本发明涉及有机化学和药物化学领域，具体为一种稳定氮氧自由基标记的2,4-二胺基嘧啶类极光激酶A抑制剂，以及这种抑制剂的制备方法和用途。
背景技术：
激光激酶(Aurora kinase)是一类新型的苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，在中心体复制、两极纺锤体形成、染色体重排和染色体检查点监测等重要的有丝分裂过程中发挥着至关重要的作用(Cancer Metastasis Rev.2003,22,451)。Aurora激酶家族有三种结构和功能高度相关的亚群:即Aurora-A、Aurora-B和Aurora-C。它们的蛋白质一级结构均含有一个N-端调控区和一个C-端催化区，且酶结构域序列相似度达71％，ATP腺嘌呤环结合位点的残基也相同；但在细胞分裂中它们具有完全不同且互不重叠的功能。Aurora A从有丝分裂的S期末至下一个分裂周期的G期开始，影响中心体的分离、成熟以及两极纺锤体的形成(Nat.Rev.Cancer 2005,5,42)。Aurora B在有丝分裂早期位于染色体的着丝粒区域，分裂后期则从着丝粒移动到微管。目前对Aurora C功能的研究相对较少。1998年，美国学者Bischoff等首次发现Aurora激酶在多种癌细胞中过度表达，且与染色体的不稳定性、癌变、肿瘤增殖和化学抗性等过程密切相关(EMBO J.1998,17,3052)。由于Aurora激酶独特的药理作用机制，以Aurora激酶为靶点的药物开发已成为抗癌药物研究的热点之一(Expert Opin.Drug Discovery 2011,6,291)。
迄今为止，还没有Aurora激酶抑制剂用于临床治疗，仅有数个Aurora激酶抑制剂在进行临床试验，如VX-680、PHA-739358、AZD-1152、MLN8054、SNS-314、ENMD-2076等(药学进展2008,32,337；中国抗生素杂志2010,35(9),641)。但是，这些小分子都存在着不同程度的毒副作用，尽管药物治疗前景光明，还有待进一步化学修饰研究，减少其副作用。
相对于Aurora-B而言，Aurora-A在结肠癌、卵巢癌、胃癌以及乳腺癌等许多肿瘤中均过量表达。Aurora-A的过度表达使细胞有丝分裂检测点的监测功能失控，导致分裂异常，癌基因扩增，正常细胞转化为癌细胞(J.Cell Sci.2007,120,2987)。Aurora-A能更加有效地引起细胞有丝分裂停滞并快速诱导细胞凋亡，因而，以Aurora-A为靶点的抗肿瘤药物治疗在一定程度上将优于Aurora-B(Curr.Opin.Invest.Drugs 2006,7,1044)。就报道的选择性Aurora-A激酶抑制剂而言，目前只有加拿大Millennium公司研制的MLN8237在进行Ⅰ期临床试验(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007,104,4106)。最近，美国学者Cochran和Lwerence分别报道了一类2,4-二苯环取代的单嘧啶环类化合物，有些化合物对Aurora-A的选择性较Aurora-B高达1000倍，但由于它们的溶解性和/或膜穿透能力较差，致使其抗肿瘤活性较低，失去了进一步开发的价值 (J.Med.Chem.2012,55,7392)。另外，挪威学者Prime M.E.报道的一类新型吡唑取代的酞嗪酮类化合物，对Aurora-A激酶抑制的选择性大于1000，目前是否进入临床前研究尚不清楚(J.Med.Chem.2011,54,312)。
考虑到稳定氮氧自由基作为有效的药物转运体，能提高药物的溶解性，并促使药物优先穿过癌变细胞膜(Science 2001,291,266；J.Med.Chem.2005,48,6393)。本发明设计合成一种稳定氮氧自由基标记的嘧啶类化合物，体外实验表明这种化合物对癌细胞具有较好的细胞毒性，且对Aurora A较Aurora B有选择性抑制作用，同时这种化合物具有适当的脂水分配系数，是一种具有开发为新型抗癌药物的化合物；在制备方法上，本发明通过简单方法高效地合成了关键中间体及其目标化合物。
技术实现要素：
本发明的目的在于利用稳定氮氧自由基作为有效的药物转运体，期望提高化合物的溶解性，并促使化合物优先穿过癌变细胞膜，发挥抗癌效果。细胞毒性实验发现本发明化合物对多种癌细胞具有较强的体外抑制作用，同时对Aurora A较Aurora B有选择性抑制作用。
一种具有抗癌活性的结构如式Ⅰ的稳定氮氧自由基标记的极光激酶A抑制剂，
其中：
R为邻位氯，或间位氯，或对位氯，或邻位羟基，或间位羟基，或对位羟基。
X为硝基，或氟，或氯，或溴。
一种具有抗癌活性的结构如式Ⅱ的稳定氮氧自由基标记的极光激酶A抑制剂，
其中：
R为邻位氯，或间位氯，或对位氯。
X为硝基，或氟，或氯，或溴。
本发明中式Ⅰ所示化合物的制备方法，其特征是以2,4-二氯-5-硝基嘧啶，或2,4-二氯-5-氟嘧啶，或2,4,5-三氯嘧啶，或2,4-二氯-5-溴嘧啶为原料，首先和邻氯苯胺，或间氯苯胺，或对氯苯胺，或邻羟基苯胺，或间羟基苯胺，或对羟基苯胺反应生成2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-间氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-对氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-邻羟基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-间羟基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-对羟基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-邻氯苯胺-5-氟嘧啶，或2,5-二氯-4-邻氯苯胺嘧啶，或2-氯-4-邻氯苯胺-5-溴嘧啶(J.Med.Chem.2012,55,7392)；同时以叔丁氧羰基保护的对氨基苯甲酸为原料，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBT)存在的条件下与4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(TMPO)缩合，再在三氟乙酸的二氯甲烷溶液中脱除保护基即得对氨基苯甲酰4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(J.Med.Chem.2001,44,441)；最后上述制得的两种化合物在强酸催化下在嘧啶环的2-位发生取代反应得到式Ⅰ所代表的目标化合物。
本发明中式Ⅱ所示化合物的制备方法，其特征是以2,4-二氯-5-硝基嘧啶，或2,4-二氯-5-氟嘧啶为原料，首先和对氨基苯甲酰邻氯苯胺，或对氨基苯甲酰间氯苯胺，或对氨基苯甲酰对氯苯胺反应生成N-(2-氯-5-硝基-嘧啶-4)-氨基苯甲酰邻氯苯胺，或N-(2-氯-5-硝基-嘧啶-4)-氨基苯甲酰间氯苯胺，或N-(2-氯-5-硝基-嘧啶-4)-氨基苯甲酰对氯苯胺，或N-(2-氯-5-氟-嘧啶-4)-氨基苯甲酰邻氯苯胺(J.Med.Chem.2012,55,7392)；同时以叔丁氧羰基保护的对氨基苯甲酸为原料，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBT)存在的条件下与4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(TMPO)缩合，再在三氟乙酸的二氯甲烷溶液中脱除保护基即得对氨基苯甲酰4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(J.Med.Chem.2001,44,441)；最后上述制得的两种化合物在强酸催化下在嘧啶环的2-位发生取代反应得到式Ⅱ所代表的目标化合物。
本发明中式Ⅰ、Ⅱ所述的化合物的制备方法，其特征是反应中对氨基苯甲酰4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物与相应N-(2-氯-5-取代-嘧啶-4)-氨基苯甲酰氯苯胺反应的物质量比为1:1.05-1.20，反应温度为70–110℃，催化剂为盐酸。
本发明中式Ⅰ、Ⅱ所述的化合物对人宫颈癌细胞HeLa、人非小细胞肺癌细胞A-549、人肝癌细胞HepG2和人结肠癌细胞LoVo四种癌细胞生长有显著的抑制作用，其中绝大部分化合物对这些癌细胞增殖的抑制作用明显强于阳性对照VX-680，尤其化合物Ⅰg和Ⅱd对这四种癌细胞都有较强的活性，并且对极光激酶A(Aurora A)较极光激酶B(Aurora B)显示明显的选择性抑制。因此本发明的化合物可用于制备抗癌药物。
下面通过实施例进一步说明本发明的方法。应理解的是，本发明实施例的制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简 单改进都属于本发明要求保护的范围。
具体实施方式
本发明提供以下的实施例：
实施例1：2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶的制备
取2,4-二氯-5-硝基嘧啶(205mg，1.05mmol)溶于干燥的二氯甲烷，室温下加入邻氯苯胺(125mg，1.0mmol)并继续反应8h，反应结束后蒸除溶剂，残渣直接柱层析得产物2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶。收率:89％；黄色固体；1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ10.68(s,1H),9.22(s,1H),8.34-8.32(m,1H),7.51-7.21(m,3H)。
用间氯苯胺，或对氯苯胺，或邻羟基苯胺，或间羟基苯胺，或对羟基苯胺分别代替邻氯苯胺反应制备2-氯-4-间氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-对氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-邻羟基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-间羟基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-对羟基苯胺-5-硝基嘧啶。
用2,4-二氯-5-氟嘧啶，或2,4,5-三氯嘧啶，或2,4-二氯-5-溴嘧啶代替2,4-二氯-5-硝基嘧啶反应制备2-氯-4-邻氯苯胺-5-氟嘧啶，或2,5-二氯-4-邻氯苯胺嘧啶，或2-氯-4-邻氯苯胺-5-溴嘧啶。
实施例2：对氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
取1.8g Boc保护的对氨基苯甲酸溶解于干燥的二氯甲烷中，依次加入1.8g EDC，1.22g HOBt和1.53g化合物TMPO。室温搅拌至反应完全。有机相加水洗涤，并用无水硫酸镁干燥；蒸除溶剂并柱层析，得粉色固体2.52g，收率90％。MS(ESI)392.15[M+2H]+。
称取上述反应所得产物2.5g溶于15ml二氯甲烷中，滴加6ml三氟乙酸，室温搅拌反应0.5h后，减压蒸除溶剂，所得固体柱层析，得白色固体1.74g，收率94％。MS(ESI)292.15[M+2H]+。
实施例3：N-(5-硝基-4-邻氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
将2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶(280mg，1mmol)和对氨基苯甲酰4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(430mg，1.5mmol)溶于乙醇中，再加入盐酸的二氧六环溶液2ml，加热回流。待反应基本完全后停止反应，蒸除溶剂，直接柱层析得黄色固体,收率:62％。
m.p.:208-210℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝65:35,0.8ml/min,t＝21.23min,95.0％；IR(KBr,cm-1)3362,3015,1629,1536,1506,1422,1332,1195,1025,836,726；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.95；HRMS(ESI)540.2111for[M+2H]+(calcd 540.2121for C26H31N7O4Cl).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅰa。
实施例4：N-(5-硝基-4-间氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-4-间氯苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黄色固体，收率:68％。
m.p.:217-219℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝72:28,0.8mL/min,t＝13.70min,98.0％；IR(KBr,cm-1)3376,3281,3022,1636,1610,1584,1541,1526,1481,1414,1329,1202,1137,858,726；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.92,△H(G)＝2.75；HRMS(ESI)540.2117for[M+2H]+(calcd 540.2121for C26H31N7O4Cl).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅰb。
实施例5：N-(5-硝基-4-对氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-4-对氯苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黄色固体，收率:72％。
m.p.:225-227℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝72:28,0.8mL/min,t＝14.18min,96.5％；IR(KBr,cm-1)3379,2995,1639,1616,1579,1529,1489,1404,1202,841,719；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.88,△H(G)＝2.85；HRMS(ESI)540.2117for[M+2H]+(calcd 540.2121for C26H31N7O4Cl).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅰc。
实施例6：N-(5-硝基-4-邻羟基苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-4-邻羟基苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黄色固体，收率:61％。
m.p.:126-128℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝80:20,0.8mL/min,t＝7.18min,95.6％；IR(KBr,cm-1)3369,2940,1641,1624,1576,1411,1459,1327,1205,838,746；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.95；HRMS(ESI)522.2463for[M+2H]+(calcd 522.2459for C26H32N7O5).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅰd。
实施例7：N-(5-硝基-4-间羟基苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-4-间羟基苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黄色固体，收率:52％。
m.p.:97-99℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝77:23,0.8mL/min,t＝8.41min,99.8％；IR(KBr,cm-1)3324,2985,1678,1619,1591,1529,1422,1332,1207,853,786,724；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.86,△H(G)＝2.98；HRMS(ESI)522.2453for[M+2H]+(calcd 522.2459for C26H32N7O5).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅰe。
实施例8：N-(5-硝基-4-对羟基苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-4-对羟基苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黄色固体，收率:63％。
m.p.:234-236℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝68:32,0.6mL/min,t＝8.68min,98.5％；IR(KBr,cm-1)3421,3281,2344,1686,1616,1579,1499,1394,1267,1200,841,744,699；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.94,△H(G)＝3.05；HRMS(ESI)522.2454for[M+2H]+(calcd522.2459for C26H32N7O5).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅰf。
实施例9：N-(5-氟-4-邻氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-4-邻氯苯胺-5-氟嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得白色固体，收率:50％。
m.p.:137-139℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝50:50,0.8mL/min,t＝34.94min,95.8％；IR(KBr,cm-1)3384,3277,2980,2942,2628,2496,1678,1606,1574,1511,1494,1444,1399,1327,1190,1038,850,776；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.92,△H(G)＝2.85；HRMS(ESI)512.2090for[M+H]+(calcd 512.2097for C26H31N6O2FCl).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅰg。
实施例10：N-(5-氯-4-邻氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-4-邻氯苯胺-5-氯嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得白色固体，收率:42％。
m.p.:156-158℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝50:50,0.8mL/min,t＝32.93min,100％；IR(KBr,cm-1)3381,3273,2980,2606,2501,1678,1611,1569,1501,1447,1329,1187,1033,853,776,751；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.90,△H(G)＝2.65；HRMS(ESI)513.1928for[M-14]+(calcd 527.1729for C26H29N6O2Cl).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅰh。
实施例11：N-(5-溴-4-邻氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-4-邻氯苯胺-5-溴嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得白色固体，收率:46％。
m.p.:167-168℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝65:35,0.8mL/min,t＝11.36min,99.3％；IR(KBr,cm-1)3366,2982,2940,2499,1609,1569,1509,1494,1444,1387,1324,1187,1033,851,768；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.95；HRMS(ESI)557.1422for[M-14]+(calcd 571.1224for C26H29N6O2ClBr).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅰi。
实施例12：N-{5-硝基-4-氨基-(苯甲酰邻氯苯胺)-嘧啶-2}-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-5-硝基-4-氨基-(苯甲酰邻氯苯胺)-嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黄色固体，收率:72％。
m.p.:274-276℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝75:25,0.8mL/min,t＝9.47min,99.7％；IR(KBr,cm-1)3404,2995,1656,1631,1539,1424,1332,1222,853,766；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.92；HRMS(ESI)659.2490for[M+2H]+(calcd 659.2492for C33H36N8O5Cl).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅱa。
实施例13：N-{5-硝基-4-氨基-(苯甲酰间氯苯胺)-嘧啶-2}-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-5-硝基-4-氨基-(苯甲酰间氯苯胺)-嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黄色固体，收率:59％。
m.p.:248-249℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝75:25,0.8mL/min,t＝7.96min,98.7％；IR(KBr,cm-1)3394,2980,2364,1668,1624,1531,1427,1334,1220,851,761；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.92,△H(G)＝2.90；HRMS(ESI)659.2507for[M+2H]+(calcd 659.2492for C33H36N8O5Cl).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅱb。
实施例14：N-{5-硝基-4-氨基-(苯甲酰对氯苯胺)-嘧啶-2}-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-5-硝基-4-氨基-(苯甲酰对氯苯胺)-嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黄色固体，收率:65％。
m.p.:275-277℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝75:25,0.8mL/min,t＝9.80min,97.7％；IR(KBr,cm-1)3401,2980,2379,1609,1536,1504,1414,1329,1210,853,788；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.94,△H(G)＝2.92；HRMS(ESI)659.2495for[M+2H]+(calcd 659.2492for C33H36N8O5Cl).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅱc。
实施例15：N-{5-氟-4-氨基-(苯甲酰邻氯苯胺)-嘧啶-2}-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制备
操作过程与实施案例3同，只是用2-氯-5-氟-4-氨基-(苯甲酰邻氯苯胺)-嘧啶代替2-氯-4-邻氯苯胺-5-硝基嘧啶，得白色固体，收率:51％。
m.p.:213-215℃；HPLC:MeOH:H2O(0.1％TFA)＝60:40,0.8mL/min,t＝21.46min,95.6％；IR(KBr,cm-1)3424,2962,2925,2850,1614,1594,1509,1424,1322,1232,1182,848,759；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.97；HRMS(ESI)632.2542for[M+2H]+(calcd632.2547for C33H36N7O3FCl).
进行后述对细胞增殖抑制实验中，本实施例样品编号为Ⅱd。
实施例16：稳定氮氧自由基标记的2,4-二胺基嘧啶类化合物对癌细胞的体外细胞毒活性
为了研究本次实验中所合成的目标化合物抑制肿瘤细胞增殖的能力，我们测定了化合物对四种人类肿瘤细胞(人宫颈癌细胞HeLa、人非小细胞肺癌细胞A-549、人肝癌细胞HepG2和人结肠癌细胞LoVo)的体外细胞毒活性，并以VX-680作为阳性对照。实验采用的检测方法是标准的MTT法。实验方法为：
取对数生长期的细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基制成细胞悬液，每孔6000个细胞接种到96孔板中，平板放入37℃，含5％CO2空气及100％湿度的孵育箱培养24h使其贴壁，后置换含有不同浓度药物的含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(200μL/孔)，药物浓度分别为10-4，2×10-5，4×10-6，8×10-7，1.6×10-7,3.2×10-8mol/L，并设调零孔，空白组，阳性对照组VP-16，每组三复孔，孵育培养48小时后取出，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，再孵育培养4h，使MTT还原为甲臢，吸出上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡使甲臢晶体溶解，用酶标仪测量细胞液在570nm处的OD值，计算化合物各浓度的抑制率。由抑制率计算IC50值，并取三次试验的平均值。
化合物Ⅰa–i、Ⅱa–d对人宫颈癌细胞HeLa、人非小细胞肺癌细胞A-549、人肝癌细胞HepG2和人结肠癌细胞LoVo四种癌细胞增殖抑制的体外药理试验结果见表1。
表1化合物Ⅰa–i、Ⅱa–b及VX-680的细胞毒性(IC50,μM)
注：(1)实验结果是三次平行实验的统计结果；(2)作用时间：48小时
体外实验证明，合成的13个化合物对HeLa、A-549、HepG2和LoVo都比阳性对照VX-680有较好的体外抑制活性；尤其是化合物Ⅱd对这四种癌细胞都表现出最高的抑制活性。
实施例16：化合物Ⅰg和Ⅱd对激光激酶A的选择性抑制活性
激光激酶(Aurora kinase)在中心体复制、两极纺锤体形成、染色体重排和染色体检查点监测等重要的有丝分裂过程中发挥着至关重要的作用。Aurora激酶在多种癌细胞中过度表达，且与染色体的不稳定性、癌变、肿瘤增殖和化学抗性等过程密切相关，是目前抗癌药物研究的重要靶标之一。为了研究化合物Ⅰg和Ⅱd抗肿瘤增殖作用的机理，同时为了探索其是否可以像其他嘧啶类抑制剂一样抑制肿瘤细胞内Aurora激酶的表达，我们采用酶联免疫吸附实验(ELISA)试验对HepG2细胞中Aurora激酶的抑制活性进行了研究。
具体方法：取处于对数生长期的HepG2细胞置于微量滴定板中，向每个孔中加入不同浓度梯度的药物，每孔10μL样品，40μL的样品稀释液，空白孔只加样品，稀释液置于37℃恒温箱，孵育30min，然后用洗涤液洗涤5次，拍干后，加酶标抗体，每孔50μL(空白孔不加)再置于37℃恒温箱孵育30min。最后向每个孔中加50μL TMB底物液，37℃恒温箱孵育15～30min，取出后向每孔中加入终止液来终止反应。之后细胞消化离心，然后PBS缓冲 液重悬，反复冻融3次，在2000～3000r/min离心20～30min，吸取上清液在450nm处检测OD值。并由此计算化合物的抑制率和IC50值，并取三次试验的平均值。
实验结果见表2。
表2化合物Ⅰg和Ⅱd对激光激酶A和B的抑制活性
注：(1)实验结果是三次平行实验的统计结果；
由表2可见，化合物Ⅰg和Ⅱd对Aurora A的抑制活性比VX 680更强，分别为VX 680的20倍和32倍。同时，化合物Ⅰg和Ⅱd对Aurora A比Aurora B具有更加显著的抑制活性，其中化合物Ⅰg对Aurora A的作用是对Aurora B的11倍，Ⅱd对Aurora A的作用是对Aurora B的67倍，而VX 680对Aurora A和Aurora B没有选择性。
该类化合物合成方法简单，原料廉价易得，药理活性显著，有望成为拥有我国自主知识产权的一类治疗癌症的新型药物。
对比例
疗效对比
一类新型抗肿瘤活性化合物，它们与VX-680对比，发明的化合物Ⅱb对人宫颈癌细胞HeLa、人非小细胞肺癌细胞A-549、人肝癌细胞HepG2和人结肠癌细胞LoVo四种肿瘤细胞生长抑制活性均强于VX-680。其中化合物Ⅱd对HeLa、A-549、HepG2和LoVo四种癌细胞的抑制活性分别是VX-680的38、32、44和6倍。同时化合物Ⅰg和Ⅱd对Aurora A的抑制活性分别为VX 680的20倍和32倍。