专利名称：三环聚酮类化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)(保藏编号是CCTCC M 204077)生产三环聚酮类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
有关聚酮类化合物的文献报道较多，但是这种三个六元环稠合而成的新颖的三环聚酮未见报道。本发明人研究得知，土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)(保藏编号是CCTCC M 204077)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞周期抑制活性，遂对其活性成分进行了研究。研究发现所示三环聚酮类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见对该菌株的抗肿瘤活性成分研究、该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容
本发明旨在提供两种结构独特的具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的新化合物。其结构式分别是式I 式II 其结构特征是式I由三个六元环稠合而成的三酮，R1是氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基等基团；式II为由三个六元环稠合而成的二酮，其中R1和R2可以是氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基等基团。
并且本发明优选的式I化合物其中R1是羟基，优选的式II化合物R1和R2是羟基。
本发明采用MTT法测试了式I-II化合物对P388和A-549细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，式I-II化合物对这两种肿瘤细胞均有抗肿瘤作用。
因此本发明的式I-II化合物可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。
式I或式II化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。
式I-II化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式I-II化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。
本发明的式I-II化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该聚酮类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用硅胶柱层析、制备HPLC等方法分离纯化得到。
本发明的下述实施例中列举了利用土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)制备优选的本发明式I或式II化合物的实例。
因此，本发明的再一方面提供了从采自于青岛海域胶州湾海底泥样品中分离得到的一株微生物，经中国典型培养保藏中心鉴定为土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)，并于2004年10月18日由该保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 204077。该菌株具有如下为生物学特征表1 LM2-02菌株的微生物菌学特征
需要特别说明的是，凡是能产生本发明式I-II化合物的任何微生物，都能用于生产该聚酮类化合物；也可由上述优选化合物经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成该类化合物。
具体实施例方式在如下的实施例中所指的化合物I’-II’的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位分别是 化合物I’ 化合物II’实施例1化合物I’-II’的发酵生产及分离精制1 发酵生产生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取土生青霉菌LM2-02(Penicilliumterrestre)(CCTCC M 204077)适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)适量，接种到装有120mL培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH2PO40.5，MgSO40.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL锥型瓶中，在28℃、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获得土壤青霉菌的种子培养液。按10％接种量将该种子培养液接种于装有150毫升生产培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH2PO40.5，MgSO40.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL三角烧瓶中，装载于28℃、120转/分钟的摇床上，进行为期7天的生产发酵，获得菌丝体和发酵液。
2 浸膏的获得用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓缩至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。发酵液减压浓缩为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共58.0克。
3 化合物的分离精制浸膏(58.0克)用氯仿-甲醇(9∶1)混合溶剂溶解后，加70克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为30个流份。Fr-16(7.5g，氯仿-甲醇150∶1洗脱物)，以氯仿-甲醇(200∶1)为溶剂进行硅胶柱层析，再经HPLC以甲醇-水(60∶40)为溶剂得化合物I’(36mg)；Fr-18(3.8克，氯仿-甲醇85∶1洗脱物)，再经半制备HPLC(甲醇-水60∶40)得化合物II’(4mg)。
化合物I’ 无色片状晶体，mp 200-201℃，[α]D20+169.7°(c 0.23，MeOH)，分子式C14H18O4，HR-ESI-MS m/z273.1114[M+Na]+，计算值273.1103。UVλmaxnm(logε)in MeOH212(3.72)，220(3.53)。IRνmaxcm-1(KBr)3404，2941，2873，1739，1714，1692，1448，1380，1327，1241，1220，1145，1043，1025，998，908。1H及13C NMR数据见表1。
化合物II’无色针状晶体，mp 193℃(dec.，[α]D20-13.7°(c 0.2，CH3OH)，分子式C14H20O4，HRESI-MS m/z275.1270[M+Na]+，计算值273.1259。IRνmaxcm-1(KBr)3514，3321，2925，2892，1732，1965，1576，1450，1411，1162，1054，1032，998。1H及13C NMR数据见表2。
实施例2抗肿瘤活性的测试1 实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物I’-II’。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。
细胞系及细胞的继代培养活性测试采用P388和A-549细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在37℃通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。
活性测试时，取对数生长期的P388和A-549细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5×104个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150μL培养液后加入150μL DMSO溶解formazan，在540nm处测定其吸收度。按照IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。
2 实验结果表7.化合物对P388和A-549细胞的抑制率
3 结论化合物I’对包括人在内的哺乳动物来源的癌细胞具有抗肿瘤作用，化合物II’选择性对人肺癌细胞具有增殖抑制作用。可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于抗肿瘤的研究中，具有开发为抗肿瘤药物的潜力；也可作为抑制细胞增殖抑制的低分子生物探针用于生命科学研究。
权利要求
1.式I化合物 式I其中R1为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
2.权利要求1所述的式I化合物，其中R1为羟基。
3.式II化合物 式II其中R1和R2为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
4.权利要求3所述的式II化合物，其中R1和R2为羟基。
5.权利要求1所述式I化合物或权利要求3所述式II化合物的制备方法，其特征是发酵培养土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)，获取含有上述式I和/或式II化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式I和/或II化合物。
6.权利要求5所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，氯仿-甲醇15∶1洗脱部分，再经制备HPLC分离纯化得式I和/或II化合物。
7.权利要求1或3所述的式I或式II化合物在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。
8.权利要求1或3所述的式I或式II化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途。
9.权利要求1或3所述的式I或式II化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
10.土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)，其保藏编号是CCTCC M 204077。
11.权利要求10所述的菌株用于生产权利要求1或3所述的式I或式II化合物的用途。
全文摘要
本发明涉及两种三环聚酮类化合物的制备方法和用途。本发明用采自海洋样品中的土生青霉菌LM2－02(Penicillium terrestre)生产出结构新颖的三环聚酮类化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。
文档编号C07C49/00GK1686993SQ200510055628
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月21日 优先权日2005年3月21日
发明者顾谦群, 刘为忠, 朱伟明, 刘红兵, 方玉春, 朱天骄 申请人:中国海洋大学