专利名称：一种对虾基因及其编码的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对虾基因核苷酸序列。具体地说，本发明涉及对虾PMAVP多肽的cDNA序列，该多肽蛋白是一种抗病毒蛋白。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和多肽的生产方法。
背景技术：
对虾是水产养殖业的一种很重要的经济动物，但对虾疾病自从九十年代初在世界范围陆续爆发以来，给全球水产养殖业带来了巨大损失。造成这一结果的根本原因就是病毒病，直到现在它仍是困扰对虾养殖的主要问题。由于对虾病毒病尚无法治疗，因此目前只能从优化养殖环境，阻断病原的传播，提高对虾种质，增强对虾基础免疫力等方面入手，以期实行对养殖对虾病害的有效控制和预防。国内外学者在这些方面做了大量的工作，也取得了一些成果。如利用灭活的弧菌疫苗，可有效地提高养成期及苗期日本对虾的成活率(J of AquaticAnimal Health，1991，3151-2)；利用口服免疫增强剂(如β-1，3-葡聚糖和肽聚糖)可增强对虾血细胞的吞噬活性及对细菌性感染的抵抗能力(Fish.Chimes.，1996，1641-42)；一些富含多糖、生物碱、有机酸等多种成分的天然物质对对虾有免疫刺激作用(海洋与湖沼，1995，2634-41)。但在现有的技术水平和养殖模式下这些方法都无法彻底解决问题。
利用对虾本身的抗病因子加强抗病力有望成为防治其病害的根本方法。对虾属甲壳类无脊椎动物，虽然它缺乏特异性免疫系统，但是却具有一定的抗病能力，以抵抗环境(水体)中多种病原的侵袭，这和对虾体内存在众多的抗病因子(如各种酶、酶激活剂、酶抑制剂、细胞因子、抗菌肽、凝集素等)密切相关，所以研究特异的抗病因子对病害防治具有根本意义。但无脊椎动物包括对虾的免疫学特别是免疫分子生物学研究水平较人类及高等动物大为落后，以致在解决其养殖中的病害和良种培育等问题时缺乏科学支撑。现在已经开始从分子水平对对虾自身的免疫机制展开研究，对虾的一些免疫因子已被分离或克隆。如酚氧化酶原(proPO)激活系统是对虾免疫系统的一个重要组成部分，现在其中的一些成分或相关成分的结构功能乃至基因都已经研究得比较清楚(Current Opinion in Immunology，1998，1023-28)；抗菌肽在对虾抵抗细菌侵袭方面起着重要的作用，法国学者已从对虾中获得了三种抗菌肽(penaeidin)及其基因(Cell Mol.Life Sci.，2000，571260-71)；凝集素是对虾体内基本的识别和防御分子，目前也已有多种凝集素被纯化(Aquaculture，2000，19123-44)。
发明内容
本发明中的对虾PMAVP的cDNA核苷酸序列是如此获得的。选择世界养殖面积最大的斑节对虾为研究对象，运用差异显示技术(DD-PCR法)对正常虾和抗病虾的mRNA表达差异进行了比较研究，选取差异DNA条带进行RNA杂交鉴定，将显阳性的差异DNA进行测序，获得了SEQ ID No.1的cDNA序列。然后证明它编码的蛋白具有抗病毒功能。在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的对虾抗病毒基因。本发明将可能为对虾病害的防治提供新的途径，促进对虾养殖业的健康持续发展。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该核苷酸编码一种新的抗病毒蛋白，此抗病毒蛋白被命名为PMAVP。
本发明的另一个目的是提供一种新的对虾抗病毒蛋白，该蛋白被命名为PMAVP。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的对虾抗病毒蛋白的方法。
本发明还提供了这种对虾的抗病毒基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码对虾PMAVP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID No.1中1-513的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID No.1中1-513的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.1中1-513位的核苷酸序列。
在本方面的另一方面，提供了一种分离的PMAVP蛋白多肽，它包括具有SEQID No.2氨基酸序列的多肽、或者其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有PMAVP蛋白活性的多肽的方法。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明中分离的多核苷酸全长为776个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.1，其中开放读框位于1-513位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。“严谨条件”是指杂交的条件，如温度和缓冲液成分等产生的杂交严谨程度的等级。
在本发明中，术语“PMAVP蛋白(或多肽)编码序列”是指编码具有PMAVP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.1中的1-513位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID No.1序列的编码框1-513位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.1中1-513位核苷酸同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID No.2所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳地在高度严谨条件下，与SEQ ID No.1中从核苷酸1-513位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.1中1-513的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与对虾PMAVP相同功能的蛋白的、SEQ ID No.1序列的变异形式。这些变异形式包括若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地10个以内，最佳地5个以内)核苷酸。
在本发明中，“纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少50％，较佳地至少75％，更佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯化可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC测量多肽的纯度。
在本发明中，术语“PMAVP蛋白多肽”指具有PMAVP蛋白活性的SEQ ID No.2序列的多肽。该术语还包括具有抗病毒功能的、SEQ ID No.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括PMAVP蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、修饰形式、在高或低的严谨度条件下能与PMAVP DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗PMAVP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽，如包含PMAVP多肽或者其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了PMAVP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有PMAVP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，较佳地至少约30个连续氨基酸，更佳地至少约50个连续氨基酸，最佳地至少约80个连续氨基酸。
本发明还提供PMAVP蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然PMAVP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体，诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基的序列，还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有PMAVP多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码PMAVP的核酸分子。
本发明还包括检测PMAVP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于PMAVP多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对PMAVP DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体或单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于PMAVP基因产物或片段。较佳地，指那些能与PMAVP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制PMAVP蛋白的分子，也包括那些并不影响PMAVP蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段、抗体重链、抗体轻链、遗传工程改造的单链Fv分子或嵌合抗体。
本发明的抗体抗原通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的PMAVP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达PMAVP或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物以生产抗体。片段可以利用重组方法制备或利用合成仪合成。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 PMAVP cDNA序列的克隆和测定1.DD-PCR提取正常对虾和抗病对虾肝胰腺T-RNA，并用DNase I处理。然后分别用FluoroDD试剂盒(购自Beckmann-Coulter)中的锚定引物AP6进行逆转录。逆转录程序42℃ 10min，50℃ 60min，70℃ 15min，4℃暂存。
AP6序列5’-ACG ACT CAC TAT AGG GCT TTT TTT TTT TTC C-3’T7启动子引物序列以此逆转录混合物为模板，用试剂盒中的随机引物ARP2(上有TMR荧光标记)和AP6配对进行PCR扩增。
ARP2序列5’-ACA ATT TCA CAC AGG AGC TAG CAT GG-3’M13(-48)引物序列PCR程序①95℃ 2min②4个循环92℃ 15sec；50℃ 30sec；72℃ 2min③30个循环92℃ 15sec；60℃ 30sec；72℃ 2min④72℃ 7min2.电泳、扫描分析和切胶回收PCR产物在GenomyxLR仪器上进行5.6％变性PAGE电泳，然后在GenomyxSC荧光扫描仪中将电泳图谱扫描成图像，扫描软件为AcquireSC。最后用软件PhotoShop对比分析正常虾和抗病虾的mRNA经DD-PCR后产生的差异DNA条带，并进行精确定位。再在切胶工作台上定位，并无菌手术刀片切下差异条带。切下的胶带加入50μl TE在37℃处理1hr后取洗脱液保存于-20℃。
3.重扩增、测序以上述胶洗脱液为模板，以M13(-48)引物和T7启动子引物配对进行PCR扩增，PCR程序同DD-PCR。将PCR产物用M13(-48)引物进行DNA测序，详细序列见SEQID No.1，其中开放读框位于1-513位核苷酸。
根据得到的核苷酸序列推导出PMAVP的氨基酸序列，共170个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No.2。
实施例2 PMAVP在大肠杆菌中的表达1.PMAVP cDNA的扩增将编码PMAVP的cDNA序列用对应于该DNA的开读框的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得PMAVP插入片段。
5’寡核苷酸引物为5′-TAGTGCATGCATATGCGTCATACAATCCTA-3′(SEQ IDNo.3)，该引物含有Sph I限制性内切酶的识别位点，在该位点后是由起始密码子开始的PMAVP编码序列的18个核苷酸。3’寡核苷酸引物为5’-CTGTCTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGTCCTGCTTTCACA-3’(SEQID No.4)，该引物含有XhoI限制性内切酶的识别位点、终止密码子、编码6个组氨酸(His)的密码子和PMAVP部分编码序列。
PCR程序①95℃ 2min
②4个循环94℃ 15sec；50℃ 30sec；68℃ 1min③30个循环94℃ 15sec；60℃ 30sec；68℃ 1min④68℃ 10min2.PMAVP DNA的重组上述引物上的限制性内切酶的识别位点对应于细菌表达载体pThioHisC(Invitrogen)上的酶切位点。用Sph I和Xho I消化pThioHisC载体，随后将扩增的PMAVP片段连接到此载体。然后用连接混合物转化XL1-Blue感受态细胞(Stratagene)，涂布在LB平板(含Amp 100μg/ml)上。挑取菌落，提取质粒，用PCR、酶切和测序的方法鉴定PMAVP的DNA片段已正确插入了载体。
3.PMAVP重组蛋白的表达、纯化和复性挑取含有PMAVP重组质粒的单菌落于4ml LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)，37℃摇培过夜。吸取1ml菌液于新的200ml LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)，37℃摇培至OD600为0.6左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续摇培4hr。
离心菌液去上清，将细胞重悬于含有8M尿素的裂解缓冲液中，超声裂解，离心去沉淀，上清中的PMAVP重组蛋白用镍柱进行亲和纯化。
采用分步透析法进行纯化PMAVP蛋白的复性，即将变性剂尿素的浓度由8M逐步降低，6M，4M，2M，1M，0.5M，最后用不含尿素的溶液透析两次，将尿素完全透析掉。用SDS-PAGE鉴定纯化蛋白的分子量和纯度。
实施例3抗体制备将实施例2中获得的纯化的重组蛋白用等体积的完全Freund’s佐剂乳化，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白对小鼠进行皮下注射。10天后用非完全Freund’s佐剂乳化的同样剂量的同样抗原再注射进行加强免疫来免疫动物以产生抗体，每隔10天进行一次加强免疫，至少进行3次。分析所获抗血清的滴度和特异性。
在阅读了本发明的上述讲授内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表1.SEQ ID No.1的信息(1)序列特征(A)长度776bp(B)类型核酸(C)链性单链
(D)拓扑结构线性(2)分子类型cDNA(3)序列描述SEQ ID No.11 ATGCGTCATA CAATCCTAGT TTTCCTTTCC CTCGGTGTTG TTGGGTCGGC TGTGGCAACA61TCATACGAGA AAAGTGCCAA TGATTCCAAG GCTGTCTGCT ATAGCCCCTA TACTGCCATT121 GCGGATCGCT GTTTGTTTGT CGATCACCAG ACAGATGGAA GCTGGTATGA CATGCGAGAG181 TACTGTAACC TTATAAATGG AGACTTTCTC AAGCTGGATG ACGCTAATCT CCTTACTGAT241 ATCGTTGAGT ACATTACTTA CCAAGTGGGT GTGAACAGAG ACTACTGGAT CGGGGGGAGT301 GACGAGAACC ACGAGGGTCT TTGGCTGTGG ACGGACGGAA CTCTCATGCG GACAGGTGTT361 CCCTTGTGGT ACCATTGCAC CTCCATCTCT CAACAACCAG ATGGTGGCTC CTCAGAGAAC421 TGTGCCGTCA TGCGCTGGGA CTCATTTTAC CATATCCATG ATGTGTCTTG CTACACTTCT481 CGGTCTGTCA TTTGTGAAAG CAGGACACAT TAATCTAACA AGTTTTGGCC ACAGAAAAGA541 TATACAAATT GTTTTTTATT ACAAATTTTC TTTTATATCA TATTGTGCCA CAAGCCGAGA601 TCATTGGCAA AGTACACATT AACCAAATGA TATCTATATA CTATGTACAT TCGTTTATCA661 CGCTGCCCGT GGCCACACTG CCTTATGCAT TTAACTTTTC TAATCTGTCC TGAAATCTTT721 TTTAGCTGTA ACATTGCAAG AATAAATATT CTAAAGGAAA AAAAAAAAAA AAAAAA2.SEQ ID No.2的信息(1)序列特征(A)长度170个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(2)分子类型多肽(3)序列描述SEQ ID No.21 MRHTILVFLS LGVVGSAVAT SYEKSANDSK AVCYSPYTAI ADRCLFVDHQ TDGSWYDMRE61YCNLINGDFL KLDDANLLTD IVEYITYQVG VNRDYWIGGS DENHEGLWLW TDGTLMRTGV121 PLWYHCTSIS QQPDGGSSEN CAVMRWDSFY HIHDVSCYTS RSVICESRTH3.SEQ ID No.3的信息(1)序列特征(A)长度30bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(2)分子类型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID No.3TAGTGCATGC ATATGCGTCA TACAATCCTA 304.SEQ ID No.4的信息(1)序列特征(A)长度46bp(B)类型核酸
(C)链性单链(D)拓扑结构线性(2)分子类型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID No.4CTGTCTCGAG TTAGTGATGG TGATGGTGAT GTGTCCTGCT TTCACA4权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码对虾PMAVP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，或者所述核苷酸序列与SEQ ID No.1中1-513的核苷酸序列有至少70％的同源性，或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ IDNo.1中1-513位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1中所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。
3.如权利要求1中所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID No.1中从核苷酸1-513的核苷酸序列。
4.一种分离的PMAVP蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种产生具有PMAVP蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有PMAVP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成PMAVP蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.1中从核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成PMAVP蛋白的重组细胞；(c)在适合表达PMAVP蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有PMAVP蛋白活性的多肽。
8.如权利要求7中所述的方法，其特征在于，该重组的编码多肽的核苷酸序列为SEQ ID No.1中从核苷酸1-513位。
9.一种能与权利要求4所述的PMAVP蛋白多肽特异性结合的抗体。
10.种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明公开了从对虾中分离得到1个抗病毒基因，它编码1种抗病毒蛋白PMAVP，它们可用于进行对虾抗病的研究。本发明选择通过世界养殖面积最大的斑节对虾为研究对象，运用差异显示技术(DD－PCR法)对正常虾和抗病虾的mRNA表达差异进行了比较研究，选取差异DNA条带进行RNA杂交鉴定，将显阳性的差异DNA进行测序，获得了SEQID No.1的cDNA序列。本发明将可能为对虾病害的防治提供新的途径，促进对虾养殖业的健康持续发展。
文档编号C07K14/435GK1539969SQ0312281
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月21日 优先权日2003年4月21日
发明者章晓波, 邵宗泽, 罗田, 徐洵 申请人:国家海洋局第三海洋研究所