拌30分钟，用CH2Cl2(3×30mL)萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3、盐水萃取，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，用色谱法(SiO2，丙酮/己烷1∶5)提纯获得无色固体XXV(122mg)。
实施例XXVI制备式XXVI化合物 步骤1 N-Boc-3，4-脱氢脯氨酸XXVIa(5.0g，23.5mmol)、二碳酸二叔丁酯(7.5g，34.4mmol)和4-N，N-二甲基氨基吡啶(0.40g，3.33mmol)的乙腈(100mL)在室温、搅拌下加入三乙胺(5.0mL，35.6mmol)。所得溶液本发明温度搅拌18小时，然后将其真空浓缩。深褐色残余物用快速色谱法提纯，洗脱时用10-25％乙酸乙酯/己烷获得浅黄色油状产物XXVIb(5.29g，84％)。
步骤2
脱氢脯氨酸XXVIb(10.1g，37.4mmol)、苄基三乙基氯化铵(1.60g，7.02mmol)的氯仿(120mL)溶液在室温搅拌下加入50％氢氧化钠水溶液(120g)。本发明温度剧烈搅拌24小时后，将黑色混合物用CH2Cl2(200mL)和乙醚(600mL)稀释。分离各层后，水溶液用CH2Cl2/Et2O(1∶2，3×600mL)萃取。将有机溶液干燥(MgSO4)，浓缩。残余物用快速柱色谱法(5-20％乙酸乙酯/己烷)提纯获得9.34g(71％)乳白色固体XXVIc。
步骤3 将XXVIc(9.34g，26.5mmol)的CH2Cl2(25mL)和CF3CO2H(50mL)溶液在室温下搅拌4.5小时，然后真空浓缩获得褐色残余物，它用于步骤4中无需再提纯。
步骤4.
将商品浓盐酸(4.5mL)加入步骤3残余物的甲醇(70mL)溶液，所得混合物在油浴中加温到65℃。在18小时后，将混合物真空浓缩获得褐色油XXVIe，它用于步骤5无需再提纯。
步骤5 步骤4的脯氨酸甲酯XXVIe、商品N-Boc-环己基甘氨酸XXVIf(10.2g，40.0mmol)和[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐](HATU)(16.0g，42.1mmol)的DMF(200mL)溶液在0℃搅拌下加入二异丙基乙胺(18.0mL，104mmol)。在冰浴过夜(18h)加温至室温，将反应混合物用EtOAc(600mL)、5％H3PO4(150mL)和盐水(150mL)稀释。有机溶液用5％H3PO4(150mL)、饱和NaHCO3(2×200mL)洗涤，然后干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩。残余物用快速柱色谱法(5-20％乙酸乙酯/己烷)提纯获得3.84g(32％，三步)乳白色固体XXVIg。
步骤6
甲酯XXVIg(5.87g，13.1mmol)和LiOH(1.65g，39.3mmol)的THF/MeOH/H2O(1∶1∶1，90mL)溶液在室温下搅拌4小时。减压除去甲醇和THF。水溶液用1N HCl水溶液(50mL)酸化至pH～2，用固体氯化钠饱和，然后将其用EtOAc(3×150mL)萃取。将有机溶液合并，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩获得白色固体XXVIh(5.8g，定量)。
步骤7 所需要的产物XXIIIi按照实施例XXIII步骤11的方法制备。
步骤8 所需要的产物XXVI按照实施例XXIII步骤12的方法制备。
实施例XXVII制备式XXVII化合物 步骤1 所需要的产物XXVIIa按照实施例XXIII步骤9的方法制备。
步骤2 所需要的产物XXVIIb按照实施例XXIV步骤2的方法制备。
步骤3 所需要的产物XXVII按照实施例XXIII步骤12的方法制备。
实施例XXVIII制备式XXVIII化合物 步骤1 中间体XXVIIIb按照实施例XXIII步骤3-6的方法制备。
步骤2 实施例XXIV步骤2的酸(XXVIIIc)(0.7g)与以上步骤1的产物(0.436g)、HATU(0.934g)和DIPEA(1.64mL)按照实施例IX步骤2a的方法反应获得0.66g所需要的产物XXVIIId。
步骤3 步骤2的产物(0.5g)与Dess-Martin试剂(1g)按照实施例XX步骤7的方法反应。用快速柱色谱法(40％EtOAc，己烷，二氧化硅)提纯获得0.35g产物XXVIIIe。质谱(LCMS)522(M+H+)。
步骤4 步骤4产物(0.3g)中加入1/1 H2O/MEOH溶液(20mL)和NaHCO3固体(242mg，5当量)。在室温下搅拌18小时后，将反应物用EtOAc稀释，将各层分离。水层用1.0N HCl酸化至pH2，用EtOAc萃取。EtOAc层用盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩获得白色粉末产物XXVIIIf(0.26g)。质谱(LCMS)508(M+H+)。
步骤5 将步骤5产物(0.15g)溶于CH2Cl2，使其与HATU(0.137g)、NH4Cl(0.08g，5当量)和DIPEA(0.53mL)反应。在室温下2小时后，反应物用EtOAc稀释，先用10％柠檬酸溶液、再用饱和NaHCO3溶液洗涤。EtOAc层用盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩获得粗制的混合物。用快速柱色谱法(30％丙酮，己烷，二氧化硅)提纯获得所需要的产物XXVIII(0.096g)。质谱(LCMS)507(M+H+)。
实施例XXIX制备式XXIX化合物 步骤1 初始醛(4.0g)的CH2Cl2(75mL)溶液(0℃)中加入乙酸(2.0当量，2.15mL)，接着加入异氰基乙酸甲酯(1.1当量，1.9mL)。然后将反应物逐渐加温至室温。在18小时(过夜)后，反应物用EtOAc稀释，然后用饱和NaHCO3溶液洗涤。EtOAc层用盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩获得粗制混合物。用快速柱色谱法(30-40％EtOAc，己烷，二氧化硅)提纯获得产物XXIXa(4.5g)。
步骤2 XXIXa(4.4g)的THF(100mL)溶液(0℃)中加入26mL(2.2当量)的1.0N LiOH溶液。将反应物本发明温度搅拌2小时，然后加温至室温。在2小时后，反应混合物用1.0N HCl溶液酸化至pH2。加入EtOAc，将各层分离。EtOAc层用盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩获得产物XXIXb(3.7g)。
步骤3 使酸XXIXb与实施例XV的胺按照实施例XXI步骤4介绍的方法反应。然后将所得中间体用HCl按照实施例XXIII步骤9介绍的方法处理获得产物XXIXc。
步骤4 将酸XXVIIIc(2.43g)溶于CH2Cl2，使其与胺XXIXc(2.47g)、HATU(2.5g)和DIPEA(5.8mL)按照前面实施例IX步骤2a介绍的方法获得(用快速柱色谱法(4％MeOH，CH2Cl2，二氧化硅)提纯后)所需要的产物XXIXd(4.35g)。质谱(LCMS)727(M+H+)。
步骤5 使步骤4产物(4.2g)与Dess-Martin试剂(6.4g)按照制备实施例XX步骤7介绍的方法反应。用快速柱色谱法(100％EtOAc，二氧化硅)提纯获得3g最终产物XXIX。质谱(LCMS)725(M+H+)。
实施例XXX制备式XXX化合物
步骤1 使2-(三氟甲基)丙-2-醇(1.28g)与N，N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(3.84g)和Et3N(4.2mL)的无水CH3CN(50mL)溶液反应18小时。将混合物用EtOAc(200mL)稀释，过滤。将滤液用NaHCO3、盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩获得粗制的混合物。用快速柱色谱法(50％EtOAc，己烷，二氧化硅)提纯获得所需要的产物XXXa(0.3g)。
步骤2
实施例XXIX的产物(0.3g)用100mL 4.0N HCl的二氧六环溶液处理。在1小时后，加入200mL Et2O，将所得沉淀滤出，真空干燥获得白色粉末产物XXXb(0.27g)。质谱(LCMS)625(M-HCl+H+)。
步骤3 XXXb(0.05g)的CH2Cl2(5mL)室温溶液中加入DIPEA(0.040mL)、XXXa(1.5当量，0.030g)，接着加入1粒DMAP晶体。在30分钟后，将反应物用EtOAc(20mL)稀释，然后依次用1.5N HCl、NaHCO3、盐水洗涤。EtOAc层用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩获得粗制的混合物。用制备型色谱法(40％丙酮，己烷，二氧化硅)提纯获得所需要的产物XXX(0.044g)。质谱(LCMS)779(M+H+)。
实施例XXXI制备式XXXI化合物 步骤1 XXXb(0.05g)的CH2Cl2(5mL)溶液在室温下加入DIPEA(0.040mL)和异氰酸叔丁酯(1.2当量，0.01mL)。在18小时后，将反应物用EtOAc(20mL)稀释，然后用1.5N HCl、NaHCO3和盐水洗涤。EtOAc层用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩获得粗制的混合物。用制备型色谱法(100％EtOAc，二氧化硅)提纯获得最终产物XXXI(0.021g)。质谱(LCMS)724(M+H+)。
实施例XXXII制备式XXXII化合物 步骤1 实施例XXVIII的产物按照制备实施例XXX步骤2中介绍的方法处理获得产物XXXIIa。质谱(LCMS)407(M-HCl+H+)。
步骤2 使胺XXXIIa与XXXa按照制备实施例XXX步骤3中介绍的方法反应获得所需要的产物XXXII。质谱(LCMS)508(MH+)。
实施例XXXIII制备式XXXIII化合物
步骤1 使胺XXXHa与异氰酸叔丁酯按照实施例XXXI步骤1中介绍的方法反应，获得产物XXXIII。质谱(LCMS)561(M+H+)。
实施例XXXIV制备式XXXIV化合物
步骤1 酯的混合物(6.0g)和分子筛(5.2g)的无水二氯甲烷(35mL)中加入吡咯烷(5.7mL，66.36mmoL)。所得褐色浆状物在N2气氛、室温下搅拌24小时，过滤，然后用无水CH3CN洗涤。将合并的滤液浓缩获得所需要的产物。
步骤2 前一步骤产物的CH3CN(35mL)溶液中加入无水K2CO3、甲代烯丙基氯(2.77g，30.5mmol)、NaI(1.07g，6.7mmoL)。将所得浆状物在室温、N2气氛下搅拌24小时。加入50 mL冰水，接着加入2N KHSO4溶液直到pH为1。加入EtOAc(100mL)，搅拌混合物0.75小时。收集合并的有机层，然后用盐水洗涤，用MgSO4干燥，蒸发获得所需要的产物。
步骤3 将前一步骤产物(2.7g，8.16mmoL)溶于二氧六环(20mL)，用新制备的1N LiOH(9mL)处理。反应混合物在室温、N2气氛下搅拌20小时。将反应混合物溶于EtOAc，然后用H2O洗涤。将合并的水层冷却至0℃，用1N HCl酸化至pH1.65。混浊的混合物用EtOAc(2×100mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，浓缩获得所需要的酸(3.40g)。
步骤4 NaBH(OAc)3(3.93g，18.5mmoL)的CH2Cl2(55mL)悬浮液中加入前一步骤产物的无水CH2Cl2(20mL)和乙酸(2mL)溶液。所得浆状物在室温搅拌20小时。将冰水(100mL)加入到上述浆状物中，搅拌半小时。分出有机层，过滤，干燥，蒸发获得所需要的产物。
步骤5 前一步骤产物(1.9g)的MeOH(40mL)溶液用过量的CH2N2/Et2O溶液处理，搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干获得粗制的残余物。将残余物在硅胶上用色谱法提纯，洗脱用梯度乙酸乙酯/己烷获得1.07g纯的所需产物。
步骤6 前一步骤的产物(1.36g)的无水CH2Cl2(40mL)溶液用BF3.Me2O(0.7mL)处理。反应混合物在室温下搅拌20小时，用饱和NaHCO3(30mL)猝灭，搅拌1/2小时。分离出有机层，合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，浓缩获得粗制的残余物。将残余物在硅胶上用色谱法提纯，洗脱用梯度乙酸乙酯/己烷获得0.88g所需要的化合物。
步骤7 前一步骤产物(0.92g)的MeOH(30mL)溶液在室温下加入10％Pd/C(0.16g)，在室温、1atm压力下氢化。将反应混合物搅拌4小时，浓缩至干获得所需要的化合物。
步骤8 所需要的产物按照实施例XXIII步骤10的方法制备。
步骤9 所需要的酸产物按照实施例XXIV步骤3的方法制备。
步骤10 所需要的产物XXXIV按照实施例XXIX步骤4-5的方法制备。
实施例XXXV制备式XXXV化合物 步骤1 膦酸三乙酯(44.8g)的THF(30mL)溶液在0℃用1M二(三甲硅烷基酰胺)钠的THF溶液(200mL)处理。所得混合物在室温下搅拌0.5小时，然后冷却至0℃。滴加1，4-环己烷二酮乙二醇缩酮(15.6g)的THF(50mL)溶液，所得溶液在室温下搅拌18小时。然后将反应混合物冷却至0℃，用冷柠檬酸水溶液处理，混合物用EtOAc萃取。萃取液用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用盐水洗涤；然后用无水Na2SO4干燥，过滤，将滤液蒸发。残余物在硅胶上用色谱法提纯，洗脱用梯度CH2Cl2/EtOAc，获得标题化合物(21g)，92％收率。质谱(FAB)227.3(M+H+)。
步骤2 将前一步骤产物(20g)溶于EtOH(150mL)，在1atm氢气氛下用10％Pd/C处理3天。过滤混合物，将滤液蒸发获得标题化合物(20.3g)，100％收率。质谱(FAB)229.2(M+H+)。
步骤3 将前一步骤产物(20g)溶于MeOH(150mL)，用LiOH(3.6g)的水(50mL)溶液处理。将混合物搅拌18小时，真空浓缩。将残余物溶于冷水(100mL)，所得溶液用5N HCl酸化至pH2-3，所得混合物用EtOAc萃取。萃取液用无水Na2SO4干燥，过滤，将滤液蒸发获得标题化合物(17.1g)，97％收率。质谱(FAB)201.2(M+H+)。步骤4
1.将前一步骤产物(3.0g)溶于Et2O(150mL)，用Et3N(2.1mL)处理，所得溶液冷却至-78℃。滴加新戊酰氯(1.85mL)，再搅拌0.25小时后，将反应物在0.75小时内加温至0℃，然后再次冷却至-78℃获得用于第二部分反应的混合酸酐溶液。
2.将(S)-4-苄基-2-噁唑烷酮(2.66g)的THF(22mL)溶液冷却至-78℃，滴加1.6M正丁基锂的己烷溶液(9.38mL)。再本发明温度下搅拌0.33小时后，将溶液通过套管转移到第一部分的冷溶液中。将混合物在-78℃搅拌，然后加温至0℃，本发明温度搅拌0.5小时。分出有机层，水层用Et2O萃取，合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，将滤液蒸发。残余物在硅胶上用色谱法提纯，洗脱用梯度己烷/乙酸乙酯(9∶1)获得标题化合物(5.0g)，93％收率。质谱(FAB)360.4(M+H+)。
步骤5 将前一步骤产物(2.7g)溶于THF(25mL)，冷却至-78℃，通过套管转移到-78℃的0.5M二(三甲硅烷基)酰胺钾/甲苯(16.5mL)的THF(25mL)溶液，所得溶液在-78℃搅拌0.75小时。此溶液中通过套管加入预冷至-78℃的trisyl叠氮化物(3.01g)的THF(25mL)溶液。在1.5分钟后，反应物用乙酸(1.99mL)猝灭，将反应物加热至室温，然后搅拌16小时。反应物用EtOAc(300mL)稀释，然后用5％NaCl水溶液洗涤。水相用EtOAc萃取，合并的有机相用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用盐水洗涤；用无水Na2SO4干燥，过滤，将滤液蒸发。残余物在硅胶上用色谱法提纯，洗脱时用乙酸乙酯/己烷(1∶3)获得标题化合物(2.65g)，88％收率。
步骤6 将前一步骤产物(11.4g)溶于95％甲酸(70mL)，在70℃、搅拌下加热0.5小时。真空蒸发溶液，将残余物溶于EtOAc。溶液用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用盐水洗涤；再用无水Na2SO4干燥，过滤，将滤液蒸发。残余物在硅胶上用色谱法提纯获得标题化合物(8.2g)。
步骤7.
将前一步骤产物(8.2g)溶于CH2Cl2(16mL)，用三氟化二乙氨基硫(diethylaminosulfur trifluoride)(DAST，7.00mL)在室温处理3小时。将反应物倾入冰/水(200cc)，用CH2Cl2萃取。萃取液用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用盐水洗涤；再用无水Na2SO4干燥，过滤，将滤液蒸发。残余物在硅胶上用色谱法提纯，洗脱时用乙酸乙酯/己烷(15∶85)，获得标题化合物(4.5g)，52％收率。
步骤8 将前一步骤产物(3.7g)溶于混合物THF(150mL)和水(48mL)，冷却至0℃，依次用30％H2O2(3.95mL)、LiOH·H2O(0.86g)处理。将混合物在0℃搅拌1小时，然后Na2SO3(5.6g)的水(30mL)溶液猝灭，接着用0.5N NaHCO3(100mL)溶液猝灭。将混合物真空浓缩至1/2体积，用水(至500mL)稀释，用CH2Cl2(4×200mL)萃取。水相用5N HCl酸化至pH1-2，用EtOAc(4×200mL)萃取。萃取液用盐水洗涤；然后用无水Na2SO4干燥，过滤，将滤液蒸发获得标题化合物(1.95g)，91％收率，它直接用于下一步骤。
步骤9 将前一实施例产物(2.6g)溶于Et2O(50mL)，滴加CH2N2的Et2O溶液处理直到溶液保持黄色。将溶液搅拌18小时，然后真空蒸发获得标题化合物(2.8)，它直接用于下一步骤。
步骤10 将前一步骤产物(1.95g)溶于MeOH(150mL)，先用甲酸(1.7mL)处理，再在1atm氢气氛下用10％Pd/C(3.3g，Degussa E101型)处理1.5小时。将混合物过滤，蒸发滤液获得为甲酸盐的标题化合物(2.1g)，它直接用于下一步骤。
步骤11 将前一步骤产物(2.1g)溶于1，4-二氧六环(100mL)，加入二碳酸二叔丁酯(1.9g)，接着加入二异丙基乙胺(2.9mL)。将溶液搅拌18小时，真空浓缩。残余物用5％KH2PO4水溶液处理，混合物用EtOAc萃取。萃取液用盐水洗涤；然后用无水MgSO4干燥，过滤，将滤液蒸发。残余物在硅胶上用色谱法提纯，洗脱用梯度CH2Cl2/Et2O获得标题化合物(2.5g)，99％收率。质谱(FAB)307.9(M+H+)。
步骤12 将前一步骤产物(2.5g)溶于1，4-二氧六环(35mL)，用1M LiOH水溶液(17mL)处理，搅拌2小时。混合物用冰/水(125cc)猝灭，混合物用3N HCl酸化至pH3-4，用EtOAc萃取。萃取液用无水MgSO4干燥，过滤，将滤液蒸发获得标题化合物(2.3g)，96％收率。质谱(FAB)294.0(M+H+)。
步骤13 所需要的产物根据实施例XXIII步骤10的方法制备。
步骤14 所需的酸产物按照实施例XXIV步骤3的方法制备。
步骤15 所需的酸产物按照实施例XXIX步骤4的方法制备。
实施例XXXVI.制备式XXXVI和XXXVIII的化合物式XXXVI和XXXVIII的化合物按照以下流程以及利用上述制备实施例11至15制备。
式XXXVIb化合物用式XXXVIa化合物按照以下的已知方法制备 化合物XXXVIa(6.58g，22mmol)的100mL MeOH溶液中加入10％Pd/C(0.8g)和对甲苯磺酸(4.2g)。将反应混合物在室温下氢化过夜。反应混合物通过硅藻土过滤，然后用过量MeOH洗涤。将合并的滤液真空浓缩获得树胶状的标题化合物XXXVIb。按照以上流程的路线并根据制备实施例11-15将XXXVIb转换成XXXVI和XXXVII。
实施例XXXVIII.制备式XXXVIII化合物式XXXVIII化合物利用以下的流程并按照上述制备实施例11至15制备。

实施例XXXIX.合成式XXXIX化合物 步骤1 磺酰氯XXXIXa溶液(按照H.Mcklwain(J.Chem.Soc 1941，75)的方法制备)在-78℃滴加入1.1.当量的叔丁基甲胺和三乙胺的混合物，在室温下搅拌2小时。将反应混合物真空浓缩，用色谱法(SiO2，己烷/丙酮4∶1)提纯获得无色油状磺胺XXXIXb。
步骤2 将Cbz-保护的胺XXXIXb溶液溶于甲醇，用5mol％的Pd/C(5％w/w)处理，在60psi氢化。反应混合物通过硅藻土填料过滤，真空浓缩获得游离胺XXXIXc，其放置时固化。
步骤3 羟基磺胺XXXIXd用合成XXVf的同样方法合成，除了将胺XXVd用XXXIXc替代。粗制的反应混合物直接用于下一反应。
步骤4 使用Dess Martin试剂，按照合成XXV(步骤5)的方法将羟基酰胺XXXIXd氧化成化合物XXXIX。粗制的混合物用色谱法(SiO2，丙酮/己烷3∶7)提纯获得无色固体XXXIX。
检测HCV蛋白酶抑制活性分光光度分析按照R.Zhang等(Analytical Biochemistry，270(1999)268-275，其公开内容通过引用结合到本文中)介绍的方法对本发明化合物进行HCV丝氨酸蛋白酶的分光光度分析。基于蛋白分解显色酯底物的分析适合连续监测HCV NS3蛋白酶活性。底物衍生自其C末端羧基被4个不同发色醇(3-或4-硝基酚、7-羟基-4-甲基-香豆素或4-苯基偶氮酚)之一酯化的NS5A-NS5B连接序列(Ac-DTEDVVX(Nva)(其中X＝A或P)的P侧。下面介绍这些新的分光光度性酯底物的合成、表征和在高通量筛选中的应用，并且详细介绍HCV NS蛋白酶抑制剂的动力学评价。
材料和方法.
材料分析用有关缓冲液的化学试剂得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Missouri)。肽合成试剂得自Aldrich Chemicals、Novabiochem(San Diego，California)、Applied Biosystems(Foster City，California)和Perseptive Biosystems(Framingham，Massachusetts)。人工合成肽，或者用自动ABI 431A型合成仪(Applied Biosystems)合成肽。LAMBDA 12型UV/VIS分光计得自Perkin Elmer(Norwalk，Connecticut)，96孔UV板得自Corning(Corning，New York)。预热均温块(prewarming block)得自USA Scientific(Ocala，Florida)，96孔板涡旋器得自Labline Instruments(Melrose Park，Illinois)。SpectramaxPlus微量滴定板读数仪(带有单色计)得自Molecular Devices(Sunnyvale，California)。
酶制备使用以前公开的方法(D。L。Sali等，Biochemistry，37(1998)3392-3401)制备重组HCV NS3/NS4A异源二聚体蛋白酶(菌株1a)。蛋白浓度使用预先通过氨基酸分析定量的重组HCV蛋白酶标准品通过Biorad染料方法测定。开始分析前，采用Biorad Bio-Spin P-6预填柱使酶贮藏缓冲液(50mM磷酸钠pH8.0，300mM氯化钠，10％甘油，0.05％月桂基麦芽糖苷和10mM DTT)交换为检测缓冲液(25mMMOPS pH6.5，300mM氯化钠，10％甘油，0.05％月桂基麦芽糖苷，5μM EDTA和5μM DTT)。
底物合成与纯化根据R.Zhang等(同上)报道合成底物，合成开始时用标准方法(K.Barlos等，Int.J.Pept.Protein Res.，37(1991)，513-520)使Fmoc-Nva-OH固定在2-氯三苯甲基氯树脂上。随后利用Fmoc化学装配肽，或者人工进行或者采用自动ABI 431型肽合成仪。N-乙酰化且完全保护的肽片断经过10％乙酸(HOAC)和10％三氟乙醇(TFE)的二氯甲烷(DCM)溶液处理30分钟，或者经过2％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液处理10分钟后与树脂断开。共沸蒸发合并的滤液和DCM洗涤液(或者重复用碳酸钠水溶液萃取)，以去裂解时使用的酸。DCM相用硫酸钠干燥后蒸发。
所述酯底物用标准酸-醇偶合方法(K.Holmber等，Acta Chem.Scand.，B33(1979)410-412)装配。肽片段溶解于无水吡啶(30-60mg/ml)，其中加入10摩尔当量发色团和催化量(0.1eq.)对甲苯磺酸(pTSA)。加入二环己基碳二亚胺(DCC，3eq.)启动偶合反应。用HPLC监测产物形成，在室温下反应12-72小时后证实反应完毕。吡啶溶剂通过真空蒸发除去，进一步与甲苯共沸除去。肽酯用95％TFA的DCM溶液去保护2小时，用无水乙醚萃取3次以去除过量发色团。去保护底物在C3或C8柱上通过反相HPLC纯化，用30％-60％乙腈梯度洗脱(用6个柱体积)。HPLC纯化后的总收率约20-30％。电喷雾离子化质谱证实分子量。底物以干粉干燥保藏。
底物及产物光谱用pH6.5检测缓冲液获得底物和相应的发色团产物的光谱。利用多个稀释度以1-cm比色杯于优化非高峰波长(3Np和HMC为340nm，PAP为370nm，4-Np为400nm)检测消光系数。优化非高峰波长的定义为底物和产物之间产生最大吸光度差异((产物OD-底物OD)/底物OD)的波长。
蛋白酶分析在96孔微量滴定板中用200μl反应混合物于30℃进行HCV蛋白酶分析。对NS3/NS4A异源二聚体优化检测缓冲条件(25mM MOPS pH6.5，300mM NaCl，10％甘油，0.05％月桂基麦芽糖苷，5μM EDTA和5μM DTT)(D.L.Sali等，同上)。通常，将150μl的缓冲剂、底物和抑制剂的混合物加入各孔中(DMSO终浓度为4％v/v)，使其于30℃预温育约3分钟。然后用50μl在检测缓冲液中的蛋白酶预热溶液(12nM，30CC)启动反应(终体积为200μl)。用配备有单色器的Spectromax Plus微量滴定板读数仪(采用截止滤光片型板读数仪可获得可接受的结果)，在合适波长(3Np和HMC为340nm，PAP为370nm，4-Np为400nm)在检测时间(60分钟)范围内监测各板的吸光度变化。相对于用作非酶水解对照的无酶空白，在合适波长监测Nva和发色团之间的酯键的蛋白裂解。在30倍底物浓度范围内(约6-200μM)评价底物动力学参数。用线性回归确定初速度，采用非线性回归分析(Mac Curve Fit 1.1，K.Raner)用实验数据拟合Michaelis-Menten方程，获得动力学常数。计算酶变率(kcat)，假定酶全部具有活性。
抑制剂和灭活剂的评价对竟争性抑制剂Ac-D-(D-Gla)-L-I-(Cha)-C-OH(27)、Ac-DTEDVVA(Nva)-OH和Ac-DTEDVVP(Nva)-OH，实验测定固定浓度酶和底物的抑制常数，根据用于竟争性抑制动力学的重排Michaelis-Menten方程vo/vi＝1+[1]o/(Ki*(1+[S]o/Km))，其中vo为非抑制初速度，vi为存在任何已知抑制剂浓度([1]o)抑制剂的初速度，[S]o为所使用的底物浓度；用vo/vi对抑制剂浓度([I]o)作图。用线性回归拟合获得的数据，用获得的斜率1/(Ki*(1+[S]o/Km)计算Ki*值。
在以上各表中给出了获得的本发明不同化合物的Ki*值，其中的化合物按照Ki*范围顺序排列。根据上述试验结果，熟练技术人员显而易见的是，本发明化合物具有良好的NS3-丝氨酸蛋白酶抑制剂作用。
尽管结合上述具体实施方案阐明了本发明，但是本发明的许多替代、改进及其它变化方案对本领域普通技术人员是显而易见的。所有这样的替代、改进及变化方案均属于本发明实质及范畴。
表2



















































表4












表5

















































































































权利要求
1.一种化合物，包括该化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、外消旋体和前体药物，以及所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化合物具有式I所示的通用结构 式I其中Y选自以下部分烷基、烷基-芳基、杂烷基、杂芳基、芳基-杂芳基、烷基-杂芳基、环烷基、烷氧基、烷基-芳氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂环烷氧基、环烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、环烷基氨基和杂环烷基氨基，前提是Y可以任选被X11或X12取代；X11为烷基、链烯基、链炔基、环烷基、环烷基-烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂芳基、烷基杂芳基或杂芳基烷基，前提是X11还可以任选被X12取代；X12为羟基、烷氧基、芳氧基、硫代基、烷硫基、芳硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰氨基、芳基亚磺酰氨基、羧基、烷氧羰基、酰胺基、烷氧羰基氨基、烷氧羰基氧基、烷基脲基、芳基脲基、卤素、氰基或硝基，前提是所述烷基、烷氧基和芳基还可以任选被独立选自X12的部分取代；R1为COR5或B(OR)2，其中R5为H、OH、OR8、NR9R10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6或COR7，其中R7为H、OH、OR8、CHR9R10或NR9R10，其中R6、R8、R9和R10独立选自以下基团H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、环烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、[CH(R1’)]pCOOR11、[CH(R1’)]pCONR12R13、[CH(R1’)]pSO2R11、[CH(R1’)]pCOR11、[CH(R1’)]pCH(OH)R11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’独立选自以下基团H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、芳基-烷基和杂芳烷基；Z选自O、N、CH或CR；W可以存在或者不存在，当W存在时，W选自C＝O、C＝S、C(＝N-CN)或SO2；Q可以存在或者不存在，当Q存在时，Q为CH、N、P、(CH2)p、(CHR)p、(CRR’)p、O、NR、S或SO2；当Q不存在时，M可以存在或不存在；当Q和M不存在时，A直接连结到L；A为O、CH2、(CHR)p、(CHR-CHR’)p、(CRR’)p、NR、S、SO2或化学键；E为CH、N、CR或朝向A、L或G的双键；G可以存在或不存在，当G存在时，G为(CH2)p、(CHR)p或(CRR’)p；当G不存在时，则J存在并且E直接连结到G连结的式I碳原子上；J可以存在或不存在，当J存在时，J为(CH2)p、(CHR)p或(CRR’)p、SO2、NH、NR或O；当J不存在时，则G存在并且E直接连结到连结J的式I所示氮原子上；L可以存在或不存在，当L存在时，L为CH、CR、O、S或NR；当L不存在时，则M可以存在或不存在；当M存在而L不存在时，则M直接独立连结到E，并且J直接独立连结到E；M可以存在或不存在，当M存在时，M为O、NR、S、SO2、(CH2)p、(CHR)p(CHR-CHR’)p或(CRR’)p；p为数字0-6；R、R’、R2、R3和R4独立选自以下基团H；C1-C10烷基；C2-C10链烯基；C3-C8环烷基；C3-C8杂环烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、卤素；(环烷基)烷基和(杂环烷基)烷基，其中所述环烷基由3-8个碳原子和0-6个氧、氮、硫或磷原子组成，并且所述烷基具有1-6个碳原子；芳基；杂芳基；烷基-芳基；以及烷基-杂芳基；其中所述烷基、杂烷基、链烯基、杂链烯基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基部分可任选进行化学上适当的取代，所述术语“取代”指任选并且化学上适当的被1个或多个选自以下的部分取代烷基、链烯基、链炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环基、卤素、羟基、硫代基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、亚磺酰氨基、亚砜、砜、磺酰脲、酰肼和异羟肟酸酯；进一步，其中所述N-C-G-E-L-J-N单元为五元或六元环结构，前提是当所述N-C-G-E-L-J-N单元为五元环结构，或当式I中包括N、C、G、E、L、J、N、A、Q和M的双环结构为五元环结构时，则所述五元环结构没有羰基作为环的一部分。
2.权利要求1的化合物，其中R1为COR5，而R5为H、OH、COOR8或CONR9R10。
3.权利要求2的化合物，其中R1为COCONR9R10，而R9为H，R10为H、R14、[CH(R1’)]pCOOR11、[CH(R1’)]pCONR12R13、[CH(R1’)]pSO2R11、[CH(R1’)]pSO2NR12R13、[CH(R1’)]pCOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R14为H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、芳基-烷基、链烯基、链炔基或杂芳烷基。
4.权利要求3的化合物，其中R10为H、R14、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CH(R1’)SO2R11、CH(R1’)CH(R1’)SO2NR12R13、CH(R1’)CH(R1’)COR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R1’为H或烷基，R2’为苯基、取代的苯基、杂原子取代的苯基、苯硫基、环烷基、哌啶基或吡啶基。
5.权利要求4的化合物，其中R1’为H。
6.权利要求5的化合物，其中R11为H、甲基、乙基、烯丙基、叔丁基、苄基、α-甲基苄基、α，α-二甲基苄基、1-甲基环丙基或1-甲基环戊基；R’为羟甲基或CH2CONR12R13；R2’独立选自以下基团 其中U1和U2可以相同或不同，并且选自以下基团H、F、CH2COOH、CH2COOMe、CH2CONH2、CH2CONHMe、CH2CONMe2、叠氮基、氨基、羟基、取代的氨基、取代的羟基；U3和U4可以相同或不同，并且选自O和S；U5选自以下部分烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂烷基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂烷基羰基、杂芳基羰基、烷氧羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基或其组合；NR12R13选自以下基团 和 其中U6为H、OH或CH2OH，R14选自以下基团H、Me、Et、正丙基、甲氧基、环丙基、正丁基、1-丁-3-炔基、苄基、α-甲基苄基、苯乙基、烯丙基、1-丁-3-烯基、OMe、环丙基甲基。
7.权利要求2的化合物，其中R2选自以下基团
8.权利要求7的化合物，其中R3选自以下基团 其中R31＝OH或O-烷基；Y19选自以下部分 Y20选自以下部分
9.权利要求8的化合物，其中R3选自以下基团
10.权利要求9的化合物，其中Z为N，R4为H。
11.权利要求10的化合物，其中W为C＝O。
12.权利要求11的化合物，其中Y选自以下部分 其中Y11选自H、COOH、COOEt、OMe、Ph、OPh、NHMe、NHAc、NHPh、CH(Me)2、1-三唑基、1-咪唑基和NHCH2COOH；Y12选自H、COOH、COOMe、OMe、F、Cl或Br；Y13选自以下部分 Y14选自MeSO2、Ac、Boc、iBoc、Cbz或Alloc；Y15和Y16独立选自烷基、芳基、杂烷基和杂芳基；Y17为CF3、NO2、CONH2、OH、COOCH3、OCH3、OC6H5、C6H5、COC6H5、NH2或COOH；Y18为COOCH3、NO2、N(CH3)2、F、OCH3、CH2COOH、COOH、SO2NH2或NHCOCH3。
13.权利要求12的化合物，其中Y选自以下基团 其中Y17＝CF3、NO2、CONH2、OH、NH2或COOH；Y18＝F、COOH。
14.权利要求13的化合物，其中Y选自以下基团
15.权利要求14的化合物，其中L和M不存在，并且J直接连接到E。
16.权利要求14的化合物，其中L、J和M不存在，并且E直接连接到N。
17.权利要求14的化合物，其中G和M不存在。
18.权利要求14的化合物，其中以下部分 为
19.权利要求18的化合物，其中结构a选自以下结构
20.权利要求18的化合物，其中结构a为 其中R20选自以下结构
21.权利要求18的化合物，其中结构a为 其中R21和R22可以相同或不同，并且独立选自以下结构
22.权利要求18的化合物，其中结构a选自以下结构
23.权利要求14的化合物，其中 为 其中Q可以存在或不存在，当Q不存在时，M直接连结到A。
24.权利要求23的化合物，其中结构b选自以下结构
25.权利要求14的化合物，其中 为 其中G和J独立选自以下基团(CH2)p、(CHR)p、(CHR-CHR’)p和(CRR’)p；A和M独立选自以下基团O、S、SO2、NR、(CH2)p、(CHR)p、(CHR-CHR’)p和(CRR’)p；Q为CH2、CHR、CRR’、NH、NR、O、S、SO2、NR、(CH2)p、(CHR)p和(CRR’)p。
26.权利要求25的化合物，其中结构c选自以下结构
27.权利要求14的化合物，其中 选自以下结构
28.权利要求27的化合物，其中 选自以下结构
29.一种药用组合物，它包含作为活性成分的权利要求1化合物。
30.权利要求29的药用组合物，它用于治疗HCV相关性疾病。
31.权利要求29的药用组合物，它还包含药学上可接受的载体。
32.权利要求31的药用组合物，它还包含抗病毒药物。
33.权利要求32的药用组合物，它还包含干扰素。
34.权利要求33的药用组合物，其中所述抗病毒药物为利巴韦林，所述干扰素为α-干扰素或聚乙二醇化干扰素。
35.一种治疗HCV相关性疾病的方法，所述方法包含给予需要这种治疗的患者一种药用组合物，该组合物包含治疗有效量的权利要求1化合物。
36.权利要求35的方法，其中所述给药为口服或皮下给药。
37.权利要求1的化合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗HCV相关性疾病。
38.一种制备用于治疗HCV相关性疾病的药用组合物的方法，所述方法包含使权利要求1的化合物与药学上可接受的载体密切接触。
39.一种具有HCV蛋白酶抑制活性的化合物，包括该化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、消旋体和前体药物，以及所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化合物选自具有下列结构的化合物 (R＝叔丁基，X＝NH2)(R＝异丁基，X＝NH2)(R＝叔丁基，X＝OH)(R＝三氯乙基，X＝OH) (x=OtBu) (x=OH)(x=OH)(x=OtBu)(x=NH2)(X＝NHMe)(X＝NMe2) (X＝NH2)(X＝NMe2)(X＝NHMe)(X＝OH)(X＝OtBu)(X＝OH)(X＝NH2)(X＝NMe2) (X＝OtBu)(X＝OH)(R＝叔丁基)(X＝NH2) (R＝异丁基)(X＝NMe2)(X＝NMeOMe) (X＝Me，Y＝CH2Me)(X＝OAc，Y＝Me)
40.一种用于治疗HCV相关性疾病的药用组合物，所述组合物包含治疗有效量的一种或多种权利要求39化合物和药学上可接受的载体。
41.权利要求40的药用组合物，它还包含抗病毒药物。
42.权利要求41的药用组合物，它还包含干扰素或聚乙二醇-干扰素α缀合物。
43.权利要求42的药用组合物，其中所述抗病毒药物为利巴韦林，所述干扰素为α-干扰素。
44.一种治疗丙型肝炎病毒相关性疾病的方法，该方法包括给予有效量的一种或多种权利要求39化合物。
45.一种调节丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性的方法，该方法包含使HCV蛋白酶与一种或多种权利要求39化合物接触。
46.一种治疗、预防或改善一种或多种丙型肝炎症状的方法，该方法包含给予有效量的一种或多种权利要求39化合物。
47.权利要求45的方法，其中所述HCV蛋白酶为NS3/NS4a蛋白酶。
48.权利要求47的方法，其中所述一种或多种化合物抑制HCVNS3/NS4a蛋白酶。
49.一种调节丙型肝炎病毒(HCV)多肽加工的方法，该方法包括在加工所述多肽的条件下使包含HCV多肽的组合物与一种或多种权利要求39化合物接触。
全文摘要
本发明公开了具有HCV蛋白酶抑制活性的新型化合物以及制备所述化合物的方法。在另一实施方案中，本发明公开了包含所述化合物的药用组合物以及将其用于治疗HCV蛋白酶相关性疾病的方法。
文档编号C07K5/087GK1498224SQ01813111
公开日2004年5月19日 申请日期2001年7月19日 优先权日2000年7月21日
发明者A·K·萨克塞纳, V·M·吉里亚瓦拉班, R·G·洛维, E·E·尧, F·本尼特, J·L·麦克科尔米克, H·王, R·E·皮克, S·L·伯根, 覃天佑, 刘怡宗, 朱昭宁, F·G·恩约罗格, A·阿拉萨潘, T·N·帕雷克, A·K·甘古利, 陈新海, S·文卡特拉曼, H·A·瓦卡罗, P·A·平托, B·桑塔纳姆, W·吴, S·亨德拉塔, Y·黄, S·J·坎普, O·E·莱维, M·利姆-维尔比, S·Y·塔穆拉, A K 萨克塞纳, ㄌ乩, 伯根, 吉里亚瓦拉班, 吕, 坎普, 塔穆拉, 尧, 崽, 帕雷克, 平托, 恩约罗格, 洛维, 瓦卡罗, 甘古利, 皮克, 维尔比, 莱维, 赡, 麦克科尔米克 申请人:先灵公司, 科瓦斯国际公司