专利名称：一种从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是一种从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法。
背景技术：
胰蛋白酶抑制剂是一类可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽，普遍存在于植物的贮藏器官，如种子、块根和块茎中，特别是豆科、木本科及茄科植物。此外，动物的血液、 精液、胰脏、初生乳汁、血清、鸡蛋白、胎盘、尿中以及酵母菌、链霉菌属等微生物中亦有胰蛋白酶抑制剂的存在。根据它们抑制的蛋白酶类型可分为丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、以及金属蛋白酶抑制剂。由于它们能抑制昆虫肠道内以及一些病原微生物体内的蛋白酶，因此蛋白酶抑制剂在植物对昆虫和病原体的侵染防御系统中具有重要的作用。除此之外，它还被用于研究蛋白质与蛋白质的相互作用，或被用于癌症、艾滋病病人的治疗。将抑制剂基因转入目的植物中，还可以提高植株的抗虫、抗病能力。绿豆胰蛋白酶抑制剂是从大豆中分离纯化得到的双头多功能蛋白酶抑制剂，除了具备其他蛋白酶抑制剂在抗虫抗病方面的特点外，还有许多独特的优点。如比活力高而且稳定，广谱性强，对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶等多种蛋白酶有较强的抑制作用。 而这些蛋白酶是一些农业害虫肠道的主要消化酶，因此，绿豆胰蛋白酶抑制剂在植物抗虫方面的应用有着广阔的前景。近年来，绿豆胰蛋白酶抑制剂在国内外研究较热，主要集中于研究活性结构中心， 抑制机理和基因克隆与转化等方面。研究从绿豆中提取，分离，纯化则很少，至于考虑尝试其他更经济，有效的提取方法，国内尚未看到有相关报道。
发明内容
本发明提供一种从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法，能够用较低成本分离纯化较高纯度的胰蛋白酶抑制剂。本发明通过以下步骤实现
(1)将绿豆捣碎，加入ρΗ7·6的0. lmol/L PBS缓冲液，充分捣碎成糊状；
(2)将上述糊状液体静置20min，用纱布过滤，收集抽提液，于75°C水浴加热变性 30min，弃去沉淀；
(3)取上清液调pH至6.5，搅拌的同时加固体硫酸铵至70%饱和度，4°C过夜，将液离心 15min,弃去沉淀；
(4)沉淀用去离子水溶解，先后用IOkDa和30kDa的滤膜超滤，收集IOkDa 30kDa的组分；
(5)收集的组分用0.05mol/L, pH8. 0的Tris-HC透析过夜，浓缩后离心，收集上清液；
(6)另取壳聚糖用醋酸溶解，完全溶解后加入TweenSO；(7)加入乙酸乙酯，搅拌均勻后，再滴加spanSO，加热到50°C反应30min；
(8)接上述步骤，升温至60°C，加入甲醛反应30min；
(9)反应完成后加入戊二醛，调节pH至9.0，升温至80°C反应Ih；
(10)反应完成后进行抽滤，取滤渣用丙酮和无水乙醇洗后置于80°C干燥，得到微黄色的壳聚糖微珠；
(11)用上述步骤中的壳聚糖微珠作为吸附剂，用0.lmol/L, ph7. 8硼酸-硼砂缓冲液
平衡；
(12)取慈菇胰蛋白酶抑制剂粗提物上样；
(13)先用硼酸-硼砂缓冲液4mL/min洗脱，再改用0.25mol/L,ph4. 0醋酸钠一醋酸缓冲液，2mL/min 洗脱，最后用 0. 5 mol/L, pHl. 5 NaCl-HCl 缓冲液，2mL/min 洗脱；
该发明的方法简便，易于操作，且有较高产率。
具体实施例方式
(1)取绿豆IOOg捣碎，加入300ml pH7. 6的0. lmol/L PBS缓冲液，充分捣碎成糊状；
(2)将上述糊状液体静置20min，用纱布过滤，收集抽提液，于75°C水浴加热变性 30min，弃去沉淀；
(3)取上清液调pH至6.5，搅拌的同时加固体硫酸铵至70%饱和度，4°C过夜，将液离心 15min,弃去沉淀；
(4)沉淀用5ml去离子水溶解，先后用IOkDa和30kDa的滤膜超滤，收集IOkDa 30kDa 的组分；
(5)收集的组分用0.05mol/L,pH8. 0的Tris-HCl透析过夜，浓缩后离心，收集上清液；
(6)另取壳聚糖1.5g用300mL 0. 5%醋酸溶解，完全溶解后加入1. 5ml的Tween80 ；
(7)加入0.8ml乙酸乙酯，搅拌均勻后，再滴加Iml的span80，加热到50°C反应30min ；
(8)接上述步骤，升温至60°C，加入&ι136%甲醛反应30min；
(9)反应完成后加入10mU%的戊二醛，调节pH至9.0，升温至80°C反应Ih；
(10)反应完成后进行抽滤，取滤渣用丙酮和无水乙醇洗后置于80°C干燥，得到微黄色的壳聚糖微珠；
(11)用上述步骤中的壳聚糖微珠作为吸附剂，用0.lmol/L, ph7. 8硼酸-硼砂缓冲液
平衡；
(12)取慈菇胰蛋白酶抑制剂粗提物上样；
(13)先用硼酸-硼砂缓冲液4mL/min洗脱，再改用0.25mol/L,ph4. 0醋酸钠一醋酸缓冲液，2mL/min 洗脱，最后用 0. 5 mol/L, pHl. 5 NaCl-HCl 缓冲液，2mL/min 洗脱；
洗脱后得到的提纯液，用考马斯亮蓝G-250染色法测定其含量，得到其胰蛋白酶抑制剂的得率为0. 5%。
权利要求
1.一种从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于有以下步骤 Sl将绿豆，捣碎，过滤，盐析，离心，取沉淀溶解，超滤，透析，离心，制得绿豆胰蛋白酶抑制剂粗提物；S2将壳聚糖用醋酸溶解；S3在S2所述溶解液加入Tween-80、乙酸乙酯和span80，加热到50°C反应30min ；S4将S3所述溶解液升温至60°C，加入甲醛反应30min ；S5在S4反应完成后加入戊二醛，调节pH至9. 0,升温至80°C反应Ih ；S6在S5反应完成后进行抽滤，取滤渣用丙酮和无水乙醇洗后置于80°C干燥，得到微黄色的壳聚糖微珠；S7以壳聚糖微珠为亲和载体进行亲和层析。
2.根据根据权利要求1所述从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于Sl 所述粗提物，捣碎时要加入0. lmol/L, pH7. 6的PBS缓冲液。
3.根据根据权利要求1所述从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于Sl 所述粗提物，用70%饱和度的硫酸铵盐析。
4.根据根据权利要求1所述绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于Sl所述粗提物，分别用IOkDa和30kDa的滤膜超滤。
5.根据根据权利要求1所述从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于Sl 所述粗提物，透析需用0. 05mol/L, pH8. 0的Tris-HCl为透析平衡液。
6.根据根据权利要求1所述从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于S7 所述亲和载体，以0. lmol/L, ph7. 8硼酸-硼砂缓冲液平衡。
7.根据权利要求6所述从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于亲和层析先用0. lmol/L，ph7. 8硼酸-硼砂缓冲液洗脱，再改用0. 25mol/L，ph4. 0醋酸钠一醋酸缓冲液，2mL/min洗脱，最后用0. 5 mol/L, pHl. 5的NaCl-HCl缓冲液洗脱。
全文摘要
本发明提供一种从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法。通过绿豆，捣碎，过滤，盐析，离心，取沉淀溶解，超滤，透析，离心，制得绿豆胰蛋白酶抑制剂粗提物，用壳聚糖微粒为亲和载体，做亲和层析纯化，得到较高提取率的胰蛋白酶抑制剂，且成本较低，操作简便。
文档编号C07K1/30GK102432681SQ20111039580
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月4日 优先权日2011年12月4日
发明者蔡少娟 申请人:汕头市中乾网络科技有限公司