专利名称：Itpka基因及其表达蛋白在制备及筛选抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ITPKA基因及其表达蛋白在制备及筛选抗癌药物中的应用，特别是 ITPKA基因及其表达蛋白在制备及筛选抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
肿瘤是目前人类主要致死疾病之一，其致死率在各种疾病中排在前三位。全世界每年有数以千万计的人死于肿瘤，给人类的健康、社会的发展造成了难以挽回的重大损失。 随着社会经济的快速发展，在我国肿瘤发病率居高不下，目前有癌症患者接近一千万人，死亡率高达30%，并且新增患者数目急剧增加。肿瘤发生侵袭及转移是造成肿瘤患者死亡的主要原因。因此有效地抑制肿瘤的侵袭和转移对于提高肿瘤的治疗效果和患者的存活率具有至关重要的作用。目前临床治疗肿瘤的主要方法如手术切除、放疗和化疗都不能有效地抑制肿瘤对临近组织的侵袭和远端转移，并且放疗和化疗过程严重损害人体的正常细胞， 从而导致癌症的死亡率居高不下，五年存活率仅不到30%。研究可以有效抑制肿瘤发生侵袭和转移的新方法，成为攻克肿瘤疾病，有效治疗肿瘤的新途径。随着对于肿瘤发生侵袭和转移的机制和原理研究的深入，利用生物医学的方法治疗肿瘤侵袭转移取得了显著进展， 特别是针对肿瘤侵袭转移过程中重要分子的靶向治疗方法成为最有研究潜力的热门领域。发现重要的肿瘤侵袭转移标志性靶分子，是有效实现靶向治疗的重要前提。关于肿瘤侵袭转移的治疗靶点已经有相关报道，它们参与或调控了肿瘤发生侵袭转移的过程， 并且针对靶点设计了新药。但是目前应用于抗肿瘤侵袭转移的药物仍远不能满足临床的需要，因此研制新型抗肿瘤侵袭转移药物具有十分重要的意义。目前没有ITPKA蛋白在肿瘤治疗靶标方面的研究报道。制备或筛选能够有效抑制肿瘤临近组织侵袭和远距离转移的药物，关键是找到有效的靶向蛋白。在找到有效蛋白作为靶标的前提条件下，才能通过筛选的方法和策略获得高度特异性结合靶蛋白的靶向药物。此外，筛选出的靶向药物的药效是否理想也是直接取决于靶蛋白在生理过程中发挥的功能。因此，筛选治疗肿瘤的药物关键是找到有效蛋白作为靶标。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供ITPKA基因及其表达蛋白在抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用。术语解释ITPKA蛋白人体内表达的肌醇l，4，5-trisphosphate 3激酶A。表达蛋白=ITPKA基因经转录翻译后的蛋白因子，即ITPKA蛋白。发明概述本发明基于发明人的以下的几个方面的发现作为前提ITPKA基因是一个在神经元和睾丸中特异性表达，在其他组织中不表达的微丝成束蛋白的基因片断。但是在多种常见的癌症如肺癌等发病初期，ITPKA蛋白发生急剧高水平异位表达并且是肿瘤细胞侵袭转移过程的重要作用蛋白。在体外细胞实验中，当癌细胞中IPTKA蛋白表达水平显著提高时， 癌细胞形态发生改变，形成由大量肌动蛋白细胞骨架构成的突出物，细胞运动能力明显增强；反之，当显著降低癌细胞中ITPKA蛋白表达水平时，癌细胞的侵袭转移能力随之降低或消失。在癌症治疗过程中，ITPKA蛋白的表达水平与临床抗癌药物抑制肿瘤发展的治疗效果呈显著相关。ITPKA蛋白作为肿瘤的发生、侵袭转移的标志，参与了肿瘤的发生和侵袭转移过程，因此可以用作临床肿瘤诊断和/或治疗中的靶向蛋白，用于检测抗癌药效及筛选制备抗肿瘤侵袭转移的新型药物。ITPKA蛋白促进癌细胞的侵袭转移主要是通过以下两种机制完成的(1)不依赖于细胞生长因子的方式ITPKA蛋白通过直接调控肌动蛋白细胞骨架， 诱导细胞形成大量的突出物如丝状伪足以促进肿瘤细胞的运动能力。(2)在受到生长因子激发的细胞中，ITPKA蛋白通过催化产生大量的1，3，4，5_四磷酸肌醇并抑制肌醇磷酸-5-磷酸酶的活性等方式使细胞中大量钙离子进入细胞，通过细胞内的信号转导通路进一步增强了 ITPKA蛋白诱发的肿瘤细胞转移能力。发明详述本发明技术方案如下ITPKA基因在制备或筛选抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用。抑制ITPKA基因表达的基因片段shRNAl，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。抑制ITPKA基因表达的基因片段shRNA2，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述基因片段shRNAl和/或基因片段shRNA2在制备或筛选抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用。ITPKA蛋白在制备或筛选抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用。上述应用，ITPKA蛋白作为制备或筛选治疗肿瘤药物的靶向蛋白。ITPKA蛋白作为肿瘤靶向蛋白筛选用于肿瘤治疗的药物，筛选得到的抗肿瘤药物可以是单克隆抗体，或者其他类型的与ITPKA蛋白结合的分子，如多肽或小分子药物等。此外，可以将一些治疗性物质偶联于与ITPKA具有高亲和力的靶向药物上以达到治疗的效果，如将放射性核素偶联于抗ITPKA蛋白的单克隆抗体上，这些技术均为本领域常规技术。ITPKA蛋白的抗体在制备或筛选抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用
上述ITPKA蛋白的抗体为ITPKA蛋白的单克隆抗体，制备步骤如下(1)利用ITPKA蛋白免疫动物，获得免疫血清；(2)测定步骤(1)制得的免疫血清中抗ITPKA蛋白的抗体的有效浓度，收集滴度达到IO8以上的免疫血清；(3)利用ITPKA蛋白对步骤⑵制得的免疫血清进行抗原亲和层析纯化，得到特异性识别目标靶蛋白ITPKA蛋白的抗体。所述测定为间接ELISA法测定。所述ITPKA蛋白，制备步骤如下1)利用ITPKA cDNA连接pET28b载体构建的质粒转化大肠杆菌BL21DE3感受态细胞，鉴定阳性克隆菌株；2)将阳性菌株接种在含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37°C摇床200rpm
4过夜培养；然后按体积比1 100的比例稀释到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中， 37°C摇床200rpm培养约3小时，当菌液OD6tltl值达到0. 6-0. 8时，加入终浓度为400mM的 IPTG诱导剂，16°C摇床200rpm诱导培养20h，离心收集诱导菌体；3)将步骤( 制得的诱导菌体重悬后，利用超声波方法破碎，离心，将上清液通过镍亲和层析柱方法纯化得到高纯度的ITPKA蛋白，将得到的ITPKA蛋白在50mM KCl、5mM Tris-HClpH 8. 0的缓冲液中透析，即得。上述肿瘤细胞为皮肤癌、肺癌、乳腺癌或肝癌细胞，优选皮肤癌细胞。根据业内共知的规律，本发明所述的技术方案可以用于高表达ITPKA蛋白癌症的治疗及药物筛选。有益效果本发明发现了肿瘤侵袭转移过程中的重要参与靶向蛋白ITPKA蛋白。在临床诊断和治疗肿瘤侵袭转移过程中，结合本发明的技术方案可以将ITPKA蛋白作为肿瘤标记分子、抗癌药效检测标记分子和癌症治疗的靶向蛋白进行应用。本发明为制备抗癌药物及抗癌药物的筛选提供了新的途径。
图1、利用ITPKA蛋白多抗免疫组化的方法对正常组织和肺癌组织、乳腺癌组织、 肝癌组织中的ITPKA蛋白表达水平进行检测的柱状图；图2、用ITPKA蛋白多抗免疫组化检测人体肺癌附近正常组织、肺癌组织中心、肺癌侵袭前沿和淋巴结转移灶的电子显微镜照片；其中A、癌旁正常组织；B、癌中心；C、肿瘤侵袭转移；图3、显示用ITPKA蛋白多抗免疫组化检测人体肺癌附近正常组织、肺癌组织中心、肺癌侵袭前沿和淋巴结转移灶的表达情况的柱状图；图4、ITPKA蛋白多抗免疫组化检测不同抗癌药物治疗效果与其抑制ITPKA表达能力的相关性的柱状图；图5A、基因片段shRNAl和基因片段shRNA2抑制肿瘤细胞YES2侵袭转移能力的柱状图；图5B、基因片段shRNAl和基因片段shRNA2抑制肿瘤细胞EC9706-P4侵袭转移能力的柱状图；图5C、基因片段shRNAl和基因片段shRNA 2抑制肿瘤细胞在转染裸鼠体内侵袭转移能力，其对应的转染鼠生存天数的柱状图；图6A、浓度梯度的兔免疫血清和纯化ITPKA鼠多抗蛋白抑制肿瘤细胞迁移能力的柱状图；图6B、浓度梯度的兔免疫血清和纯化ITPKA鼠多抗蛋白抑制肿瘤细胞在裸鼠肺中形成病灶能力的柱状图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例1肿瘤抗原的制备利用分子生物学的方法，通过如下方法表达并纯化得到了 ITPKA蛋白
(1)提取神经元组织的RNA，反转录获得组织cDNA序列。设计ITPKA特异的引物， 引物序列正向引物 GAATTCATGACCCTGCCCGGGGC ；反向引物 AAGCTTTCATCTCTCAGCCAGGCTGG。 PCR 条件第一步 95°C 5min，第二步 94°C 30sec，第三步 59°C 30sec，第四步 72°C 90sec，第二到第四步30个循环，72°C IOmin0克隆得到了 ITPKA基因的cDNA编码序列。通过DNA测序的方法确认序列完全正确。(2)将ITPKA基因的cDNA编码序列导入pET28b载体构建表达载体，然后将表达载体转化进入大肠杆菌BL21DE3 ；(3)在上述大肠杆菌BL21DE3中添加诱导剂IPTG诱导ITPKA蛋白在宿主细胞中大
量表达；(4)利用超声波等方法破碎细胞并通过亲和层析柱等方法纯化得到高纯度的 ITPKA蛋白。表达得到的ITPKA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。实施例2ITPKA蛋白多克隆抗体的制备(1)利用实施例1中表达的ITPKA蛋白作为抗原免疫实验鼠制备抗ITPKA蛋白的多克隆抗体取免疫前血清免疫前自鼠耳静脉取血备检，第一次免疫ITPKA蛋白与弗氏佐剂按1:1比例充分混合后，经皮内注射免疫实验鼠，每只500 μ g多肽KLH偶联物(购自德国默克公司)；第二次免疫第一次免疫两周后，取500 μ g ITPKA蛋白与弗氏不完全佐剂充分混合后再次经皮内注射免疫实验鼠；注射卡介苗第二次免疫后7d，按每只鼠100毫克卡介苗经皮下多点注射免疫实验鼠；第三次免疫自注射卡介苗后1 ld，按每只鼠500 μ g ITPKA蛋白与弗氏不完全佐剂充分混合后经淋巴结注射免疫实验鼠；(2)效价测定第三次免疫后9到10天自鼠静脉取血，用来测定免疫血清的抗体滴度，当免疫血清中目标抗体的滴度达到IO8以上时，自鼠静脉取血，置于直径为150mm的干净平皿中，4度过夜；第二天，离心分离血清，得到免疫血清；(3)由于获得的免疫血清中还含有大量的非特异性的免疫球蛋白，直接用免疫血清进行免疫组化等实验将产生大量的非特异性干扰信号，影响对检测的结果的判断，因此我们用偶联有ITPKA的纤维素膜进行亲和层析的方法纯化得到了与ITPKA蛋白特异性结合的抗体。实施例3利用组织芯片检测ITPKA蛋白在肿瘤组织中的表达升高石蜡包埋的皮肤癌组织制备组织芯片，进行常规石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。5%过氧化氢室温10分钟，阻断内源性过氧化物酶的活性。切片在枸橼酸缓冲液 (10mM,pH6. 5)中用微波加热法进行抗原修复。用20%正常山羊血清室温封闭20分钟。弃封闭液，加入1-2微克每毫升抗ITPKA蛋白多克隆抗体，4度孵育过夜。然后用PBS洗5遍， 每遍5分钟，加入HRP标记的链霉卵白素，室温孵育1小时。利用染料DAB染色，及苏木素复染，封片后在显微镜下观察检测结果。ITPKA蛋白的表达在皮肤癌组织中高水平异位表达。而且ITPKA蛋白在肿瘤中的表达与肿瘤侵袭程度、淋巴结转移和病理期呈显著正相关 (表 1)。
表1在58例皮肤癌组织芯片中ITPKA蛋白表达水平与皮肤癌临床病理特征的相关性
权利要求
1.ITPKA基因在制备或筛选抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用。
2.抑制ITPKA基因表达的基因片段shRNAl，核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
3.抑制ITPKA基因表达的基因片段shRNA2，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.权利要求2所述基因片段shRNAl和/或权利要求3所述基因片段shRNA2在制备或筛选抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用。
5.ITPKA蛋白在制备或筛选抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，ITPKA蛋白作为制备或筛选治疗肿瘤药物的靶向蛋白。
7.ITPKA蛋白的抗体在制备或筛选抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述ITPKA蛋白的抗体为ITPKA蛋白的单克隆抗体，制备步骤如下(1)利用ITPKA蛋白免疫动物，获得免疫血清；(2)测定步骤(1)制得的免疫血清中抗ITPKA蛋白的抗体的有效浓度，收集滴度达到 IO8以上的免疫血清；(3)利用ITPKA蛋白对步骤⑵制得的免疫血清进行抗原亲和层析纯化，得到特异性识别目标靶蛋白ITPKA蛋白的抗体。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的测定为间接ELISA法测定。
10.权利要求1、4-9中任意一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为皮肤癌、肺癌、乳腺癌或肝癌细胞，优选皮肤癌细胞。
全文摘要
本发明涉及ITPKA基因及其表达蛋白在制备及筛选抗癌药物中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供抑制ITPKA基因表达的基因片段shRNA1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；抑制ITPKA基因表达的基因片段shRNA2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明为制备抗癌药物及抗癌药物的筛选提供了新的途径。
文档编号C07K16/40GK102389574SQ20111028200
公开日2012年3月28日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者谢钰容 申请人:谢钰容