专利名称：定制的分子印迹聚合物(mip)单元的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子印迹聚合物(MIP)单元，所述分子印迹聚合物(MIP)单元具有包括至少一个靶结合位点的表面，所述靶结合位点被配置为类似靶分子，以及涉及用于制备所述分子印迹聚合物(MIP)单元的方法。本发明还涉及MIP单元用于检测溶液中的靶分子的用途。
背景技术：
近来，在全世界范围内对于监测水质的关注增长。受到特别关注的领域是有害健康的化合物，如药剂、杀虫剂、毒素等向环境中的释放。这些化合物可能持续存在于地下水以及人类所接触的任何其它水中。对有害化合物的监测是至关重要的，以确保人们所接触的水是安全的并且不含可能导致健康问题的污染物。至今，存在数种检测技术，但是因为多种原因监测水中的化学污染物是困难的。例如，很多化合物以非常低的浓度存在，这使得检测困难。此外，检测灵敏度经常由于可能存在于环境浓缩物中的抑制性化合物而降低。结果，产生了很多假阳性信号。当前，在分子印迹聚合物(在下文称作MIP)领域中的研究正在加速。由于MIP特异性识别化合物如药物、激素、蛋白质等的能力，它吸引了大量关注。分子印迹是一种通用技术，它将识别特性引入至合成聚合物中。可以通过从官能单体的混合物在起模板作用的分析物的存在下合成高度交联的聚合物来制造MIP。在用溶剂萃取出分析物之后，分子印迹留在聚合物中，它可以识别相同的模板分子或其类似物。MIP不像抗体那么特异，但是对于特异性靶标拥有高亲和性(例如，咖啡因或山梨糖醇，参见Feng，L.等，基于分子印迹的电合成聚合物用于测定山梨 Il 酉享白勺生物传感器(Biosensor for the determination of sorbitol based on molecularly imprinted electrosynthesized polymers),生物传感器 &生物电子学 (Biosensors&Bioelectronics)，2004，19，1513-1519)，并且 MIP 通常对于类似的分子具有不可忽略的亲和性(例如，针对青霉素G(PeniCillin G)制备的MIP不仅对于原始模板， 并且也对其它相关的β-内酰胺抗生素显示高亲和性，参见Benito-Pena，Ε.等，用于分子印迹聚合物测定的荧光青霉素的分子工程(Molecular engineering of fluorescent penicillins for molecularly imprinted polymer assays), Anal. Chem.(化学年报)， 2006，78，2019-2027)。取决于应用，这可能是缺点，但是它也可能是优点。例如，如果有人考虑将基于MIP 的传感系统应用于监测环境污染物，例如，饮用水中的药理学化合物，他不需要对于每种污染物制造不同的MIP，而仅需对每个污染物家族制造不同的MIP。现行的检测方案，如配合化学样品处理的层析法或电泳法，以及基于固相的萃取例如经由MIP是费时的并且不适合用于野外或在野外处应用。这些技术需要收集废水样品运送至实验室，在那里需要耗费劳力的萃取和分析以检测感兴趣的靶化合物的存在。此外，目前可得的MIP检测方案遇到很多假阳性信号产生的困难，特别是在通过非共价印迹制备MIP的情况下。从而，在本领域对于提供用于感兴趣的靶分子，例如水中存在的污染物和其它环境浓缩物的检测的替代方法存在需求。这种方法应该是方便的、廉价的并且在相当程度上避免假阳性信号的产生。更具体地，这种方法应该能够在其实际环境中检测靶分子；即在发现它们的环境中；例如地下水或废水。发明概述 本发明的一个目标是满足上述需求并提供能够特异地并且选择性地在其自然环境中检测感兴趣的靶分子的MIP单元。本发明的这个和其它目标通过根据所附权利要求所述的分子印迹聚合物(MIP) 单元实现。因而，在第一方面本发明涉及一种分子印迹聚合物(MIP)单元，所述单元具有包括至少一个靶结合位点和表面结合的可带电荷的基团的表面。靶结合位点被配置为类似感兴趣的靶分子。表面结合的可带电荷的基团总量的至少80%位于至少一个靶结合位点中，使得与靶分子的静电相互作用能够发生在所述位点中。本发明的MIP单元包括至少一个靶结合位点，所述位点被配置为类似靶分子；即所述位点在其尺寸和形状方面与感兴趣的靶标互补。存在数个因素影响靶标与MIP单元之间相互作用。首先，靶结合位点的形状和尺寸应该匹配靶分子的形状和尺寸。此外，疏水相互作用增强在靶结合位点中与靶分子的相互作用。因为靶分子经常是带电荷的实体，在靶分子要结合的位点中可带电荷的基团的存在允许在这些位点处能够发生静电相互作用，使得更进一步提高了靶标-聚合物相互作用。从而，需要将表面电荷；即存在的表面结合的可带电荷的基团，定位至靶结合位点，同时减少在非印迹位点处和MIP单元表面上的其它位点处存在的可带电荷的基团。在MIP的制备过程中，特别是通过非共价印迹方法，通常形成很多印迹位点。这些印迹位点中的一些是“假”靶结合位点，即在尺寸和形状上不与感兴趣的靶标互补的印迹位点。归因于在这种“假”位点上和还在MIP单元的表面的非印迹部分上的表面结合的可带电荷基团的存在，靶分子仍能结合至该MIP单元，但导致高比例的假阳性信号。这种非特异结合使得难以确定所吸附的分子是否真正是靶向的那一个。表面结合的可带电荷基团典型地由印迹过程中所使用的官能单体的质子化或去质子化产生。在本发明的MIP单元中，表面结合的可带电荷基团的总量的至少80%位于能够使与靶分子的静电相互作用在这样的一个或多个位点中发生的至少一个靶结合位点中。典型地，表面结合的可带电荷基团的总量的至少90%，例如至少95%位于这样的靶结合位点中。从而，靶分子被结合在“正确的”印迹位点，即被配置为类似靶分子的靶结合位点并且因此减少了假阳性信号的产生。因此，根据本发明的MIP单元是稳定的、稳健的和靶标特异的。根据本发明的MIP单元可以以具有50nm至5 μ m范围内的直径的粒子的形式存在。可以根据所使用的特异检测技术而改变粒子的尺寸。尺寸小于50n m的粒子通常含有非常少的靶结合位点并且可能难以制备。根据本发明的MIP单元也可以是厚度在20nm至20 μ m范围内的膜的形式。可以将这样的膜应用至例如叉指(interdigitated finger)形式的(微)电极。 在靶标结合时，可以观察并探测到电容的变化。厚度在上述范围内的膜是合适的。当膜的厚度小于20nm时，所述膜可能由于聚合物表面相互作用而导致变形，例如由于聚合物链的钉扎(pinning)。相反，膜厚超过20 μ m 是不实用的，因为靶标向膜内部的渗透比较慢，并且导致靶结合位点的占用减少。在备选实施方案中，MIP单元还包括选自包括以下各项的组的识别标志(identity tag)荧光团、量子点和金纳米粒子。如果检测在混浊样品中进行；即包含大量其它非印迹背景信号粒子的样品，这些实施方案是适合使用的。在另一方面，本发明涉及根据上面所述的MIP单元用于检测溶液中靶分子的用途。因此，根据上面所述的至少一个MIP单元与可能包含感兴趣的靶分子的溶液接触。本发明人已经发现这可以通过测量上述MIP单元在溶液中的团聚速率来获得。在根据本发明的MIP单元中，在给定pH下粒子的有效电荷状态将主要可以通过印迹位点的数目来确定。这归因于表面结合的可带电荷基团在靶结合位点中的定位，而余下的粒子表面(即非印迹位点和非特异性印迹位点)基本上保持不带电荷。从而，在与靶分子结合时，MIP单元立即将具有接近于0的有效电荷Zrff。这对团聚速率有影响，因为基本上不带电荷的MIP单元将开始聚集。因此可以使用团聚速率作为所结合的靶分子的量的量度。使用团聚检测与MIP单元的结合事件本身是独特的并且在数个方面优于其它检测方案。团聚直接与结合事件相关。如果模板化合物没有结合，MIP单元将不团聚。如上所述，当检测在混浊样品中进行时，存在“干扰”粒子的数种信号，并且这些可能干扰本发明的MIP单元并且引起过度的聚集。在这样的情况下，使用识别标签是高度有利的，例如荧光团、量子点、金纳米粒子以定位特异性结合事件。在备选的实施方案中，对溶液中靶分子的检测可以通过测量MIP单元的净有效电
荷Zeff进行。如在上文中提到的，当靶分子结合至本发明的MIP单元时，它们的净有效电荷Zeff 将改变至接近于0的Zrff。从而，通过简单地测量Zrff，即使不发生任何团聚，也能够检测到所感兴趣的靶分子的存在。可以使用本发明的MIP单元在野外，即在通常会发现它们的环境中特异地并且选择性地检测所感兴趣的靶分子。在再另一个方面，本发明涉及制备具有上述特征的定制的MIP单元的方法。本发明人已经发现关于所论述的对靶标的非特异结合改进分子印迹的一个方法是，有效地封闭在MIP制备过程中形成的非特异性印迹位点。这可以通过减少在这些位点上以及在非印迹位点上存在的表面结合的可带电荷基团来实现，以使靶分子结合至“正确的”靶结合位点。根据本发明的方法包括(a)提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有包括至少一个靶结合位点和表面 结合的可带电荷的基团的表面，所述靶结合位点被配置为类似靶分子，(b)使来自步骤(a)的一个或多个MIP单元在第一溶剂中与至少一个模板分子接触，使得一个或多个模板分子结合至所述一个或多个MIP单元，(c)通过加入钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的所述表面结合的可带电荷的基团，(d)通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子。钝化剂通过在第二溶剂中的冲洗时保持稳定的键结合至一个或多个单元表面。从而，产生了主要在正确的一个或多个靶结合位点中的包含可带电荷基团的MIP 单元。本发明的方法简单、廉价并且使得能够大量生产具有在靶结合位点内定位的表面结合的可带电荷的基团的定制的MIP单元。MIP单元在第一溶剂中与模板分子接触。在一些实施方案中，第一溶剂具有的PH 分别产生相反极性的表面结合的可带电荷基团与一个或多个模板分子，使得模板分子可以通过静电相互作用结合至该单元。从而，模板分子将特异性地(即在靶结合位点中)并且同时非特异性地结合在MIP单元表面上。从而在步骤(b)中形成了被模板分子占据的MIP 单元。为了移除在没有被配置为类似感兴趣的靶标的位点处，以及在MIP单元表面上的非印迹位点处的非特异性结合，钝化步骤，即步骤(c)包括-移除没有特异性地结合至被配置为类似靶分子的一个或多个结合位点的一个或多个模板分子，以使表面结合的可带电荷基团暴露在所述表面上，-在钝化剂与表面结合的可带电荷基团之间形成稳定的键。钝化剂将与非特异性地结合至表面的模板分子竞争，以使这些分子在与钝化剂的接触中被移除。然而，将不移除在正确的靶结合位点中结合的模板分子，因为在由于在这些空穴中的尺寸和形状的互补性、静电相互作用和疏水相互作用它们保持结合。在加入钝化剂时，表面结合的可带电荷基团变得暴露在MIP单元的表面上。钝化剂能够与这些暴露的表面结合的可带电荷基团形成未定的键并且这些键即使在用第二溶剂冲洗而洗脱模板之后仍保持对水解稳定。例如，这样的键可以选自酯键和酰胺键的组。通常在模板和交联剂的存在下聚合官能单体典型地提供具有包括至少一个被配置为类似靶分子的靶结合位点的MIP单元。在本发明的实施方案中，可以在第一溶剂中通过在一个或多个模板分子的存在下聚合官能单体同时进行步骤(a)和步骤(b)。在这种情况下，当官能单体在第一溶剂中并且在模板分子的存在下聚合时，形成了 MIP单元。在一些实施方案中，官能单体是甲基丙烯酸官能单体，例如甲基丙烯酸。这种单体是合适的因为它们的羧基是普通的氢键结合并且是分子印迹中的酸性官能团。如果使用甲基丙烯酸单体，模板化合物可以选自以下各项的组β阻滞药，例如普萘洛尔和倍他洛尔。与上述单体和β阻滞药一起使用的合适的钝化剂是重氮甲烷、苯基重氮甲烷和酰卤。本发明的这些和其它方面从下文描述的实施方案将变得显而易见来，并将参考所述实施方案进行阐述。附图简述
图1图解了用于分子非共价印迹的一般方法。图2图解了根据本发明的MIP单元。图3图解了 ρΗ对团聚速率的依赖性。图4图解了本发明的MIP单元的团聚速率以及在团聚之后超声波处理的作用。图5图解了在非印迹聚合物(NIP)单元的情况下缺少团聚。图6a图解了当使用不同浓度的普萘洛尔作为靶分子时的团聚速率。图6b图解了当使用不同浓度的倍他洛尔作为靶分子时的团聚速率。图7显示了本发明的MIP单元区分不同手性的靶分子的能力。图8图解了测量团聚速率的静态光散射方法。发明详述在图1中，描述了非共价印迹的一般方法步骤。官能单体100与至少一个模板分子101混合，所述模板分子101类似至少一个感兴趣的靶分子。可以使用交联剂102控制聚合物基质的形态、稳定结合位点并且提供机械稳定性。合适的交联剂取决于用于印迹的单体，并且是本领域技术人员已知的。官能单体100基于非共价相互作用，如氢键、离子键和疏水相互作用将其自身排列在模板分子101周围。在聚合之后，将模板分子101通过在溶剂中冲洗而洗脱，并将分子印迹103留在聚合物中，所述印迹能够识别相同的模板分子101或其类似物。从而，所得到的印迹聚合物拥有对于模板分子103永久的“记忆”，能够使MIP结合与模板密切相关的靶标化合物。根据经验，已经发现特异性随着聚合物与靶标上的结合“中心”之间键的数目增力口。这可以用模板分子101不同侧面的不同形状来说明。非共价印迹方法是有吸引力的，因为它简单并且可以应用于大数量的模板。此外， 可以在温和条件下容易地将模板从聚合物移除。然而，非共价印迹带有的一个缺点是产生这样的印迹位点，所述印迹位点可能充当“假”靶结合位点并结合靶分子的印迹位点，尽管在尺寸和形状上并不互补。这种非特异性结合使得难以确定所吸附的分子是否真正是被靶向的那一个。假阳性信号的产生(至少部分地)取决于MIP单元上表面结合的可带电荷的基团的存在。这种表面结合的可带电荷的基团在溶液中容易变得带电荷并且静电吸引极性相反的靶标化合物。从而，需要将表面结合的可带电荷基团定位至MIP单元上正确的靶结合位点；即被配置为类似所感兴趣的靶分子的位点。这样，增强了 MIP-靶标相互作用并且MIP单元变得更有选择性。如本文使用的，术语“(多个)可带电荷的基团”意指当遇到分别导致官能团的去质子化或质子化的溶剂或缓冲溶液时，成为带电荷基团的官能团。
这种可带电荷官能团的实例是羧基和氨基。图2中图解了根据本发明的MIP粒子200。MIP粒子200具有包括至少一个靶结合位点202和表面结合的可带电荷基团203的表面201。在该情况下，可带电荷基团是可带负电荷基团。靶结合位点202被配置为类似靶分子204。如本文所使用的，术语“被配置为类似靶分子”意指靶结合位点基本上在尺寸和形状上与感兴趣的靶分子互补。从而，靶结合位点可以结合与印迹过程中所使用的模板分子相同的模板分子或者与使用的模板密切相关的靶标化合物。表面结合的可带电荷基团203的总量的至少80%位于至少一个靶结合位点202 中，使得与靶分子的静电相互作用发生在所述位点202中。通常在非共价印迹过程中，形成非特异性的，即与感兴趣的靶标在尺寸和形状上不互补的印迹位点205。表面结合的可带电荷基团203在这些位点以及在非印迹位点上的存在可以导致由于与靶分子的非特异性相互作用引起的假阳性结合信号。因此需要将存在的表面结合的可带电荷基团203集中至一个或多个靶结合位点 202，所述靶结合位点202被配置为类似感兴趣的靶标。在根据本发明的MIP粒子中，表面结合的可带电荷基团203的总量的至少80%，优选地至少90%，例如至少95%位于至少一个靶结合位点202中。从而，增强了与靶分子的相互作用，并且这是在这种位点202中在形状和尺寸两者上的相似性、静电相互作用和疏水相互作用的结果。在非印迹部分和不拥有靶结合位点202的选择性特性的印迹位点205上少量存在的表面可带电荷基团203将不会在相当程度上被靶分子所占据。从而，提高了本发明的MIP 粒子200的检测灵敏度并且减少了假信号的产生。应该注意可带电荷基团也可以在该粒子内部存在；即在聚合网络的孔中，但是这些通常不易接近靶分子。根据本发明的MIP单元可以是粒子或膜的形式。MIP粒子可以以任意形状存在，但是通常是直径为至多1(^111，例如直径在5011111至 5 μ m的范围内，例如在50nm至1，5 μ m的范围内的球形。粒子的尺寸可以根据所使用的特异性检测技术而变化。如果检测技术需要粒子在水中混沌地移动，如光子相关光谱法所需要的，那么重要的是粒子不沉淀。在上述直径范围内的粒子即使在数小时之后也不沉淀。 此外，具有低于50nm尺寸的粒子通常含有非常少的靶结合位点(对于低分子量模板分子，靶结合位点与聚合物的重量的重量比大约在1 1000至1 100的范围内)并且通常难以制备。根据本发明MIP单元也可以是厚度在20nm至20 μ m范围内的膜。可以将这样的膜应用至例如叉指形式的(微)电极。在靶标结合时，可以观察并检测到电容的变化。公知的是电容改变或者与固定的电荷变化或者与固定的偶极矩变化有关。在本发明的情况下，靶标结合将导致电荷数的降低并且从而，印迹膜的电容将改变。厚度在上述范围内的膜是合适的。当膜的厚度小于20nm时，该膜可能由于聚合物表面相互作用而导致变形，例如由于聚合物链的钉扎导致。相反，膜厚超过20 μ m是不实用的，因为靶标向膜内部的渗透比较慢，并且导致靶结合位点的占用减少。在备选实施方案中，MIP单元还包括选自包括以下各项的组的识别标志荧光团、 量子点和金纳米粒子(没有显示)。如果检测在混浊样品中进行，即包含大量背景信号粒子的样品，这些实施方案是适合使用的。在又另一方面，本发明涉及根据上面所述的MIP单元用于检测溶液中靶分子的用途。该检测可以是定性的或定量的；即本发明不仅能够测定感兴趣的靶分子的存在， 也能测定溶液中靶分子的浓度。本发明人已经发现这可以通过测量溶液中的上述MIP单元的团聚速率来实现。决定胶体溶液稳定性的主要物理和化学参数是公知的(参见，例如Robert J. Hunter,胶体禾斗学基石出(Foundations of colloid Science), vol. I, Clarendon Press, 1995，ISBN 0 19 855187 8)并且将仅简要描述。胶体溶液中纳米或微米粒子由于与流体分子的相互作用而混沌地移动(所谓的布朗运动(Brownian motion))。布朗运动导致粒子之间的碰撞。粒子间会遇率(intra particle encounter rate)(碰撞的频率)随粒子浓度的增加而增加但是随粒子尺寸的增加而降低。在这种碰撞的过程中粒子之间的距离随有效离子电荷的减少并随溶液离子强度的增加而降低。在碰撞过程中粒子彼此越接近，它们将彼此结合的可能性越高。在这样的碰撞过程中，如果粒子彼此结合，它们保持结合一段时间，在那之后它们可能再次分开。如果它们结合在一起的时间短于之后用于再次相遇的时间，悬浮液将是稳定的。然而如果两个纳米粒子保持彼此结合的时间足够长，那么下一个粒子可能与这个小团簇碰撞，并与其结合。团簇将因此生长，即，悬浮液中的粒子将团聚，并且该胶体溶液将变得不稳定。因而，团聚速率取决于粒子彼此结合的强度以及会遇率。本发明人已经发现结合强度和会遇率极大地取决于MIP单元的靶结合位点的电荷以及模板分子的电荷。当靶分子与MIP极性相反时，吸附显著地增强并且包含结合了的靶分子的MIP单元将被中和。这使得基本上不带电荷的MIP粒子由于接近的粒子间缔合的更高概率而开始团聚。也可以通过改变用于进行团聚的溶液的pH来控制团聚速率。如图3中所示，团聚的开始是与pH依赖性的。可以选择pH以使由于在这些位点中存在的官能单体残基的去质子化或质子化导致在一个或多个靶结合位点中形成可带电荷基团。同时(Simulateneously)，模板分子在这个pH下应该质子化或去质子化以使模板分子的极性与结合位点的极性相反。在图3中，使用普萘洛尔作为模板并且MIP单元，即MIP粒子由甲基丙烯酸形成， 即可带电荷基团表现为羧基。因为羧基的PKa大约为4并且普萘洛尔的pKa大约为9，这两个实体在大约6的pH下都将带电荷；即羧基将去质子化，并且普萘洛尔将质子化。从而，由于靶分子的吸附而发生团聚。
在足够高的pH(图3中的pH 12)MAA完全去质子化并且带有负电荷。这使得MIP 粒子彼此排斥形成稳定的胶体溶液。同时，在pH 12下普萘洛尔作为中性化合物存在，因此对带负电荷的MIP粒子结合位点具有低结合强度。整体作用是不管普萘洛尔在样品中存在还是不存在，粒子将不会团聚。在低pH(图3中的pH 2.5)下，因为MAA的羧基质子化而导致不带净电荷，MIP粒子是中性的。该中性粒子不结合普萘洛尔，即使后者带有净正电荷。从而，在pH 2. 5和pH 12下，MIP粒子的靶结合位点与靶标化合物之间没有静电相互作用存在，并且因此没有团聚发生。然而，如在pH 6.0下可以观察到的，团聚速率是相当快的，因为MIP粒子的靶结合位点和靶标化合物两者都带电荷。靶标化合物的吸附增强并且这可以通过团聚而被检测到。因此，可能将团聚的开始作为靶标摄取的函数来调节，并且可以在相对少量的靶标摄取下实现对团聚的诱导。这使得能够将检测限推进到更低的靶标浓度。在根据本发明的MIP单元中，在给定PH下该单元的有效电荷状态将主要由靶结合位点的数量决定。这是由于靶结合位点中表面结合的可带电荷基团的定位所导致的，而剩下的粒子表面(即非印迹位点和非特异性印迹位点)保持基本不带电荷。从而，在与靶分子结合时，MIP单元将具有接近于0的净有效电荷Zeff。这对于团聚速率有影响，因为基本上不带电荷的MIP粒子将开始聚集。因此，可以通过简单地测量一个或多个MIP单元的净有效电荷Zrff ■靶分子的吸附。当Zrff下降或增加时(取决于带电荷基团的极性)，这可能是已经吸附了靶分子的指示。例如可以通过监测Z电位检测净有效电荷。当MIP单元是膜或者溶液中悬浮的粒子时，这个检测方案是合适的。当可以测定靶分子和MIP单元的电荷状态时，可能选择其中使两者都带电荷的pH 区间，以便测定团聚速率或Zrff的变化。图4中进一步图解了团聚的诱导。这里，0. 2mg/ml浓度下的MIP单元，即MIP粒子暴露至1. 25mM浓度下的R-普萘洛尔并且聚集的MIP粒子尺寸的变化是显著的。当粒子达到1200nm的尺寸时，对它们进行超声处理约45分钟。在超声处理之后， 重复试验并观察到相同的团聚模式(由图4中的三角形曲线图解)。这证明本发明的MIP 粒子是可再现的并且可以用可控的方式监测。相反，非印迹粒子和模板分子(图5)接触基本上不团聚。在MIP单元制备过程中使用的模板分子可以选自包括以下各项的组药品、激素、 酶、抗体、受体、核酸、病毒、细胞、组织、杀虫剂和包括蛋白质的任意其它材料。通常使用β阻滞药，特别是普萘洛尔和倍他洛尔作为在印迹过程中的模板分子。本发明人已经测定在不同的普萘洛尔和倍他洛尔浓度下的团聚速率。如图6a和6b中所示，将0. 02mg/ml浓度的MIP单元，即MIP粒子暴露在不同的 (S)-普萘洛尔浓度下，并且在更高的普萘洛尔和倍他洛尔浓度下团聚速率显著增加。β阻滞药，例如普萘洛尔或倍他洛尔的浓度典型在0. 05至2. 5mM的范围内。至多达0. 2mg/ml的浓度下的MIP粒子适合用于团聚测定。也可以将本发明的MIP单元设计为评估印迹聚合物的手性。这不是一个普通的任务，它经常需要复杂的实验。在吸附正确手性的靶分子时，本发明的MIP粒子开始团聚，但是将不吸附“错误” 手性的靶标，并且因此将不会发生团聚。这在图7中阐明，其中0. 02mg/ml浓度的MIP单元， 即MIP粒子分别暴露于(S)-普萘洛尔和(r)_普萘洛尔，并且仅有(S)-普萘洛尔由MIP粒子所吸附。即使在低模板分子浓度(在这个具体实施例中为0.025mM)下这也会发生。在高分析物浓度下该性质消失，因为存在大量的“低质量”印迹位点并且这些位点不拥有手性识别能力。通过简单地改变分析物的浓度区分手性与非手性位点的能力简化了印迹优化。这也使得人们能够简单地评价药品的分离质量，其中这种性质极为重要。可以通过例如光子相关光谱(PCS)和静态光散射监测团聚速率。当本发明的MIP单元包含识别标志时，这些MIP单元可能发荧光并且发出光，并且当团聚体生长时，所发射的光强，即团聚体点，变得更亮。这种识别标志也可以帮助在悬浮液中将MIP粒子与其它粒子区分开，例如在Z电位测量过程中。Z电位测量也可以适合于更大MIP粒子的检测，以及当MIP单元是膜的形式时。应该注意可以将本发明的MIP单元，以及作为用于测量靶标吸附的手段的团聚速率，应用于很多情况；即它在任何情况下都不限定于废水污染物的检测。本发明人也已经开发了一种用于制备具有上述特征的定制的MIP单元的方法。这个方法包括(a)提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有包括至少一个被配置为类似靶分子的靶结合位点和表面结合的可带电荷基团的表面，(b)使来自步骤(a)的一个或多个MIP单元与至少一个模板分子在第一溶剂中接触，使所述一个或多个模板分子能够结合至所述一个或多个MIP单元，(c)通过添加钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的表面结合的可带电荷基团，(d)通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子。钝化剂通过键结合至所述一个或多个单元的表面，所述键在第二溶剂中的冲洗时
保持稳定。如本文使用的术语“钝化”意指除去可能引起非特异性结合的表面结合的可带电荷的基团；即将不希望有的可带电荷基团转化为对水解稳定的不带电基团。从而，根据本发明的方法从一开始就使得能够制备可以主要在靶结合位点中带电荷的MIP单元。本发明的方法是简单的、不昂贵的并且能够大量生产具有在靶结合位点中定位的表面结合的可带电荷基团的定制的MIP单元。第一溶剂通常具有分别产生相反极性的表面结合的可带电荷基团和一个或多个模板分子的PH。从而，MIP单元将通过静电相互作用的方式结合至模板分子。通过在模板和交联剂的存在下聚合官能单体典型地提供具有包括至少一个被配置为类似靶分子的靶结合位点的表面的MIP单元。在本发明的实施方案中，可以通过在第一溶剂中在一个或多个模板分子的存在下聚合官能单体同时进行步骤(a)和步骤(b)。在该情况下，当官能单体在第一溶剂中并且在模板分子的存在下聚合时，形成MIP单元。通过实施例的方式，下面的图解阐述了当官能单体甲基丙烯酸和模板分子普萘洛尔在合适的溶剂中混合时，它们产生相反的极性。
权利要求
1.一种制备至少一个定制的MIP单元的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有表面，所述表面包括至少一个靶结合位点和表面结合的可带电荷的基团，所述靶结合位点被配置为类似靶分子；(b)将来自所述步骤(a)的所述一个或多个MIP单元与至少一个模板分子在第一溶剂中接触，使得所述一个或多个模板分子能够结合至所述一个或多个MIP单元；(c)通过加入钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的所述表面结合的可带电荷的基团；以及(d)通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子，其中所述钝化剂通过在所述第二溶剂中的冲洗时保持稳定的键结合至所述一个或多个单元的所述表面。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一溶剂具有分别产生相反极性的所述表面结合的可带电荷的基团和所述一个或多个模板分子的PH。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(c)包括-移除非特异结合至被配置为类似靶分子的所述一个或多个结合位点的一个或多个模板分子，使得所述表面结合的可带电荷的基团暴露在所述表面上，-在所述钝化剂与所述表面结合的可带电荷的基团之间形成稳定的键。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中所述键选自酯键和酰胺键。
5.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中通过在所述第一溶剂中在所述一个或多个模板分子的存在下聚合官能单体同时进行所述步骤(a)和(b)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述官能单体是甲基丙烯酸官能单体。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中所述模板化合物选自β阻滞药的组。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中所述钝化剂选自重氮甲烷、苯基重氮甲烷和酰卤。
9.使用根据前述权利要求中任一项所述的方法制备的MIP单元用于检测溶液中的靶分子的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中通过测量所述MIP单元在所述溶液中的团聚速率进行所述检测。
11.根据权利要求9所述的用途，其中通过测量所述MIP单元的净有效电荷Zrff进行所述检测。
12.—种分子印迹聚合物(MIP)单元000)，所述单元(200)具有表面001)，所述表面 (201)包括至少一个靶结合位点(201)和表面结合的可带电荷的基团Ο02)；所述靶结合位点(201)被配置为类似感兴趣的靶分子；其中表面结合的可带电荷的基团Ο02)的总量的至少80%位于所述至少一个靶结合位点Ο01)中以使与靶分子的静电相互作用能够发生在所述位点Ο01)中。
13.根据权利要求12所述的MIP单元，其中表面结合的可带电荷的基团的总量的至少 90 %位于所述至少一个靶结合位点中。
14.根据权利要求13所述的MIP单元，其中表面结合的可带电荷的基团的总量的至少 95 %位于所述至少一个靶结合位点中。
15.根据权利要求12至14中的任一项所述的MIP单元，其中所述单元是直径在50nm 至5μπι范围内的粒子的形式。
16.根据权利要求12至14中的任一项所述的MIP单元，其中所述单元是厚度在20nm 至5μπι范围内的膜的形式。
17.根据权利要求12至16中的任一项所述的MIP单元，所述MIP单元还包括选自包括以下各项的组的识别标志荧光团、量子点和金纳米粒子。
18.根据权利要求12至17中的任一项所述的MIP单元用于检测溶液中的靶分子的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中通过测量所述MIP单元在所述溶液中的团聚速率进行所述检测。
20.根据权利要求18所述的用途，其中通过测量所述MIP单元的净有效电荷Zrff进行所述检测。
全文摘要
一种制备至少一个定制的MIP单元的方法，所述方法包括(a)提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有包括至少一个靶结合位点和表面结合的可带电荷的基团的表面，所述靶结合位点被配置为类似靶分子；(b)将来自步骤(a)的所述一个或多个MIP单元与至少一个模板分子在第一溶剂中接触，使得所述一个或多个模板分子能够结合至所述一个或多个MIP单元；(c)通过加入钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的表面结合的可带电荷的基团；以及(d)通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子，其中所述钝化剂通过在所述第二溶剂中的冲洗时保持稳定的键结合至所述一个或多个单元的表面。
文档编号C08F8/10GK102317322SQ201080007166
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月10日 优先权日2009年2月16日
发明者克里斯蒂娜·赖姆霍特, 叶磊, 吉松惠一, 比约恩·勒温, 比约恩·马尔默, 阿纳扎·克勒泽 申请人:依米戈有限公司